瞿琳，艾連中，賴?guó)P羲，張匯

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海，200093)

豌豆(Pisumsati umL.)是世界第四大食用豆類作物，根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)[1]，2018年我國(guó)豌豆種植面積約為100.01萬(wàn)公頃，年產(chǎn)量約占全球產(chǎn)量的11.3%，位居世界第四[1]。豌豆在加工生產(chǎn)豌豆淀粉和豌豆蛋白的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生豌豆種皮(通稱為殼)廢棄物，如何提高豌豆種皮的應(yīng)用價(jià)值并減少加工廢棄物是產(chǎn)業(yè)界亟待解決的課題。豌豆種皮富含膳食纖維，包括纖維素(68.8%)、半纖維素(7.5%)以及果膠(16.8%)[2]，故開發(fā)豌豆種皮中的膳食纖維[3-4]、果膠[5-6]或高附加值的單糖(木糖、阿拉伯糖)[7]為可行的解決方案。

豌豆種皮的可溶性多糖組成相當(dāng)復(fù)雜，包括果膠和半纖維素[8]。LE等[9]依序以冷堿液、酸液加熱及中性溶液進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)6種多糖區(qū)分，其中堿提取多糖主要為聚阿拉伯糖和果膠(為第一型鼠李糖聚半乳糖醛酸RG-I)；酸提取物主要為不含阿拉伯糖的果膠和果膠酸；而中性溶液提取物為果膠酸。以酸液直接提取豌豆種皮的多糖以果膠為主，GUT?HRLEIN等[6]發(fā)現(xiàn)溫和酸液所得果膠含有同型聚半乳糖醛酸、木糖聚半乳糖醛酸以及RG-I；高酸高溫提取會(huì)提高產(chǎn)物的糖醛酸含量，但降低分子量和得率; 所得皆為低甲氧基果膠。采用乙二胺四乙酸加聚半乳糖醛酸酶和纖維素酶輔助提取時(shí)，14種商業(yè)豌豆種皮可提取的果膠得率為9%～12% (以半乳糖醛酸為指標(biāo))[5]。

然而，上述豌豆種皮多糖提取方法工藝復(fù)雜，成本高，高附加值的多糖(聚阿拉伯糖和聚木糖)易被酸降解而損失等。本研究針對(duì)豌豆種皮水溶性多糖進(jìn)行探討，建立熱水提取工藝的優(yōu)化條件,闡明提取動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及解析多糖產(chǎn)物的單糖組成與分子特性等。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

豌豆(Pisumsati umL.)種皮,山東煙臺(tái)鼎豐生物科技有限公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品—巖藻糖(Fuc)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、核糖(Rib)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖醛酸(GlcA),美國(guó)Sigma-Aldrich化學(xué)公司；間羥基聯(lián)苯,上海源葉生物科技有限公司；苯酚、濃硫酸、四硼酸鈉、三氟乙酸、硝酸鈉、醋酸鈉、NaOH,分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇,分析純，上海泰坦科技股份有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

725型紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；8400型凱氏定氮儀，美國(guó)FOSS有限公司；DionexTMICS-5000+離子交換色譜系統(tǒng)，美國(guó) Thermo ScientificTM公司；AligentTM1260高效分子篩色譜儀-多角度激光光散射(high performance size exclusion chromatography-multiangle laser-light scattering,HPSEC-MALLS)，美國(guó) Wyatt Technology 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豌豆種皮水溶性多糖提取物的制備

將豌豆皮烘干、粉碎后過(guò)篩，稱取20 g豌豆種皮粉末，以一定的液料比混合，在一定溫度下進(jìn)行一定時(shí)間提取。粗提取液經(jīng)6 000 r/min離心 10 min得上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶液至原體積的1/3～1/2，然后加入2倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，攪拌均勻于4 ℃下過(guò)夜靜置后，6 000 r/min離心10 min取下層沉淀物，由乙醇脫水2次后，真空干燥，制得豌豆皮水溶性多糖提取物。優(yōu)化條件下提取所得的多糖以PPW代號(hào)表示。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

