劉洋，楊秀梅，邵迎華，韓哲，孫廣宇

子宮內(nèi)膜癌是絕經(jīng)期女性好發(fā)的惡性腫瘤疾病，屬于生殖系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)為陰道無規(guī)律出血及疼痛等[1]。目前，通過對患者進行病理和腹腔鏡磁共振顯像確定病灶情況，進一步確定手術(shù)方案。子宮內(nèi)膜癌早期不易發(fā)現(xiàn)，晚期患者需要進行放化療，預(yù)后不佳。尋找科學(xué)、有效的藥物改善子宮內(nèi)膜癌疾病至關(guān)重要[2]。

聚ADP核糖聚合酶-1 (PARP-1)是一種多功能的核酶，存在于真核細胞的細胞核內(nèi)，PARP-1不同基因位置功能不同，大量研究顯示，PARP-1與乳腺癌、卵巢癌的發(fā)展相關(guān)[3]。子宮內(nèi)膜癌治療的難點在于癌細胞能夠轉(zhuǎn)移、擴散，所以，抑制癌細胞血管新生及促進癌細胞凋亡已經(jīng)成為治療子宮內(nèi)膜癌的途徑之一。青蒿琥酯(Art)屬于中藥提取的衍生物，臨床多用于重度和腦部瘧疾[4-5]，但是對子宮內(nèi)膜癌細胞生物活性及PARP-1水平的影響，目前文獻報道較少，現(xiàn)探討青蒿琥酯對子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡及PARP-1蛋白的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1) 細胞：子宮內(nèi)膜癌HEC1B細胞株(上海柯豐生物科技有限公司)；(2)藥物、試劑：青蒿琥酯(桂林南藥股份有限公司)； MTT、DMSO(USA Sigma公司)；PARP-1(上海再鼎醫(yī)藥有限公司)；(3)儀器：Tanswell小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)；蛋白質(zhì)電泳儀(河北慧采生物有限公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(上海朗頓生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；流式細胞儀(USA BD Biosciences)。

1.2 HEC1B細胞株培養(yǎng)與分組 2019年5—9月于滄州市人民醫(yī)院實驗室完成。將低溫冷藏的HEC1B細胞株，快速移入37℃水中溶解，離心棄除上清液，加入培養(yǎng)基，無氧下培養(yǎng)，每隔一日更換培養(yǎng)液，細胞生長至85%～90%時消化傳代。HEC1B細胞株分為對照組、藥物組，藥物組以加入不同濃度青蒿琥酯再分為25 mol/L、50 mol/L和100 mol/L 3個亞組。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 MTT法檢測HEC1B細胞株活性：將濃度為1 000 ng/μl的青蒿琥酯溶液采用10%FBS分別調(diào)整濃度為25 mol/L、50 mol/L和100 mol/L，取HEC1B細胞1×107/ml接種到96孔板中，對照組正常培養(yǎng)，藥物組加入25 mol/L、50 mol/L和100 mol/L青蒿琥酯溶液，分別培養(yǎng)24 h、48 h及72 h，后加MTT 20 μl，4 h后，加入DMSO 150 μl，采用酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測每個孔HEC1B細胞的活性(OD值)。

1.3.2 Transwell法測定HEC1B細胞株遷移能力：將各組HEC1B細胞株進行饑餓處理，12 h后再加入DMSO，24 h后離心重懸細胞1×107/ml， 將細胞懸液200 ml加入小室中，下室中檔為400 μl的培養(yǎng)架，37.5℃培養(yǎng)2～3 d，取出小室，用棉簽拭去上室細胞，進行染色，計算HEC1B細胞株數(shù)。

1.3.3 流式細胞儀檢測HEC1B細胞凋亡：將各組HEC1B細胞株以1×107/ml置于96孔板，培養(yǎng)1 d后，加入少量胰蛋白酶，消化4 h后，用-20℃的醫(yī)用酒精固定，離心后，采用PBS清洗多次，每次5 min，進行遮光染色，分析HEC1B細胞凋亡。

1.3.4 免疫印跡法檢測PARP-1蛋白： 取各組濃度為1×107/ml的HEC1B細胞溶液100 μl，高速離心0.5 h，收集上清液。在蛋白上清液中加入樣孔。電泳后，取下PVDF膜TBS浸泡10 min，密封，采用PBS清洗3次，每次5 min，然后加一抗(1∶500),40℃雜交1 d，采用PBS清洗3次，每次5 min，加過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，雜交2 h，再次沖洗。將膜浸入ECL工作液，隨后進行檢測，獲取圖像。

2 結(jié) 果

2.1 各組HEC1B細胞OD值比較 干預(yù)后，不同時點各組內(nèi)OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；相同時間點對照組OD值高于各藥物濃度亞組(P均<0.05)，隨著青蒿琥酯濃度增加，HEC1B細胞OD值依次降低(P均<0.05)， 見表1。

2.2 各組HEC1B細胞侵襲能力比較 干預(yù)后，對照組及25 mol/L、50 mol/L、100 mol/L亞組細胞侵襲數(shù)目依次減少，分別為322.00±36.50、211.00±19.55、169.20±12.48及54.69±16.53，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=113.800，P=0.001)，見圖1。

