劉慧，李博

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

據(jù)2017年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，全球每年有1770萬(wàn)人死于心血管疾病，約占全球死亡總數(shù)的31.5%[1]，《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》指出，我國(guó)心血管病患病率處于持續(xù)上升階段，占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，推算心血管疾病患病人數(shù)約2.9億，其中冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病1 100萬(wàn)[2]。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性血管炎癥疾病，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多因素、多細(xì)胞參與的過(guò)程，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、單核細(xì)胞浸潤(rùn)、血管炎癥、泡沫細(xì)胞形成、血管平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)增殖和遷移及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[3]。AS是引起血栓、周圍血管疾病、冠心病、中風(fēng)、腦梗死等心血管疾病的主要原因[4]，因而在AS階段的預(yù)防干預(yù)顯得尤為重要。目前，阿司匹林和他汀類藥物等被視作預(yù)防AS的有效方法。但是已有臨床報(bào)告顯示，對(duì)于尚未出現(xiàn)心血管疾病的人來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)期服用上述藥物對(duì)疾病的抑制作用不足以抵消其帶來(lái)的副作用，如大出血、肌痛等[5-6]。因此，亟需更安全有效、可長(zhǎng)期服用的天然功能活性物質(zhì)應(yīng)用于AS的一級(jí)或二級(jí)預(yù)防。本文就近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的多種天然蛋白質(zhì)酶解物預(yù)防AS的體內(nèi)外研究進(jìn)行綜述，并提出了現(xiàn)有研究中仍待解決的問(wèn)題，以期為蛋白質(zhì)酶解物的進(jìn)一步研究及其作為膳食補(bǔ)充劑促進(jìn)健康、減少心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)提供有益借鑒。

1 AS的發(fā)病機(jī)制

AS是一種慢性血管炎癥疾病，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、單核巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞、SMC增殖和遷移、脂質(zhì)斑塊破裂等一系列生理過(guò)程[3]。到目前為止，AS的發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚，涉及多種危險(xiǎn)因素，存在多種病理學(xué)說(shuō)，其中常見的學(xué)說(shuō)有脂質(zhì)代謝紊亂學(xué)說(shuō)、氧化損傷學(xué)說(shuō)、內(nèi)皮損傷學(xué)說(shuō)、炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)、血栓形成學(xué)說(shuō)等。高脂血癥是AS的重要危險(xiǎn)因素，總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)濃度過(guò)高會(huì)使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，血管內(nèi)膜下聚集沉淀脂質(zhì)，是導(dǎo)致AS的主要誘因之一。而活性氧(reacti e oxygen species，ROS)的異常增加導(dǎo)致氧化型低密度脂蛋白(oxidized LDL，ox-LDL)的產(chǎn)生，ox-LDL也會(huì)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷并誘發(fā)巨噬細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，同時(shí)經(jīng)清道夫受體不斷進(jìn)入巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成；促進(jìn)血管SMC不斷增殖并向外遷移，在血管內(nèi)壁形成斑塊[7]?？梢钥闯觯瑑?nèi)皮功能受損也是AS發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。內(nèi)皮損傷學(xué)說(shuō)認(rèn)為多種有害刺激引起內(nèi)皮損傷，使之分泌趨化因子，如血管細(xì)胞黏附分子-1( ascular cell adhesion molecule-1， CAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等，并吸引單核細(xì)胞黏附于內(nèi)皮[8]。單核細(xì)胞遷入內(nèi)皮下間隙，隨后分化為巨噬細(xì)胞，攝取脂質(zhì)，形成脂質(zhì)條紋。同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡與脫落促使血液中血小板大量黏附與聚集[9]。功能紊亂的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血小板分泌產(chǎn)生大量生長(zhǎng)因子和多種血管活性物質(zhì)，刺激中膜SMC不斷增生并進(jìn)入內(nèi)膜，使血管損傷處血管壁增厚。這種損傷應(yīng)答本身也是一種炎癥反應(yīng)，近年來(lái)炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)被越來(lái)越多的學(xué)者重視和認(rèn)同，炎癥反應(yīng)貫穿AS的起始、發(fā)展以至動(dòng)脈斑塊的破裂，是多種AS致病機(jī)制的共同環(huán)節(jié)或通路。內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、SMC等均會(huì)產(chǎn)生炎癥因子，如白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，這些炎癥因子又會(huì)進(jìn)一步刺激細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、蛋白酶的釋放以及T細(xì)胞的活化增殖，加快AS的病變進(jìn)展[8-9]。SMC還產(chǎn)生間質(zhì)膠原和彈性蛋白等，并形成覆蓋斑塊的纖維帽。纖維帽使脂質(zhì)池穩(wěn)定，但由于一系列蛋白酶的活性表達(dá)及炎癥因子的作用，如基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)的釋放，細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度降解，導(dǎo)致斑塊破裂[8]，增加發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化血栓的風(fēng)險(xiǎn)。

