周秋利，顧喆，龍凌鳳，郭書賢，劉汝寬，孫海彥，孫付保*

1(江南大學 生物工程學院 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(南陽理工學院 生物與化學工程學院 河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術重點實驗室，河南 南陽，473004) 3(湖南省林業(yè)科學院 省部共建木本油料資源利用國家重點實驗室，湖南 長沙，410004) 4(中國熱帶農業(yè)科學院 熱帶生物技術研究所海南省熱帶微生物資源重點實驗室，海南 ?？?，571101)

微生物油脂又稱單細胞油脂，是微生物在一定條件下產生并儲存在細胞內的甘油酯，其脂肪酸組成與植物油脂類似，以C16和C18系脂肪酸為主，可以作為生產生物柴油的原料[1]。由于產油微生物具有發(fā)酵周期短、不受季節(jié)氣候影響和碳源利用廣等優(yōu)點，在未來生物柴油產業(yè)的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]，具有良好的發(fā)展前景。細菌、酵母、霉菌和藻類都可以用來生產微生物油脂，其中以酵母和霉菌類真核微生物居多[3]，一些產油酵母的油脂質量可以達到自身干重的80%[4]。

目前，微生物油脂的生產價格仍高于動植物油，主要是因為培養(yǎng)過程中碳源(主要是葡萄糖)成本占總成本的80%[5]，因此要實現微生物油脂的大規(guī)模生產必須使用廉價的碳源。木質纖維素是世界上儲量最大的可再生資源，充分水解后能得到含有葡萄糖和木糖等單糖的混合糖[6]，是實現生物轉化、生產生物產品的潛在重要原料。然而，大多數微生物具有葡萄糖效應，通常先消耗葡萄糖后利用其他戊糖，葡萄糖會抑制其他糖的利用[7]，這種效應造成木糖資源浪費。因此，選育能同時利用葡萄糖和木糖混合糖的高產油脂酵母已經成為微生物油脂技術領域的重要研究方向。

傳統誘變方法是實現菌株改良的有效方法之一[8]，與單一誘變方法相比，物理化學復合誘變有更高的突變頻率[9]。常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma,ARTP)誘變育種技術是利用等離子體射流破壞細胞的DNA結構，使細胞啟動自身的DNA修復機制，在此過程中會產生基因突變[10]。該技術產生的等離子體濃度高且均勻，具有突變率高、成本低、無污染和操作安全等優(yōu)點，已被廣泛應用于細菌、酵母和真菌等多種微生物育種[11]，比如小球藻Chlorellaulgaris，ARTP誘變后選育出的高產菌株M1，其總脂含量提高了103.5%[12]；酵母Candidatropicali，ARTP誘變后選育出的突變菌株T31，其木糖醇產量增加了22%[13]。硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)是一種烷化劑，能夠使部分堿基烷基化，從而改變DNA結構，常用于真核微生物的誘變育種[14]。袁超等[15]利用DES和紫外線進行物理化學復合誘變，篩選出1株高產糖化酶的菌株，其產酶能力提高了53%。綜上所述，利用ARTP和DES復合誘變有望大大提高菌株的產油能力。此外，建立快速高效的篩選方法是選育高產菌株的關鍵。唐鑫等[16]利用脂肪酸合酶抑制劑淺藍菌素和表征脂肪酸脫氫酶活性的氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)為篩選因子，篩選出高產花生四烯酸的高山被孢霉。金麗華等[17]基于尼羅紅熒光染色測定油脂方法，利用96孔板高通量篩選手段獲得經ARTP誘變的高產突變體。由此可以利用淺藍菌素和TTC對突變菌株進行初篩，再利用尼羅紅熒光染色和孔板培養(yǎng)進行高通量篩選。

因此，本文利用ARTP和DES誘變技術對可同時利用葡萄糖和木糖混合糖的野生油脂酵母TrichosporondermatisZZ-46進行復合誘變處理，以一定濃度的淺藍菌素和TTC作為篩選因子對突變體進行初篩，再利用尼羅紅熒光檢測對初篩突變菌株進行高通量篩選，以期獲得高產油脂酵母，為后續(xù)利用纖維素水解液發(fā)酵奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