以原料粒度80目、液料比25∶1 (mL∶g)、提取溫度90 ℃和提取時(shí)間1.5 h為中心條件，探討改變其中一個(gè)因素的影響，設(shè)計(jì)條件如下： 原料粒度 40、60、80、100及120篩目；液料比 15∶1、20∶1、25∶1、30∶1及35∶1 (mL∶g)；提取溫度80、85、90、95及100 ℃；提取時(shí)間0.5、1、1.5、2及2.5 h。以豌豆皮水溶性多糖提取物的得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取對(duì)提取物得率影響較大的3個(gè)因素(液料比、提取溫度及提取時(shí)間)作為自變量，采用3因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。其中中心條件(0,0,0)5平行，采用隨機(jī)順序進(jìn)行試驗(yàn)以減少實(shí)驗(yàn)環(huán)境的誤差。以豌豆皮水溶性多糖提取物的得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表1 豌豆種皮水溶性多糖提取條件的三因素與三水平Table 1 Three factors and three le els for extraction of water-soluble polysaccharides from Pisum sati um L.seed pericarp

1.2.4 提取動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

假設(shè)豌豆種皮粉粒呈球狀,多糖分子均勻地?cái)U(kuò)散溶出以及多糖從豌豆皮粉末材料內(nèi)部溶出速率的主要限制因子為擴(kuò)散速率，根據(jù)菲克(Fick)第二定律一級(jí)擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)模式，多糖溶出濃度和提取時(shí)間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系可用公式(1)[10]表示，其中Ct為提取時(shí)間t(min)時(shí)溶液中多糖的濃度；Ceq為長(zhǎng)時(shí)間下最終達(dá)平衡的最大多糖濃度；k1為一級(jí)擴(kuò)散速率常數(shù)(min-1)，類似聲波輔助提取韭菜多糖[11]、甘草多糖[12]和地木耳多糖[13]的情況。假設(shè)溶出的多糖大部分被乙醇沉淀收集得到，則公式(1)的多糖提取動(dòng)力學(xué)模型可以得率替代濃度，則可得到公式(2), 其中Yt為時(shí)間t(min)下的得率(%);Ym為最終平衡所得的最大得率(%)。公式(2)經(jīng)整理得公式(3)，其中(Ym-Yt)/Ym為相對(duì)提取率(Rext)。公式(3)經(jīng)倒數(shù)和對(duì)數(shù)處理得公式(4)，將ln[Ym/(Ym-Yt)]對(duì)時(shí)間t作圖，即得斜率k1(min-1)。則可求得半數(shù)提取時(shí)間(t1/2, min)如公式(5)所示。

Ct=Ceq×(1-exp-k1·t)

(1)

Yt=Ym×(1-exp-k1·t)

(2)

(Ym-Yt)/Ym=exp-k1·t

(3)

ln[Ym/(Ym-Yt)]=k1·t

(4)

t1/2=ln 2/k1

(5)

如果豌豆多糖的溶出提取受到多種因素影響，不是遵循理想的一級(jí)擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)模式，而是n級(jí)動(dòng)力學(xué)模式，類似海藻油的提取情況[14]，則可以公式(6)表示，其中dYt/dt為時(shí)間t(min)下的得率增加速率；kn為n-級(jí)提取速率常數(shù)；Yu為尚未溶出的可溶性多糖的得率。公式(6)取對(duì)數(shù)得公式(7)，ln (dYt/dt) 對(duì)lnYu作圖，可得斜率n及截距l(xiāng)nkn，kn單位為min-1。

(6)

ln(dYt/dt)=lnkn+n·lnYu

(7)