根據(jù)AS的不同病理學(xué)說(shuō)，研究者分別從降膽固醇、抗氧化、防止內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抗炎以及抑制SMC增殖遷移等方面研發(fā)延緩AS的膳食補(bǔ)充劑。近年來(lái)，科研人員從蛋白質(zhì)酶解物中分離、鑒定了抗氧化肽、抗炎肽、降膽固醇肽、抗血小板肽等多種活性肽，這些活性肽均能在AS的不同進(jìn)展階段起到抑制效果[10]，因此與其他食源性成分相比，蛋白質(zhì)酶解物在預(yù)防AS方面可能具有更大的優(yōu)勢(shì)。許多研究者基于細(xì)胞和動(dòng)物模型，進(jìn)行了蛋白質(zhì)酶解物預(yù)防AS的研究,研究方向如圖1所示。

2 基于不同細(xì)胞模型的研究

2.1 抗氧化及抑制泡沫細(xì)胞形成

在AS的初發(fā)階段，ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵影響因素，涉及LDL氧化對(duì)巨噬細(xì)胞的一系列病變及血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷。ox-LDL不受控制的被巨噬細(xì)胞攝取，過(guò)量的膽固醇酯化和膽固醇外排減少導(dǎo)致胞內(nèi)膽固醇酯(cholesteryl ester，CE)積累隨后引發(fā)泡沫細(xì)胞的形成[7]，這也是早期AS病變的主要標(biāo)志。因此，研究常用ox-LDL誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)酶解物調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇代謝、抑制泡沫細(xì)胞形成的功效[7,11]，還通過(guò)檢測(cè)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)生物標(biāo)志物的表達(dá)，如ROS、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等，來(lái)判斷蛋白質(zhì)酶解的抗氧化作用。

圖1 蛋白質(zhì)酶解物預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化研究方向圖Fig.1 The research direction of protein hydrolysate to pre ent atherosclerosis

研究除以油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞泡沫化形態(tài)學(xué)變化外，還以CE/TC>50%定量判斷細(xì)胞泡沫化。劉東澤[11]以80 μg/mL ox-LDL誘導(dǎo)了泡沫細(xì)胞(胞內(nèi)CE/TC為62.12%)，通過(guò)胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解制備水蛭酶解物，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)給藥濃度為150 μg/mL時(shí)，胞內(nèi)CE/TC降至42.86%，并表現(xiàn)出劑量依賴性，由此可知水蛭酶解物具有抑制泡沫細(xì)胞形成的作用，但其在藥效強(qiáng)度方面不如陽(yáng)性對(duì)照辛伐他汀(胞內(nèi)CE/TC降至29.63%)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，水蛭酶解物正向反饋調(diào)節(jié)胞內(nèi)膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶A1(cholesterol acyltransferase A1，ACAT1)上調(diào)，其抑制泡沫細(xì)胞形成的機(jī)制是依賴于自噬過(guò)程，與促進(jìn)膽固醇外排作用無(wú)關(guān)。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)水蛭酶解物可以減弱ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞核內(nèi)DNA氧化斷裂，具有一定的抗氧化作用[11]。類似的，中國(guó)林蛙皮膚抗菌肽F DLKKIANIINSIFGK及其衍生肽F KLKKIANIINSIFKK、F KLKKILNIINSIFKK也被證實(shí)可以降低100 μg/mL ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞中TC、CE含量，作用機(jī)制是通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞攝入膽固醇的主要受體CD36，從而抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化，也與促進(jìn)膽固醇外排作用無(wú)關(guān)[7]。