T.dermatisZZ-46, 南陽市工業(yè)微生物菌種保藏中心,菌株編號NICC 30027。

1.1.2 主要試劑

淺藍菌素,Sigma公司;氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC),生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器

常壓室溫等離子體誘變儀ARTP-3，北京思清源生物科技有限公司；GC-2030AF氣相色譜儀，日本島津；Chromaster CM5110高效液相色譜儀，日本日立。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

YPD固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10、葡萄糖20、蛋白胨20，瓊脂15～20，115 ℃ 滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10、葡萄糖20、蛋白胨20，115 ℃ 滅菌20 min。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖46.67 g/L、木糖23.33 g/L、酵母提取物0.75 g/L、NH4Cl 0.1 g/L、Na2SO40.1 g/L、MgCl2·6H2O 1 g/L、KH2PO411.8 g/L、K2HPO4·3H2O 3.7 g/L、CaCl2·2H2O 40 mg/L、FeSO4·7H2O 5.5 mg/L、一水合檸檬酸 5.2 mg/L、ZnSO4·7H2O 1 mg/L、MnSO4·H2O 0.76 mg/L、18 mol H2SO41.84 μg/L，115 ℃ 滅菌20 min。

1.2.2 高效菌株篩選方法的建立

1.2.2.1 TTC和淺藍菌素添加濃度的確定

將OD600 nm=1.0野生酵母ZZ-46菌懸液經適當梯度稀釋后，取100 μL分別涂布于含有不同質量濃度TTC(0、1.67×10-2、4.17×10-2、6.67×10-2和9.17×10-2g/L)的YPD平板上，以及含有不同濃度淺藍菌素(0、1.87×10-6、2.61×10-6、4.11×10-6mol/L)的YPD平板上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，根據菌落生長狀況及顏色確定TTC和淺藍菌素的最佳添加濃度。

1.2.2.2 平板初篩和高通量篩選

將誘變后的菌液涂布在含有篩選因子的平板上，25 ℃培養(yǎng)2 d，挑取大且紅的單菌落到48孔板中(1.0 mL YPD培養(yǎng)基/孔)，在25 ℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)，2 d后將100 μL的菌液移到96孔板,利用酶標儀檢測OD600 nm表征細胞濃度。

每個孔板中再添加5 μL尼羅紅溶液，混勻后避光染色5 min，用酶標儀檢測熒光強度表征油脂產量。檢測的發(fā)射波長和吸收波長分別為485和595 nm。熒光強度為測出的樣品熒光強度減去沒有加尼羅紅的樣品背景熒光強度。

1.2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

挑取初篩得到的高產突變菌株單菌落接種于YPD種子培養(yǎng)基中，25 ℃，140 r/min培養(yǎng)36 h，按體積分數10%的接種量接種于50 mL基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃，140 r/min發(fā)酵7 d。發(fā)酵液離心收集菌體，測定菌體生物量、發(fā)酵液油脂產量以及菌體油脂含量。

1.2.3 菌株誘變方法

1.2.3.1 菌懸液的制備

保藏的菌株經活化后，挑取單菌落于YPD種子培養(yǎng)基中，25 ℃，140 r/min培養(yǎng)36 h，取1.0 mL菌液8 000 r/min離心5 min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌3次，在渦旋儀上混勻，經過適當稀釋，制備成OD600 nm=1.0的菌懸液。

1.2.3.2 ARTP誘變

按上述方法制備ZZ-46菌懸液，取10 μL于無菌金屬載片上，將金屬載片置于ARTP誘變儀操作室載物臺的凹槽內，誘變條件：功率100 W，處理距離2 mm，氣體流量10 min/L，處理時間分別為20、50、80、110、140和170 s。將經過ARTP處理過的樣品適當稀釋后涂布于YPD平板上25 ℃培養(yǎng)2 d，未經ARTP處理的菌液進行相同濃度稀釋后涂布于平板，培養(yǎng)條件相同，以此作為對照，按公式(1)計算致死率:

100

(1)