1.2.5 總糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[15]測(cè)定總糖含量。根據(jù)主要單糖組成決定混合糖標(biāo)準(zhǔn)品為M(阿拉伯糖)∶M(木糖)∶M(葡萄糖)∶M(半乳糖醛酸)的=1∶0.5∶0.6∶0.65。4種糖預(yù)先混合后，稱取10 mg混糖標(biāo)準(zhǔn)品，去離子水定容至10 mL容量瓶得標(biāo)準(zhǔn)液，并將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成質(zhì)量濃度為0.02～0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。配制10 mL 0.1 mg/mL PPW樣品溶液，經(jīng)80 ℃加熱15 min以完全溶解并冷卻。取標(biāo)準(zhǔn)液及樣品液各1 mL于試管中，加入0.5 mL 30 g/L苯酚溶液，混合均勻后迅速加入5 mL濃硫酸，振蕩混勻放入85 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，以混糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算后獲得回歸方程為Y=7.365X-0.003 8 (R2=0.999)。將樣品PPW的吸光度帶入回歸方程中，求出樣品中總糖質(zhì)量濃度，樣品中的多糖含量按公式(8)計(jì)算。

(8)

1.2.6 糖醛酸含量的測(cè)定

采用間羥基聯(lián)苯法[16]測(cè)定糖醛酸含量。配制10 mL 0.1 mg/mL的PPW樣品溶液，以及0.01～0.1 mg/mL半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各取1 mL于試管中，在冰水浴下加入6 mL四硼酸鈉/濃硫酸溶液，充分振蕩混合均勻，沸水浴10 min后取出，冷卻至室溫，加入0.1 mL 1.5 mg/mL間羥基聯(lián)苯溶液，反應(yīng)20 min后，測(cè)定在波長(zhǎng)525 nm下的吸收值并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=14.92X-0.020 4(R2=0.999)。將樣品PPW的吸光度帶入計(jì)算所得的回歸方程中，求出其中糖醛酸質(zhì)量濃度，樣品中糖醛酸含量按公式(9)計(jì)算。

(9)

1.2.7 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用凱氏定氮法[17]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。稱取2.000 g固體PPW樣品至消化管中，加入5粒催化粒后于消化爐中進(jìn)行消化。蛋白質(zhì)含量按公式(10)計(jì)算:

蛋白質(zhì)含量/%=氮含量×6.25

(10)

1.2.8 灰分含量的測(cè)定

采用GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》[18]。準(zhǔn)確稱量瓷坩堝質(zhì)量(m1)，反復(fù)灼燒至前后2次稱量相差不超過(guò)0.5 mg為恒重。稱取5.000 0 g樣品于瓷坩堝中，先在200 ℃下灼燒1 h，使樣品充分炭化至無(wú)煙，再在550 ℃下灼燒6 h后，冷卻至200 ℃取出，放入干燥器中冷卻30 min，準(zhǔn)確稱取其恒重(m2)。樣品中灰分的含量按公式(11)計(jì)算：

(11)

1.2.9 單糖組成測(cè)定

稱取10 mg多糖樣品于具塞試管中，加入2 mL去離子水，在80 ℃下加熱磁力攪拌30 min，使樣品充分溶解，再加入0.4 mol/L三氟乙酸溶液，密封后于110 ℃烘箱中反應(yīng)3 h，使其充分水解。取出冷卻至室溫后，用氮吹儀吹干，并反復(fù)3次加入甲醇至吹干，最后加入2 mL的超純水溶解水解物，稀釋20倍，經(jīng)0.22 μm微孔膜過(guò)濾后，進(jìn)行高效陰離子交換色譜分析。

采用Thermo ICS-5000+高效陰離子交換色譜串聯(lián)脈沖安培檢測(cè)器分析樣品的單糖組成。色譜柱:串連保護(hù)管柱(3 mm×30 mm)的CarboPacTMPA20(3 mm×150 mm);進(jìn)樣量25 μL；洗脫條件:20 mmol/L NaOH溶液 20 min，然后提高醋酸鈉濃度梯度50～200 mmol/L 10 min；流速0.5 mL/min；管柱溫度30 ℃。采用Chromeleon 7 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、處理和分析。經(jīng)對(duì)照9種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫尖峰和標(biāo)準(zhǔn)檢量線進(jìn)行樣品單糖組成的定性和定量分析。