不同蛋白質(zhì)酶解物之間的抗氧化或抑制泡沫細(xì)胞形成作用存在差異。如霍艷姣[12]建立了巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)LDL氧化模型，發(fā)現(xiàn)不同電荷性質(zhì)的酪蛋白抗氧化肽組分均可減少細(xì)胞中MDA的生成量，抑制LDL氧化，但堿性組分比酸性組分表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制效果。巨噬細(xì)胞從開始吞噬脂質(zhì)到形成泡沫細(xì)胞之前，通常認(rèn)為是荷脂細(xì)胞，酪蛋白抗氧化肽組分還能顯著減少ox-LDL誘導(dǎo)的荷脂細(xì)胞內(nèi)TC、TG、游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)含量，并且隨著正電荷的增加，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制泡沫細(xì)胞形成作用[12]。還有研究表明，多肽的抗氧化活性取決于其分子量，1～3 kDa的多肽具有最高的抗氧化活性[13-14]；同時(shí)，不同蛋白水解酶的酶解作用會(huì)導(dǎo)致不同肽序列的形成，影響蛋白質(zhì)酶解物的抗氧化活性[15]。

另外，據(jù)報(bào)道，內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)在保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮重要作用，血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)的上調(diào)就是其中一種內(nèi)在防御機(jī)制，目前此類研究也較少。多肽Lunasin是一種大豆來(lái)源的含43個(gè)氨基酸的肽，GU等[16]首次發(fā)現(xiàn)Lunasin可通過(guò)激活PI3K/Akt/Nrf2/ARE途徑來(lái)刺激HO-1的表達(dá)，從而減少H2O2誘導(dǎo)的EA.hy 926內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，減輕內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷。

2.2 防止內(nèi)皮細(xì)胞損傷

內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙是AS病變過(guò)程中的一個(gè)重要特征，主要特征表現(xiàn)為NO釋放量和生物利用度降低，黏附因子和趨化因子的表達(dá)增加等[17]。目前，內(nèi)皮損傷模型的細(xì)胞常用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical ein endothelial cells,HU ECs)及其細(xì)胞株EA.hy926[17-19]，也有研究直接提取培養(yǎng)了SD大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞[20]。在內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-α?xí)せ頝F-αB信號(hào)通路，引起NO表達(dá)量減少， CAM-1和ICAM-1的表達(dá)量增加[21]，因此，常以TNF-α為誘導(dǎo)因子，建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。趙欣[17]通過(guò)胰蛋白酶酶解制備了水蛭酶解物，發(fā)現(xiàn)其在200 μg/mL時(shí)對(duì)10 ng/mL TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926具有保護(hù)作用，作用機(jī)制為通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路，使細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS) mRNA表達(dá)上調(diào)，ICAM-1、MCP-1的蛋白和mRNA的表達(dá)下降。WANG等[22]也發(fā)現(xiàn)一種直接購(gòu)買的水蛭酶解物可通過(guò)阻斷NF-κB亞基p65轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞中ICAM-1和MCP-1的表達(dá)。另外，由于單核細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞是必不可少的AS的發(fā)展過(guò)程，有研究利用THP-1和U 937兩個(gè)模型探究了蛋白質(zhì)酶解物對(duì)細(xì)胞間黏附的影響。LIANG等[18]發(fā)現(xiàn)玉米蛋白水解物可以抑制EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-1、 CAM-1的表達(dá)，并通過(guò)熒光染色法觀察到玉米蛋白水解物的添加顯著降低了U 937單核細(xì)胞對(duì)EA.hy926細(xì)胞的黏附力。類似的，水蛭酶解物也被證實(shí)可以抑制THP-1單核細(xì)胞對(duì)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞遷移、黏附率[17,22]。