1.2.3.3 DES誘變

通過ARTP誘變獲得的高產突變菌株在斜面上活化，按照上述方法制備菌懸液2.0 mL，加入2.0 mL pH 7.0的磷酸緩沖液，再加入0.2 mL 50%硫酸二乙酯-乙醇溶液，25 ℃分別振蕩10、30、50、70、90和110 min。每次處理后，向反應混合物中加入1.0 mL 250 g/L硫代硫酸鈉溶液終止反應。將反應物稀釋到適當濃度，取100 μL涂布于YPD平板，25 ℃培養(yǎng)2 d，以稀釋倍數相同且未經處理的菌懸液為對照，計算致死率(公式同上)。

1.2.4 分析方法

生物量的測定和油脂的提取參照文獻[18-19];脂肪酸組成分析參照文獻[19-20];利用液相色譜儀測定葡萄糖和木糖含量參照文獻[21]。

1.2.5 遺傳穩(wěn)定性分析

將誘變菌株在平板培養(yǎng)基上連續(xù)傳代 7 次，再進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測菌株的生物量和油脂產量，研究其遺傳穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 TTC和淺藍菌素添加濃度的確定

TTC是一種氧化還原劑，溶于水時無色，當接受脫氫酶脫下來的H+時被還原成紅色物質三苯基甲臢(triphenyl formazan,TF)，其顏色越深則表示脂肪酸脫氫酶的活性越強，不飽和脂肪酸的含量就越高[22]。淺藍菌素是一種抗真菌抗生素，可抑制脂肪酸合酶的活性，從而不可逆地抑制內源性脂肪酸的合成，阻礙菌體的正常生長[23]。因此，只有高活性脂肪酸合酶的酵母才能在一定濃度的淺藍菌素平板上存活而被篩選出來。本實驗將TTC和淺藍菌素作為抗性篩選因子添加到固體YPD培養(yǎng)基中，采用1.2.2.1小節(jié)中的方法對TTC和淺藍菌素添加濃度進行探究,結果如圖1所示。

a-TTC;b-淺藍菌素圖1 不同濃度TTC和淺藍菌素對ZZ-46的生長的影響Fig.1 Effects of different concentrations of TTC and cerulenin on the growth of ZZ-46

隨著TTC添加質量濃度升高，菌落直徑越來越小，紅色也越來越淺。根據菌落顏色深淺以及生長狀況，在保證TTC最佳染色濃度的同時，盡量減弱TTC對菌落的生長影響，最終確定TTC的添加質量濃度為1.67×10-2g/L。淺藍菌素能抑制酵母ZZ-46生長，且隨著淺藍菌素濃度升高，菌落直徑越來越小，酵母受到的抑制作用越強烈。當添加淺藍菌素的濃度為4.11×10-6mol/L時，酵母ZZ-46生長受到明顯抑制，較對照有顯著差異，為了保證篩選效果，最終選取4.11×10-6mol/L作為淺藍菌素的最佳添加濃度。

2.2 ARTP誘變及突變菌株的選育

誘變強度和時間都會影響細胞的致死率，適當的致死率才有利于菌株篩選。采用1.2.3.2小節(jié)的方法考察野生油脂酵母ZZ-46的誘變時間和致死率關系，結果如圖2所示。

隨著誘變時間延長，菌落的數量越來越少，致死率越來越高。當處理時間的140 s時，致死率達到96.1%，處理170 s時，致死率達到100%。由于ARTP誘變產生的突變具有隨機性，致死率和正突變之間的關系并不明確，這主要取決于誘變方法和菌株自身特性[16]。因此，為了獲得生存能力較強的菌株，本研究選擇致死率超過95%的140 s為最佳誘變時間。

圖2 野生油脂酵母ZZ-46的ARTP致死率曲線Fig.2 ARTP lethality cur e of wild oil yeast ZZ-46

將經過ARTP處理140 s后的酵母稀釋到合適濃度并涂布到含有1.67×10-2g/L TTC和4.107×10-6mol/L淺藍菌素的YPD平板上。按照1.2.2.2小節(jié)中的方法進行平板初篩和高通量篩選，測得各突變菌株的OD600 nm和熒光強度。如圖3所示，表明原始菌株和誘變菌株的相對OD600 nm和熒光強度(培養(yǎng)48 h，原始菌株為1)。以熒光強度為指標，ZZ-46正突變率為43%，生物量總體相差不大。其中，有6株突變菌(G1、A4、C4、H4、B6和H6)的熒光強度是出發(fā)菌株的1.2倍以上，選擇這6株菌進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)復篩。