1.2.10 分子質(zhì)量、分子粒徑與固有黏度的測(cè)定

多糖樣品用0.1 mol/L NaNO3溶液配制1 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔膜過(guò)濾后進(jìn)行高效體積排阻色譜(hight performance size exclusion chromatography，HPSEC)系統(tǒng)分析。色譜柱：OH-pak SB-805HQ (8.0 mm×300 mm)和OH-pak SB-803HQ (8.0 mm×300 mm)串聯(lián)；流動(dòng)相0.1 mol/L NaNO3溶液(含0.02% NaNO3)；流速0.6 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量100 μL。采用ASTRA 7.1.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、處理和分析。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin Pro 8.0軟件進(jìn)行繪圖與動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算。以SPSS statistics 17.0軟件對(duì)單因素試驗(yàn)提取結(jié)果進(jìn)行one-way ANO A顯著差異分析。以Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面的多項(xiàng)式模型分析、方差分析和繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素提取條件對(duì)豌豆種皮水溶性多糖得率的影響

圖1-a顯示隨著篩網(wǎng)目數(shù)從40目提高到80目時(shí)， 以90 ℃、1.5 h提取條件所得多糖得率由2.63%增加到4.32%(最高值)，提高目數(shù)到100～120目時(shí)無(wú)利于提高得率且輕微地降低得率，可能與粉體太細(xì)、黏附性太高導(dǎo)致得率降低[19]有關(guān)。由于通過(guò)40、60、80、100和120目的粉粒粒徑分別是0.38、0.25、0.18、0.15和0.12 mm，故知提取豌豆種皮多糖的最佳粉粒粒徑為0.18 mm。因此本研究選擇過(guò)80目的原料粒度進(jìn)行后續(xù)所有的多糖提取試驗(yàn)。圖1-b顯示，隨著液料比從15∶1增加到25∶1(mL∶g)時(shí)，以90 ℃、1.5 h提取的得率從2.35%增加到4.23%，達(dá)到最大值，而液料比30∶1～35∶1 (mL∶g)時(shí)得率沒(méi)有顯著增加或減少，說(shuō)明液料比增加有利于提高多糖的擴(kuò)散溶出率[20]，但多糖的溶出率有極限，過(guò)高的液料比對(duì)于多糖得率無(wú)顯著幫助，因此選擇液料比為25∶1進(jìn)行后續(xù)多糖提取。在提取溫度方面(圖1-c)，固定提取時(shí)間1.5 h下，隨著提取溫度從60 ℃升高到90 ℃，所得多糖提取物的得率從1.34%顯著上升到4.21%，達(dá)到最大值，故高溫促使多糖更易于溶出[21]，100 ℃的得率沒(méi)有顯著異于90 ℃，所以選擇提取溫度為90 ℃進(jìn)行不同提取時(shí)間的探討。圖1-d顯示隨著提取時(shí)間從0.5 h到1.5 h，多糖得率顯著上升達(dá)到最大值(4.23%)，更長(zhǎng)的提取時(shí)間(2～2.5 h)所得得率無(wú)顯著差異，趨向平衡此表明多糖的得率在提取時(shí)間增加到1.5 h之后達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[22]。綜合以上結(jié)果，決定液料比25∶1 (mL∶g)、提取溫度90 ℃和提取時(shí)間1.5 h為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心條件。

a-原料粒度;b-液料比;c-提取溫度;d-提取時(shí)間圖1 原料粒度、液料比、提取溫度及提取時(shí)間對(duì)豌豆種皮水溶性多糖得率的影響。Fig.1 Effects of granular size, liquid-solid ratio, extraction temperature and extraction time on the yield of water-soluble polysaccharides from P.sati um L. seed pericarps注:不同字母(a-d)表示數(shù)據(jù)之間有顯著差異(P<0.05)