2.3 抗炎

巨噬細(xì)胞是最早侵入AS病變的炎性細(xì)胞，它們也是AS斑塊的主要成分。由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α等，可進(jìn)一步推動(dòng)AS病變；同時(shí)，巨噬細(xì)胞還分泌抗炎細(xì)胞因子，如IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等，可促進(jìn)AS晚期斑塊的穩(wěn)定性[8]。巨噬細(xì)胞對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激具有高度的敏感性，LPS會(huì)誘導(dǎo)炎癥基因表達(dá)和釋放一些與AS發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物[23]，因此，研究常用LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型探究蛋白質(zhì)酶解物的抗炎效果。常用的巨噬細(xì)胞有THP-1、U 937、RAW 264.7[24]，其中RAW 264.7來(lái)源廣泛、性質(zhì)穩(wěn)定、貼壁易養(yǎng)，廣泛應(yīng)用于炎癥研究中。

目前，關(guān)于蛋白質(zhì)酶解物抗炎作用的研究相對(duì)較多，不同的蛋白質(zhì)酶解物，甚至同一種蛋白質(zhì)不同處理方式得到的酶解物，其功效也有差異。蛋白酶的種類、多肽氨基酸組成、分子量大小以及極性等均會(huì)影響酶解物的功效。CHENG等[25]用堿性蛋白酶和風(fēng)味酶分別酶解煮熟的金槍魚湯汁，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解物的抗炎效果更佳。陳月華[26]利用胰蛋白酶水解大米蛋白，對(duì)抗炎活性最高的RPHs-C組分再進(jìn)一步通過(guò)離子交換色譜，對(duì)比發(fā)現(xiàn)獲得的5個(gè)組分抗炎活性均有差異。KIM等[27]獲得了分子量分別為<1 kDa、1～5 kDa和>5 kDa的貽貝水解物肽段，通過(guò)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)它們的NO抑制活性分別為72.66%、70.12%和92.35%，且抑制效果均比未處理的貽貝水解物好。用>5 kDa的組分進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其可使炎性巨噬細(xì)胞中前列腺素E2、TNF-α、IL-1β及IL-6水平降低，誘導(dǎo)型-氧化氮合酶(induced NOS,iNOS)、環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)蛋白和mRNA的表達(dá)下調(diào)，從而發(fā)揮抗炎作用。Lunasin[28]和小麥谷蛋白水解物[29]也被證實(shí)可以降低這些炎癥因子的表達(dá)，具有類似的抗炎功效。

當(dāng)前，大多數(shù)研究?jī)H證實(shí)了蛋白質(zhì)酶解物可調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路中蛋白的表達(dá)而達(dá)到抗炎效果，如通過(guò)抑制了IκBα的降解、p65的核移位進(jìn)而抑制NF-κB，有效地降低巨噬細(xì)胞炎癥過(guò)程；或通過(guò)抑制了JNK、ERK、p38 MAPK的磷酸化，降低IL-6等炎癥因子的水平而發(fā)揮了抗炎功效[27-31]。但完整分子機(jī)制的研究仍處于初步探索階段，僅有少數(shù)研究明確了蛋白質(zhì)酶解物的具體活性成分，合成了活性肽，并進(jìn)一步研究了活性肽抗炎的分子信號(hào)通路。JONES等[32]從苦瓜種子中分離出的一種純肽BG-4，與LPS單獨(dú)處理組相比，用BG-4和LPS聯(lián)合處理THP-1巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子減少，胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生減少，p65的核易位被抑制，ERK1/2 MAPK和STAT3磷酸化降低，表明BG-4是通過(guò)STAT3/MAPK/NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮抗炎作用及其分子調(diào)控機(jī)制。LIANG等[33]通過(guò)CO-IP及Pulldown實(shí)驗(yàn)證實(shí)水稻八肽KHNRGDEF在HU EC的作用靶點(diǎn)為TLR4，通過(guò)改變TLR4的結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)節(jié)下游TRIF和IKKβ的蛋白水平降低p65的磷酸化，抑制NF-κB活化，從而影響caspase-3的釋放，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)HU EC免受H2O2引起的氧化損傷和炎癥反應(yīng)。