圖3 ARTP誘變菌株的相對OD600 nm和熒光強度Fig.3 Relati e OD600 nm and fluorescence intensity of ARTP mutagenic strains

將誘變菌株G1、A4、C4、H4、B6和H6和野生菌株進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵7 d后收集菌體，檢測生物量、油脂產量。結果如圖4所示，與野生菌相比，所篩選6株菌的油脂產量和油脂含量均有所提高，除B6、H6外，其他菌株的生物量都有所降低。綜合生物量和油脂產量2個指標，B6較出發(fā)菌呈現出更大的優(yōu)勢，生物量和油脂產量分別達到21.75、10.31 g/L，較出發(fā)菌分別提高8.10%、20.0%。

圖4 ARTP誘變菌株的復篩結果Fig.4 Rescreening results of ARTP mutagenic strains

2.3 DES誘變及突變菌株的選育

采用1.2.3.3小節(jié)中的方法考察突變菌株B6的誘變時間和致死率關系，結果如圖5所示。隨著誘變時間延長，菌落數量越來越少，當誘變時間為70 min時，致死率為77%，誘變時間延長至90和110 min時，致死率分別為88.23%和95.23%。選擇70%～80%的致死率作為誘變計量[24]，故DES誘變時間選擇70 min。

將DES處理70 min后的B6突變菌按上述方法進行平板初篩和高通量篩選，測得各突變株的OD600 nm和熒光強度。B6和誘變菌株的相對OD600 nm和熒光強度(培養(yǎng)48 h，B6菌株為1)如圖6所示，正突變率不如ARTP誘變顯著，與ARTP誘變相比，沒有突變菌株的熒光強度增加20%。突變菌株L7和N7的熒光強度比出發(fā)菌B6增加10%左右，選擇這2株菌進行發(fā)酵搖瓶復篩。

圖5 突變菌株B6的DES致死率曲線Fig.5 DES lethality cur e of mutant strain B6

圖6 DES誘變菌株的相對OD600 nm和熒光強度Fig.6 Relati e OD600 nm and fluorescence intensity of DES mutagenic strains

將突變菌株L7、N7和出發(fā)菌株B6進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵7 d后收集菌體，檢測生物量、油脂產量，結果如圖7所示。

圖7 DES誘變菌株的復篩結果Fig.7 Rescreening results of DES mutagenic strains

經過搖瓶復篩之后，突變菌L7呈現出最大的優(yōu)勢，其生物量、油脂產量和油脂含量分別達到22.66 g/L、11.44 g/L和50.49%，較突變菌B6分別提高4.18%、10.96%和3.09%，較野生型菌株ZZ-46分別提高12.62%、33.18%和7.8%。為了研究突變菌株的遺傳穩(wěn)定性，實驗對菌株L7進行傳代培養(yǎng)，第1代到第7代的生物量、油脂產量和油脂含量分別維持在22.6 g/L、11.5 g/L和50.7%左右，表明該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4 油脂脂肪酸組成

對野生菌株ZZ-46和突變菌株B6、L7所產油脂進行脂肪酸成分分析，結果如表1所示。誘變前后脂肪酸組成相同，主要是棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)和亞油酸(C18∶2)，其中油酸含量最多、棕櫚酸次之、硬脂酸和亞油酸含量接近，這4種脂肪酸占總脂肪酸的95%以上，與植物油的脂肪酸組成類似[25]。其中，L7與ZZ-46相比，不飽和脂肪酸亞油酸含量上升2.11%，這可能是因為突變菌株的脂肪酸脫氫酶活性更高，其余脂肪酸含量并沒有發(fā)生太大變化，可以作為生產生物柴油的原料。