2.2 豌豆種皮水溶性多糖的提取條件的優(yōu)化

表2顯示17組響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)的提取條件所得多糖的得率，以第16組(提取條件為液料比25 mL/g、80 ℃、2 h)的1.47%最低；第15組(液料比25 mL/g、100 ℃、2 h)的4.45%最高；5個(gè)平行的中心條件 (第8、10、11、12和17組，液料比25 mL/g、90 ℃、1.5 h)所得提取物得率介于4.22%～4.36%之間。

表2的得率經(jīng)多項(xiàng)式回歸模型與方差分析結(jié)果顯示于表3。最小平方差的回歸方程式為：Y=-71.98+0.649X1+1.439X2-1.98X3+ 3.55×10-3X1X2+ 3.00×10-3X1X3+ 0.124X2X3-1.86×10-2X12-9.05×10-3X22-2.84X32。該模型的F值為245.69；P值<0.000 1，達(dá)到非常顯著的水平。從F值和P值判斷可知所有一次項(xiàng)和大部份的二次項(xiàng)都極顯著，除了X1X3項(xiàng)不顯著之外; 影響因子的顯著性為提取溫度(X2和X22)> 提取時(shí)間(X3和X32)> 液料比(X1和X12)。模型的失擬項(xiàng)P> 0.05，不顯著，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值擬合度達(dá)到顯著水平; 模型的決定系數(shù)R2=0.997，表示該模型可描述實(shí)際數(shù)據(jù)的變化程度達(dá)99.7%。

根據(jù)表3的回歸方程，將各項(xiàng)因素對(duì)多糖得率的交互作用解析如圖2所示。圖2-a為固定提取時(shí)間1.5 h下，提取溫度和液料比對(duì)多糖得率的曲面圖和等高線圖。曲面圖的對(duì)稱性表明提取溫度和液料比對(duì)多糖得率有明顯的交互作用;等高線圖呈橫向橢圓形，顯示溫度的作用大于液料比的作用, 且在液料比27.5 mL/g和95 ℃條件下得率極大化達(dá)4.23%。由圖2-b可知，當(dāng)固定提取溫度90 ℃時(shí)，曲面圖顯示提取時(shí)間和液料比對(duì)多糖得率也有顯著的交互作用；等高線圖也呈橫向橢圓形，顯示提取時(shí)間的影響大于液料比，且得率極大化(4.21%)是在液料比26.2 mL/g和1.65 h條件下。由圖2-c可知，在固定液料比25 mL/g下，曲面圖顯示得率極大化方向是朝向高溫度長(zhǎng)時(shí)間的組合，即提取溫度與時(shí)間的影響相當(dāng);等高線圖清楚顯示得率極大化的條件是96 ℃、1.8 h。

表2 不同提取條件下豌豆種皮水溶性多糖的得率Table 2 Yields of water-soluble polysaccharides from P.sati um L. seed pericarp under different extraction conditions

表3 豌豆種皮水溶性多糖得率的多元回歸模型與方差分析結(jié)果Table 3 Predicted regression model and ANO A results for yields of polysaccharides from P.sati um L.seed pericarp

a-固定提取時(shí)間為1.5 h的曲面圖和等高線圖；b-固定提取溫度為90 ℃的曲面圖和等高線圖;c-固定液料比為25 mL/g的曲面圖和等高線圖圖2 提取因子對(duì)豌豆種皮水溶性多糖得率的交互作用響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots and counter plots for interacti e effects of extraction factors on the yields of water-soluble polysaccharides from P.sati um L. seed pericarp

綜合觀之，響應(yīng)面回歸方析預(yù)測(cè)得出最優(yōu)化的提取條件為：液料比為25.67 mL/g，提取溫度為91.33 ℃，提取時(shí)間為1.57 h，預(yù)估可得水溶性多糖最大得率為4.46%。為了驗(yàn)證該模型的可靠性，采取容易操控的優(yōu)化提取條件：液料比25∶1 (mL∶g)，提取溫度91 ℃，提取時(shí)間1.5 h，以40 g樣品量進(jìn)行3次提取試驗(yàn)驗(yàn)證，得到多糖得率為(4.39±0.41)%，實(shí)際值與理論值接近，說(shuō)明回歸分析方程式可靠，可以適切地預(yù)測(cè)實(shí)際值。本文發(fā)現(xiàn)提取因子對(duì)豌豆水溶性多糖得率的描述模型(表3)與鷹嘴豆(CicerarietinumL.)水溶性多糖[23]相似，模型的R2值皆高于0.99，且大部份的提取因子項(xiàng)的貢獻(xiàn)非常顯著(P<0.001)。