2.4 抑制SMC增殖

SMC主要參與AS后期病變中，常通過(guò)人、兔主動(dòng)脈SMC模型評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)酶解物對(duì)SMC增殖遷移的影響，總體上關(guān)于此方面的研究較少。水蛭素是從中藥水蛭中提取的活性多肽，有研究表明，水蛭素可以抑制血管SMC增殖。李紅梅等[34]直接將水蛭素作用于體外培養(yǎng)的人冠狀動(dòng)脈SMC，通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況，發(fā)現(xiàn)6.25 mg/mL水蛭素對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生較明顯的抑制作用，抑制率達(dá)44.6%。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet deri ed growth factor，PDGF)對(duì)SMC增殖的調(diào)控起關(guān)鍵作用，當(dāng)兩者表達(dá)被抑制時(shí)，能夠有效降低增生內(nèi)膜的厚度[35-36]，故常作為SMC增殖的生物標(biāo)志物。凝血酶可使SMC進(jìn)入增殖期的細(xì)胞數(shù)明顯增多，而水蛭素已被證實(shí)可以通過(guò)抑制PDGF和PCNA的表達(dá)而抑制凝血酶誘導(dǎo)的SMC增殖[19]。

2.5 蛋白質(zhì)酶解物的多重抑制作用

已有研究分離、純化并鑒定了蛋白質(zhì)酶解物中的部分活性肽序列，并證實(shí)了單一活性肽也具有多重生物活性(表1)。MONTOYA等[37]發(fā)現(xiàn)莧菜蛋白經(jīng)體外胃蛋白酶、胰酶模擬消化后的3條肽段均具有抗氧化、抗炎、抑制細(xì)胞間黏附反應(yīng)的多重功效。其中，肽HGSEPFGPR的IC50值最低，與凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor 1，LOX-1)晶體結(jié)構(gòu)的相互作用更好，對(duì)相關(guān)生物標(biāo)志物的抑制效果也最好。但是3種多肽聯(lián)合應(yīng)用的效果并不優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用，這也提示了活性肽的生物活性優(yōu)于肽組分。類似的，50 μg/mL的GEQQQQPGM、50 μg/mL的YYGGEGSSSEQG、25 μg/mL的SESEM也被證實(shí)具有抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功效，從而表現(xiàn)出預(yù)防AS的潛力。它們的物質(zhì)的量濃度相似，這可能解釋了它們具有相似的活性[31,38]。

表1 活性肽基于細(xì)胞模型的多重抑制作用Table 1 Multiple inhibition of bioacti e peptides based on cell model

縱覽已有研究，大部分蛋白質(zhì)酶解物成分不明確、分子量較大，它們?cè)隗w內(nèi)具有不穩(wěn)定性或半衰期較短，生物利用率及能否以完整形式吸收仍然未知，是否在吸收過(guò)程經(jīng)肽酶等水解釋放了活性更高的物質(zhì)也待證實(shí)。針對(duì)已明確活性成分的蛋白質(zhì)酶解物，其活性肽在細(xì)胞中發(fā)揮作用的靶點(diǎn)和分子信號(hào)通路也需要深入研究。同時(shí)，具有降膽固醇、抗氧化、防止內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抗炎或抑制SMC增殖作用的蛋白質(zhì)酶解物，表現(xiàn)出了預(yù)防AS的潛力，但其對(duì)AS的有效抑制作用仍需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究來(lái)闡明。

3 基于動(dòng)物模型的功效評(píng)價(jià)

除臨床試驗(yàn)外，動(dòng)物模型是用來(lái)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)酶解物體內(nèi)功效最直觀的手段。已有許多研究在前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)驗(yàn)證了蛋白質(zhì)酶解物表現(xiàn)出的預(yù)防AS的能力。如WANG等[22]發(fā)現(xiàn)購(gòu)得的水蛭酶解物在體外具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的生物活性，也可以減少ApoE-/-小鼠的AS斑塊，綜合細(xì)胞和動(dòng)物模型，驗(yàn)證了該水蛭酶解物具有抑制AS的功效。TANG等[40]前期研究發(fā)現(xiàn)膠原酶型蛋白酶消化豬皮膚I型膠原得到的膠原三肽(collagen tripeptide,Ctp)片段通過(guò)下調(diào)PCNA表達(dá),抑制了體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈SMCs的增殖和遷移，且減少Ctp組AS病變中HHF35陽(yáng)性SMCs的數(shù)量，可能對(duì)AS具有調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步驗(yàn)證表明，Ctp可顯著降低高膽固醇血癥家兔的主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積和血清TC水平，進(jìn)而抑制炎癥過(guò)程，包括抑制巨噬細(xì)胞和SMCs的增殖，減少ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，可穩(wěn)定AS斑塊[41]。Lunasin也被證實(shí)在高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠中可以有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化損傷，抑制AS斑塊的發(fā)展[16]?？梢钥闯觯鞍踪|(zhì)酶解物在動(dòng)物體內(nèi)的功效更傾向于對(duì)AS的多重抑制作用，而不僅局限于其在細(xì)胞模型中表現(xiàn)出的單一抑制作用。