2.5 野生菌株ZZ-46和突變菌株L7利用混合糖的發(fā)酵曲線

木質纖維素完全水解后得到的葡萄糖和木糖能達到總糖的90%以上，且兩者的質量比約為2∶1[18]，因此選擇葡萄糖∶木糖=2∶1(質量比)的初始碳源模擬纖維素水解液，總糖質量濃度保持70 g/L。考察野生菌株ZZ-46和突變菌株L7生長和積累油脂的情況，結果如圖8所示。

a-野生菌體ZZ-46; b-突變菌體L7圖8 野生菌株ZZ-46和突變菌株L7的發(fā)酵曲線圖Fig.8 Fermentation cur e of wild strain ZZ-46 and mutant strain L7

表1 野生菌株和突變菌株的脂肪酸組成及含量Table 1 Fatty acid composition and content of wild and mutant strains

由圖8可知，ZZ-46和L7的油脂積累和菌體生長均是生長偶聯型，且L7的生物量、油脂產量和油脂含量明顯高于ZZ-46。在培養(yǎng)第7天時，兩者油脂含量均達到最大，分別是42.67%和50.49%，繼續(xù)培養(yǎng)后，雖然生物量有所增加，但是油脂產量和油脂含量均在下降，表明細胞在消耗完培養(yǎng)基中的碳源后，又開始消耗胞內油脂作為能量以維持細胞增殖。從葡萄糖和木糖的利用情況來看，ZZ-46和L7均能同時利用葡萄糖和木糖，葡萄糖的存在并不會抑制細胞對木糖的利用，克服了大多數微生物存在的葡萄糖效應，這可能是因為該菌株的2種糖轉運蛋白具有相似的效率，或者存在對這2種糖具有相同親和力的獨特糖轉運蛋白在此酵母中運行[25]。此外，L7比ZZ-46提前1 d消耗完混合糖，表明L7的糖耗速率和糖轉化能力都顯著高于野生菌株，可能是因為L7的脂肪酸合酶具有更高的活性。這些特性對利用纖維素水解液發(fā)酵、降低微生物油脂生產成本具有重要意義不少研究者探討產油酵母利用混合糖積累油脂的能力。宋兆齊等[6]篩選獲得1株油脂酵母JM-D，在葡萄糖∶木糖=3∶1質量濃度比混合糖條件下菌體油脂含量達到23.38%，油脂產量達到2.7 g/L；孔祥莉等[18]研究斯達氏油脂酵母L.starkeyi2#在葡萄糖∶木糖=23∶12質量濃度比混合糖條件下發(fā)酵積累油脂，生物量和油脂質量分數分別達到19.0 g/L和52.6%；HU等[25]利用T.cutaneumAS 2.571在葡萄糖∶木糖=47∶23質量濃度比混合糖條件下發(fā)酵積累油脂，生物量、油脂產量和油脂含量分別達到23.2 g/L、11.2 g/L和48.4%；YU等[26]利用T.dermatis32903在葡萄糖∶木糖=3∶1質量濃度比混合糖條件下發(fā)酵積累油脂，OD600 nm達到71.13，油脂產量達到11.48 g/L。

相比上述實驗結果，在相同比例的混合糖中，L7具有較為突出的油脂積累能力，此外，L.starkeyi2#在發(fā)酵前期以利于葡萄糖為主，當葡萄糖質量濃度低于16 g/L時，木糖的消耗速率明顯加快，高濃度葡萄糖阻礙了菌株對木糖的利用，并不能實現真正意義上的同步利用葡萄糖和木糖。T.dermatis32903雖然可以在初始濃度較高的糖中進行發(fā)酵，但是木糖的利用率僅為85.9%，且混合糖中木糖的比例不高，而L7可以完全利用發(fā)酵液中的木糖，不會造成木糖浪費，也不需要改變水解液中葡萄糖和木糖的比例。

3 結論

本文采用ARTP和DES復合誘變方法獲得1株高產油脂酵母L7，其生物量、油脂產量和油脂含量較野生型菌株ZZ-46分別提高了12.62%、33.18%和7.8%，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性，脂肪酸組成與植物油相似。該突變菌株L7具有同時消耗葡萄糖和木糖積累油脂的能力，具有利用木質纖維素水解液的潛力，為規(guī)?；a微生物油脂提供可能。