2.3 豌豆種皮水溶性多糖的提取動(dòng)力學(xué)

由于圖1-d為近似優(yōu)化條件(液料比25 mL/g和90 ℃)下的多糖得率與提取時(shí)間的關(guān)系，可進(jìn)一步數(shù)學(xué)處理以了解優(yōu)化條件下的提取動(dòng)力學(xué)參數(shù)，所得結(jié)果如圖3所示。圖3-a顯示豌豆水溶性多糖的相對(duì)提取率Rext(公式(3))隨提取時(shí)間(t)有降低的趨勢(shì)，可以多項(xiàng)式Rext= 0.008 5t2-1.863t+100.7(R2=0.999)適切地描述。圖3-b為一級(jí)擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)關(guān)系(公式(4))，顯示豌豆水溶性多糖的提取反應(yīng)呈現(xiàn)兩階段速率常數(shù)，前期(0～60 min)的速率常數(shù)k1(即斜率)為0.028 8 min-1;后期(60～120 min)的k1為0.090 7 min-1，大約為前期的3倍，線性回歸的相關(guān)系數(shù)都很高(R2= 0.971)；求得前期和后期的半數(shù)提取時(shí)間(t1/2) (公式(5))分別為24.1和7.6 min。這后期提取速率常數(shù)高于前期的現(xiàn)象可能與后期豌豆種皮粉粒充分水合膨潤(rùn)、促進(jìn)多糖擴(kuò)散溶出有關(guān)。圖3-c為假設(shè)多糖的提取反應(yīng)為n級(jí)動(dòng)力學(xué)(公式(7))所得的線性關(guān)系, 斜率(n值)為0.809，截距(lnkn)為-3.742 5，即kn= 0.023 7 min-1，相關(guān)系數(shù)R2高達(dá)0.987；得半數(shù)提取時(shí)間(t1/2)為29.2 min。

綜合而言，在本研究范圍內(nèi)，豌豆種皮水溶性多糖的提取動(dòng)力學(xué)為兩階段的一級(jí)擴(kuò)散控制的動(dòng)力學(xué)模式，但整體上為一階段的偽一級(jí)(n=0.81)動(dòng)力學(xué)模式，可能受原料因素(包括粒徑大小、幾何形狀、組成成分和結(jié)構(gòu))等所影響。其中一級(jí)擴(kuò)散反應(yīng)的前期k1值接近于n級(jí)反應(yīng)的kn值。圖3-b和圖3-c的動(dòng)力學(xué)回歸線具有很高的相關(guān)系數(shù)，顯示在本研究分析范圍內(nèi)多糖提取主要受擴(kuò)散控制的溶出行為所主導(dǎo)，熱降解反應(yīng)[11-13]并不明顯，可忽略。本研究的豌豆種皮熱水可溶性多糖的一級(jí)提取速率常數(shù), 前期k1(0.029 min-1)接近超聲波輔助提取甘草多糖的速率常數(shù)(k=0.015～0.046 min-1，在溫度323～353 K、聲波功率420～600 W下)[12]，而后期k1(0.091 min-1)接近超聲波輔助提取韭菜多糖的速率常數(shù)(k=0.088～0.097 min-1，在溫度303～323 K、聲波功率240～480 W下)[11]。

a-相對(duì)提取率;b-一級(jí)擴(kuò)散反應(yīng)模式;c-n級(jí)反應(yīng)模式圖3 豌豆種皮水溶性多糖的提取動(dòng)力學(xué)Fig.3 Extraction kinetics for water-soluble polysaccharides from P.sati um L. seed pericarps注：得率數(shù)據(jù)來(lái)自圖1-d的平均值