動(dòng)物模型的功效評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括模型的疾病表型及生物標(biāo)志物變化。動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(atherogenic index，AI)由總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol, HDL-C)計(jì)算得來(lái)，AI=[(TC-HDL-C)/HDL-C]是國(guó)際公認(rèn)的動(dòng)脈粥樣硬化指標(biāo)，它的正常數(shù)值<4，數(shù)值越小動(dòng)脈硬化的程度就越輕，引發(fā)心腦血管病的危險(xiǎn)性就越低；如果AI≥4就說(shuō)明已經(jīng)發(fā)生了動(dòng)脈硬化，數(shù)值越大動(dòng)脈硬化的程度就越重，發(fā)生心腦血管病的危險(xiǎn)性就越高[42]。許多研究通過(guò)動(dòng)物模型的AI值來(lái)判斷模型是否產(chǎn)生AS病變及蛋白質(zhì)酶解物在體內(nèi)的抗AS作用效果，作為AS早期預(yù)防的參考。另外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主動(dòng)脈內(nèi)出現(xiàn)明顯的斑塊也可作為判斷AS建模成功的重要病理表型，通過(guò)蛋白質(zhì)酶解物作用前后斑塊面積大小的改變來(lái)初步評(píng)價(jià)其作用效果。由于AS復(fù)雜、多因素的形成過(guò)程，脂質(zhì)積累、細(xì)胞間黏附、炎癥、氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮保護(hù)等因素也形成了一系列生物標(biāo)志物，如TC、 CAM-1、IL-6、MDA、iNOS等，對(duì)蛋白質(zhì)酶解物預(yù)防AS功效評(píng)價(jià)，即通過(guò)生物標(biāo)志物的上調(diào)或下調(diào)來(lái)判斷其是否具有良好效果，這也與基于細(xì)胞模型的研究相符。

近年來(lái)，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇方面，SD大鼠、Wistar大鼠及C57BL/6 ApoE-/-小鼠最為常用。隨著AS發(fā)病機(jī)制的深入研究，AS動(dòng)物模型的構(gòu)建也已從單純高脂飼料喂養(yǎng)法發(fā)展為混合飼料喂養(yǎng)法、炎癥免疫法、內(nèi)皮損傷法、血液流變學(xué)法及基因工程法等多種造模方法。高脂飼料喂養(yǎng)法及基因工程法具備造模時(shí)間短、造模簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，成為建立高效、簡(jiǎn)便、理想的AS動(dòng)物模型常用方法[43]。

3.1 基于高脂飼料喂養(yǎng)法建立的AS動(dòng)物模型

脂質(zhì)沉積是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，高脂狀態(tài)的建立是復(fù)制AS模型的基礎(chǔ)。表2匯總了近年來(lái)多種蛋白質(zhì)酶解物在高脂飼料法建立的AS動(dòng)物模型體內(nèi)的預(yù)防AS功效的研究。其中，燕麥多肽展示出較優(yōu)的抑制AS功效[44]。還有研究通過(guò)設(shè)置陽(yáng)性藥物對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)了效果與一定劑量藥物相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)酶解物。如龔吉軍等[42]發(fā)現(xiàn)油茶粕多肽高劑量組(1 000 mg/kg BW)和降脂藥物組(辛伐他汀片0.30 mg/kg BW)的AI值沒(méi)有顯著差異；WANG等[22]發(fā)現(xiàn)高劑量水蛭酶解物[0.5 g/(kg·g)]可以顯著減少9.29%的AS斑塊面積，這與陽(yáng)性對(duì)照辛伐他汀組[10 mg/(kg·g)]減少11.6%的效果相近。但是在AS動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，目前關(guān)于蛋白質(zhì)酶解物與預(yù)防類藥物的功效多集中于降血脂藥物，未來(lái)仍需進(jìn)一步探究其與其他預(yù)防類藥物效果的異同，如抗血栓藥物阿司匹林等。同時(shí)，還需要根據(jù)蛋白質(zhì)酶解物在實(shí)際應(yīng)用時(shí)人體服用的劑量來(lái)合理優(yōu)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的灌胃劑量。