2.3 各組HEC1B細胞凋亡情況比較 干預(yù)后，對照組G0-1期HEC1B細胞凋亡數(shù)最少，隨著青蒿琥酯濃度的增加，細胞凋亡數(shù)依次增加；對照組S期及G2-M期細胞凋亡數(shù)高于藥物組，隨著青蒿琥酯濃度增加，細胞凋亡數(shù)依次減少(P<0.05)；藥物組凋亡率高于對照組，隨著青蒿琥酯濃度的升高，HEC1B細胞凋亡率依次升高(P<0.05)，見表2。

2.4 各組HEC1B細胞PARP-1蛋白表達水平比較 干預(yù)后，對照組及25 mol/L、50 mol/L、100 mol/L亞組 HEC1B細胞中PARP-1蛋白水平依次降低，分別為(86.54±5.36)、(65.89±3.65)、(55.12±2.78)和(43.15±1.96)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=126.600，P<0.001)，見圖2。

注：A.對照組，B.25 mol/L亞組，C.50 mol/L亞組， D.100 mol/L亞組

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)高發(fā)惡性疾病，據(jù)最新報道顯示，每年有近20萬新增患者，該病已經(jīng)成為導(dǎo)致女性死亡率升高的第三大疾病[6]。多項研究顯示，對子宮內(nèi)膜癌患者進行及時治療5年生存率較好，導(dǎo)致疾病發(fā)生、發(fā)展的原因與抑癌基因失活相關(guān)。大量研究顯示，當(dāng)機體細胞處于正常水平時，細胞內(nèi)PARP-1處于未激活狀態(tài)。但是當(dāng)機體發(fā)生癌變時，細胞DNA損傷，PARP-1被激活，加重病情[2]。本研究通過對HEC1B細胞進行青蒿琥酯干預(yù)，觀察子宮內(nèi)膜癌細胞生物活性及其PARP-1表達水平。

青蒿琥酯屬于天然化合物，于菊科植物黃花蒿中提取，屬于抗重度瘧疾藥物，并獲臨床批準(zhǔn)用藥，與其他藥物相比，青蒿琥酯屬于中成藥物，不良反應(yīng)少[7-8]。近些年，青蒿琥酯逐漸用于治療惡性腫瘤，其對多種惡性腫瘤細胞均有抑制作用，表明該藥物可以作為新型抗癌藥物。本研究結(jié)果表明，青蒿琥酯對HEC1B細胞活性具有抑制作用，隨著青蒿琥酯濃度的增加OD值不斷減少，活性降低,且青蒿琥酯能夠誘導(dǎo)HEC1B細胞凋亡，減少向外侵襲。大量文獻表明，癌癥細胞核酸代謝較強，需要多種物質(zhì)參與代謝，例如高密度的鐵蛋白等。青蒿琥酯對子宮內(nèi)膜癌活性抑制作用在于能夠?qū)е掳┘毎阼F離子的誘導(dǎo)下，發(fā)生分解，并產(chǎn)生大量自由基[9]。有關(guān)研究顯示，青蒿琥酯能夠加強子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡，機制在于對細胞膜及基因進行干預(yù)，促進子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡[8，10]。Li等[11]研究表明，青蒿琥酯能夠使子宮內(nèi)膜癌細胞停滯在前期，S期凋亡細胞顯著降低，并與藥物濃度成正比，與本研究結(jié)果相似。

圖1 各組HEC1B細胞侵襲數(shù)目比較

表1 各組HEC1B細胞活性O(shè)D值比較

表2 青蒿琥酯對HEC1B細胞周期及凋亡率的影響

本結(jié)果表明，青蒿琥酯能夠降低PARP-1蛋白水平，且隨著青蒿琥酯濃度的升高，PARP-1蛋白表達水平逐漸降低。PARP-1能夠在癌細胞內(nèi)釋放，延長癌細胞基因修復(fù)，導(dǎo)致癌細胞存活時間延長[12-13]。但是當(dāng)PARP-1失活時，無法對癌細胞基因進行修復(fù)，使癌細胞凋亡停滯，細胞活性受到抑制，啟動凋亡機制[14]。姜淑娟等[15]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌患者細胞PARP-1大量表達，病情加重。PARP-1能夠作為評判子宮內(nèi)膜癌患者病情的主要指標(biāo)之一，在臨床上針對PARP-1治療已經(jīng)成為研究熱點[16]。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能夠抑制卵巢癌細胞活性，降低PARP-1水平，誘發(fā)癌細胞凋亡。這與本結(jié)果相似。Moses等[18]研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細胞繁殖，抑制血管新生，這與抑制PARP-1水平具有直接關(guān)聯(lián)，具體作用機制還需要進一步研究。

綜上所述，青蒿琥酯能夠抑制HEC1B細胞株增殖，減少向外侵襲的能力，加快凋亡，其作用機制可能與減少細胞中PARP-1表達有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉洋、楊秀梅:提出選題及研究方向，設(shè)計實驗方案并實施，論文撰寫；邵迎華、韓哲：補充研究內(nèi)容，輔助修改論文；孫廣宇：對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，論文終審