2.4 豌豆種皮水溶性多糖的化學(xué)成分及單糖組成

上述優(yōu)化提取條件所得水溶性多糖PPW經(jīng)化學(xué)組成分析，結(jié)果如表4所示。豌豆種皮多糖PPW的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為68.68%，糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23.55%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.03%，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.13%。在單糖組成方面，PPW的單糖組成種類多，摩爾分?jǐn)?shù)最高的是阿拉伯糖(40.13%)，其次是木糖(22.39%)，半乳糖醛酸(17.53%)，以及少量的葡萄糖(8.07%)、半乳糖(7.51%)及鼠李糖(4.36%)。

表4 豌豆種皮水溶性多糖的一般組成及單糖組成 單位：%

2.5 豌豆種皮水溶性多糖的分子質(zhì)量分布、分子粒徑與固有黏度

圖4為PPW在0.1 mol/L NaNO3溶液中分子質(zhì)量分布的HPSEC-MALLS 色譜圖，示差檢測(cè)器(RI)信號(hào)(溶質(zhì)濃度的指標(biāo))尖峰分布寬廣，呈現(xiàn)3個(gè)色譜尖峰在22、27和33～34 min， 尖峰占比分別為18.6%、61.7%、和19.7%。光散(LS)信號(hào)(分子粒徑的指標(biāo))顯示1個(gè)主要尖峰在21 min處，伴隨1個(gè)肩峰在18 min處。基于RI和LS信號(hào)計(jì)算所得分子質(zhì)量(Y坐標(biāo))在18～27.5 min (即分子質(zhì)量為7×104～7×106g/moL)之間呈直線性的關(guān)系，顯示此區(qū)段的多糖分子構(gòu)形特征有一致性，分子的色譜層析行為符合體積排阻分析原理，可正確地檢測(cè)樣品的分子性質(zhì)參數(shù)；而27.5～35 min區(qū)呈不規(guī)則波動(dòng)，可能因LS信號(hào)太弱導(dǎo)致計(jì)算得的分子質(zhì)量線波動(dòng)或不準(zhǔn)所致。3個(gè)尖峰所對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量分別為1.3×106、7×104和6×104g/mol，即 1 300、70和60 kDa。

圖4 豌豆種皮水溶性多糖的HPSEC-MALLS 色譜圖譜Fig.4 HPSEC-MALLS chromatogram for water-soluble polysaccharides from Pisum sati um L.seed pericarp

構(gòu)形參數(shù)ρ值和MHS參數(shù)α值均與多糖在溶液中的構(gòu)象有關(guān)。理論上,ρ值為0.775時(shí)多糖構(gòu)象為緊密球體；1.5～1.8時(shí)呈柔軟無(wú)規(guī)則卷曲狀；≥2時(shí)為伸展性桿狀；ρ值越大反應(yīng)鏈的剛性越大[24]。而MHS參數(shù) α值為0～0.33時(shí)多糖呈球狀； 0.5～0.8時(shí)呈柔軟無(wú)規(guī)則卷曲狀； >0.8時(shí)呈半柔軟申展性鏈；1.8～2時(shí)為硬短桿狀[25]。PPW的ρ值1.38、α值0.372, 反映其在HPSEC分析時(shí)(0.1 mol/L NaNO3溶液中)的分子鏈構(gòu)象呈柔軟無(wú)規(guī)則卷曲松散的球狀。

2.6 不同提取條件和豆科種類的影響

針對(duì)豆科種皮水溶性多糖提取的優(yōu)化條件，本研究的豌豆水溶性多糖的提取條件(液料比25 mL/g, 91 ℃, 1.5 h)與鷹嘴豆水溶性多糖(液料比24 mL/g, 99 ℃, 2.8 h)[23]及大豆水溶性多糖(液料比25 mL/g, 90 ℃, 68 min, pH 5.5)[26]的提取條件部分相近似。