另外，有研究證實(shí)了蛋白質(zhì)酶解物預(yù)防AS的功效可能優(yōu)于蛋白質(zhì)本身。如油茶粕蛋白也具有一定的降A(chǔ)I效果，雖然效果不如油茶粕多肽高劑量組，但與中劑量組相比沒(méi)有明顯差異[42]；類似的，TONG等發(fā)現(xiàn)水稻α-球蛋白經(jīng)消化吸收后的功能性肽片段功效優(yōu)于相同劑量的水稻α-球蛋白[31,45]。

表2 蛋白質(zhì)酶解物基于動(dòng)物模型(高脂飼料喂養(yǎng)法)的預(yù)防AS功效評(píng)價(jià)Table 2 E aluation of the efficacy of protein hydrolysates on pre ention of AS based on animal model(high fat feed method)

3.2 基于基因工程法建立的AS動(dòng)物模型

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，有研究者[49]用基因改良的小鼠分別對(duì)炎癥、高血壓、蛋白酶、細(xì)胞外基質(zhì)、糖代謝及免疫系統(tǒng)等相關(guān)的基因進(jìn)行敲除或者過(guò)度表達(dá)，如以ApoE-/-小鼠、LDLR-/-小鼠、MCPI-1-/-小鼠作為動(dòng)物對(duì)象，結(jié)合高脂飲食加快建模。已有研究明確了蛋白質(zhì)酶解物中的活性成分，通過(guò)給予ApoE-/-小鼠合成的活性肽，探究了活性肽在體內(nèi)預(yù)防AS的功效(表3)。研究發(fā)現(xiàn)，活性肽也可以從抗炎、降血脂、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抗氧化等多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮作用，從而抑制ApoE-/-小鼠的AS病變。雖然如前文所述，有研究顯示純肽的功效優(yōu)于蛋白質(zhì)酶解物組分，但是NAKAMURA等[50]分別灌胃給予ApoE-/-小鼠含有 PP和IPP的發(fā)酵乳、含有 PP和IPP的酪蛋白水解產(chǎn)物、合成的 PP和IPP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4組小鼠主動(dòng)脈斑塊面積的減少程度相差不大，而低劑量的合成的 PP、IPP組甚至與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異[50]。這可能是由于發(fā)酵乳和酪蛋白水解物中含有多種多肽和氨基酸，包括了其他未知活性成分。另外，考慮到合成的活性肽是非天然產(chǎn)物，需以藥物的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行全面的安全評(píng)價(jià)，在實(shí)際應(yīng)用中仍提倡以蛋白質(zhì)酶解物作為膳食補(bǔ)充劑。

表3 純肽基于動(dòng)物模型(基因工程法)的預(yù)防AS功效評(píng)價(jià)Table 3 E aluation of the efficacy of pure peptide on pre ention of AS based on animal model(genetic engineering method)

值得注意的是，由于不同的AS模型具有不同的生物學(xué)特性，應(yīng)根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模方法。如TONG等[45]發(fā)現(xiàn)水稻α-球蛋白(100 mg/kg BW)可促進(jìn)高膽固醇飲食喂養(yǎng)的SD大鼠糞便中中性固醇的排泄，表明水稻α-球蛋白通過(guò)抑制膽固醇在腸道中的吸收來(lái)降低大鼠的血清膽固醇濃度。然而，以同樣劑量灌胃雄性ApoE-/-小鼠時(shí)，水稻α-球蛋白雖然顯著減少了AS斑塊區(qū)域，但不能顯著降低血液膽固醇濃度，推測(cè)ApoE參與了水稻α-球蛋白的降膽固醇過(guò)程。因此，TONG等[31]在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)水稻α-球蛋白抑制ApoE-/-小鼠AS病變是通過(guò)抗氧化、抗炎途徑，并非是調(diào)節(jié)了膽固醇代謝。