比較豌豆種皮以不同溶液直接提取的多糖，在得率方面，本研究的水溶性多糖得率(4.4%)接近高酸中溫提取(3.3%～4.8%)[6]，但低于檸檬酸液提取的(9.8%)[6]以及采用乙二胺四乙酸加聚半乳糖醛酸酶和纖維素酶輔助提取的果膠得率(9%～12%)[5]。在單糖組成方面，本研究的水可溶性多糖(阿拉伯糖∶木糖∶半乳糖醛酸摩爾比=1∶0.55∶0.45)比冷堿溶性多糖(阿拉伯糖∶木糖∶半乳糖醛酸摩爾比=1∶0.28∶0.79)[2]具有相似的阿拉伯糖比率、較高的木糖比率及較低的半乳糖醛酸比率，顯示熱水可溶多糖含有較多聚木糖、較少的果膠含量，但聚阿拉伯糖在熱水和冷堿溶提得的多糖中存在量相似。且豌豆水可溶性多糖的中性糖含量高達(dá)82.5%，高于高酸提取得的多糖(為低甲氧基果膠)的中性糖含量(15%～36%)[6]。

比較不同豆科種皮的熱水可溶性多糖，本研究的豌豆水溶性多糖比鷹嘴豆水溶性多糖(半乳糖醛酸∶半乳糖∶阿拉伯糖摩爾比=42∶23∶13)[27]和大豆水溶性多糖SHP-1[M(半乳糖醛酸)∶M(半乳糖)∶M(阿拉伯糖)∶M(鼠李糖)=47∶18∶14∶15][28]具有較多的聚阿拉伯糖和聚木糖、較少果膠。不同地，綠豆(ignaradiataL.)水溶性多糖含有M(甘露糖)∶M(半乳糖醛酸)∶M(半乳糖)=34∶22∶18[29]。WANG等[30]發(fā)現(xiàn)大豆種皮水溶性多糖的乙醇區(qū)分物含多量的甘露糖摩爾分?jǐn)?shù)較高(27%～61%)[30]，而非YANG等[28]所發(fā)現(xiàn)的富含半乳糖醛酸，可能是提取條件不同所致。大致上，豌豆種皮水可溶性多糖富含聚阿拉伯糖和聚木糖; 鷹嘴豆種皮水溶多糖富含果膠; 綠豆種皮水溶性多糖富含聚甘露糖; 而大豆種皮水溶性多糖富含果膠或聚甘露糖。

3 結(jié)論

本研究利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析法，優(yōu)化制備豌豆種皮熱水溶性多糖的最佳條件為：液料比25 mL/g，提取溫度91 ℃，提取時(shí)間1.5 h，最大得率為4.4%，所得回歸方程式模型的適用性非常顯著(P<0.001)。多糖得率與提取時(shí)間的關(guān)系可以兩階段的一級(jí)擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)模式，或以一階段的偽一級(jí)(n=0.8)動(dòng)力學(xué)模式來(lái)描述都非常適切。所得多糖的主要單糖組成摩爾比為阿拉伯糖∶木糖∶半乳糖醛酸=1∶0.55∶0.45。整體分子的Mw為338.9 kDa；PDI為3.67；Rg為46.8 nm；ρ值為 1.38；[η]為85.8 mL/g；MHS參數(shù)α為0.372。分子鏈構(gòu)象呈柔軟無(wú)規(guī)則卷曲松散的球狀。比較多種豌豆種皮多糖的單糖組成和分子量分布圖，可推知該水可溶性多糖含有聚阿拉伯糖、聚木糖和果膠，非常適合用來(lái)制備高附加值的聚阿拉伯糖和聚木糖，不同于其他豆科。本研究成果可為將來(lái)量產(chǎn)功能性豌豆多糖和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為豌豆加工企業(yè)資源綜合利用提供新的有效途徑。此外，分離、純化和規(guī)格化豌豆在種皮多糖區(qū)分物、解析其結(jié)構(gòu)-生物活性關(guān)系的研究也值得深入探討。