綜上，由蛋白質(zhì)酶解物基于動(dòng)物模型預(yù)防AS的功效評(píng)價(jià)可知，蛋白質(zhì)酶解物具有調(diào)節(jié)血清膽固醇濃度、改善氧化應(yīng)激、抑制促炎細(xì)胞因子的釋放和相關(guān)蛋白的表達(dá)、改善NO系統(tǒng)相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙及調(diào)節(jié)免疫等多種功能，可作用于多靶點(diǎn)以發(fā)揮其復(fù)雜多效的預(yù)防AS作用,同時(shí)營(yíng)養(yǎng)、安全無(wú)毒副作用，有開發(fā)為預(yù)防AS的功能性食品的潛力。然而，蛋白質(zhì)酶解物在人體內(nèi)的穩(wěn)定性、生物利用度和功效等方面與細(xì)胞、動(dòng)物模型仍有較大差異，因此，在蛋白質(zhì)酶解物實(shí)際應(yīng)用之前，還需要進(jìn)行大量的臨床人體實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié)語(yǔ)及展望

AS所致心腦血管疾病在人類死亡總數(shù)所占比例逐漸增大，其防治方法已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前，科學(xué)家已做了大量的研究工作，取得了一定成效，證實(shí)了蛋白質(zhì)酶解物抑制AS病變的有益作用，但仍存在一些問(wèn)題亟需解決：

(1)目前的研究多集中于蛋白質(zhì)酶解物在降脂、抗炎、抗氧化、降血壓、降血糖等單一方向，而以AS動(dòng)物模型為基礎(chǔ)，探究蛋白質(zhì)酶解物多重預(yù)防作用的研究仍然較少。(2)雖然蛋白質(zhì)酶解物從細(xì)胞到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表現(xiàn)出良好的預(yù)防AS潛力，并且涉及多個(gè)機(jī)制，可針對(duì)AS的不同病理環(huán)節(jié)同時(shí)發(fā)揮作用，但目前對(duì)活性肽準(zhǔn)確的作用靶點(diǎn)及可能具有的多靶向作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。(3)目前，關(guān)于活性肽在巨噬細(xì)胞等AS相關(guān)細(xì)胞中發(fā)揮作用的下游MAPK及NF-κB信號(hào)通路的研究較成熟，而其上游作用靶點(diǎn)及完整的信號(hào)傳導(dǎo)仍需深入探究。(4)隨著AS發(fā)病機(jī)制的深入研究，有關(guān)表觀遺傳修飾如DNA甲基化、組蛋白修飾以及mi RNA等可作為生物標(biāo)志物，以更加全面的評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)酶解物及活性肽是否具有抗AS功效，為AS的預(yù)防提供新的策略和靶點(diǎn)。(5)許多研究并未分離、純化并鑒定具有預(yù)防AS功效活性肽的氨基酸序列，且相關(guān)活性肽的結(jié)構(gòu)特征和構(gòu)效關(guān)系還有待深入研究，這些研究將為AS預(yù)防食品或輔助藥物的開發(fā)應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。(6)目前，在具有預(yù)防AS功效的蛋白質(zhì)酶解物開發(fā)成商業(yè)產(chǎn)品前，還需較長(zhǎng)時(shí)間的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究，以保證其安全有效性。同時(shí)，此類蛋白質(zhì)酶解物的市場(chǎng)需求及產(chǎn)業(yè)化研究也有待進(jìn)行，為其常態(tài)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。對(duì)蛋白質(zhì)酶解物的深入研究，將有益于蛋白質(zhì)酶解物類膳食補(bǔ)充劑應(yīng)用于AS的一級(jí)或二級(jí)預(yù)防中，促進(jìn)人類健康。