李秋紅 劉美德 周小潔 張 勇 佟 穎 曾曉芃

(北京市疾病預(yù)防控制中心，北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100013)

擬除蟲菊酯因具有廣譜的殺蟲活性，且對害蟲擊倒速度快，在環(huán)境中易降解等特性，在防治德國小蠊中應(yīng)用廣泛。1991年，Atkinson等(1991)測定了美國Gainesville和Florida的德國小蠊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的敏感性，發(fā)現(xiàn)其抗性系數(shù)達(dá)到27.4～337.1倍。2000年美國佛羅里達(dá)野外德國小蠊對氯氰菊酯的抗性倍數(shù)也達(dá)到93倍(Vallesetal., 2000)；此外，印度野外德國小蠊對氯氰菊酯的抗性倍數(shù)為80倍(Scharfetal., 1997)，新加坡22個(gè)野外品系德國小蠊對擬除蟲菊酯抗性為3～468倍(Chaietal., 2010)。近年來，我國也有學(xué)者相繼報(bào)道國內(nèi)不同省市野外品系德國小蠊對高效氯氰菊酯產(chǎn)生了約2～30倍的抗性(馬紅梅等，2017；譚良飛等，2018；張守剛等，2019)。德國小蠊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性日趨嚴(yán)重。

為研究德國小蠊對高效氯氰菊酯的抗性機(jī)制，本文通過室內(nèi)對德國小蠊進(jìn)行高效氯氰菊酯的抗藥性篩選以獲得德國小蠊的抗性品系，從而比較德國小蠊抗性品系和敏感品系羧酸酯酶(Carboxlesterase，CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases, GSTs)和細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)3種解毒酶的活性以及抗擊倒個(gè)體基因型的差異，探究德國小蠊對高效氯氰菊酯抗性產(chǎn)生的機(jī)制，對延長高效氯氰菊酯的使用壽命以及制定科學(xué)合理的防制措施具有重要的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

德國小蠊敏感品系(S)，采自北京市各區(qū)的餐飲、娛樂、企事業(yè)單位、工廠或醫(yī)院等場所，選擇抗性水平較低的試蟲，在北京市疾病預(yù)防控制中心消毒與有害生物防制所醫(yī)學(xué)昆蟲飼養(yǎng)室建立種群并馴養(yǎng)多代，視為敏感品系。德國小蠊抗性品系(R)，從敏感品系開始培育德國小蠊的抗性品系。選取其中健康、活躍的成蟲，利用單一殺蟲劑高效氯氰菊酯在殺死種群50%左右個(gè)體的選擇壓力下持續(xù)對其進(jìn)行抗性篩選，篩選數(shù)代后，為保證50%左右的選擇壓力，適當(dāng)提高用藥濃度，經(jīng)多代篩選后獲得抗性品系。

1.2 供試藥劑及試劑

99%高效氯氰菊酯(Bete-cypermethrin)原藥，拜爾公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。毒扁豆堿(eserine)Fluka公司產(chǎn)品，α-乙酸萘酯(α-naphthol acetate，α-NA)Fluka公司產(chǎn)品；固藍(lán)B鹽，F(xiàn)luka公司產(chǎn)品；十二烷基硫酸鈉(SDS)，F(xiàn)luka公司產(chǎn)品；考馬斯亮蘭G-250，F(xiàn)luka公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)，美國Sigma公司產(chǎn)品。PMSF(含量>99%)，德國Merk公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇(DTT)(含量為99%)，美國Promega公司產(chǎn)品；甘油、EDTA、硫代硫酸鈉、苯胺、KH2PO4及Na2HPO4均為國產(chǎn)分析純。

1.3 酶液的制備

1.3.1羧酸酯酶 取羽化后7～14 d德國小蠊成蟲10只，雌雄各半，剪掉雙翅和六足，在預(yù)冷的pH 7.0的0.04 mol/L磷酸緩沖液中冰浴勻漿，然后在4 ℃，8 000 g離心30 min，取上清液抽濾后作為酶源。

1.3.2細(xì)胞色素P450 參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法(于彩虹等，2002)。取羽化后7～14 d德國小蠊成蟲10只，雌雄各半，剪掉雙翅和六足，加入一定量的0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.5，含1 mol/L EDTA、0.1 mmol/L DTT、1 mmol/L PTU、1 mmol/L PMSF和體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油)，用玻璃勻漿器在4 ℃冰浴中勻漿，12 000 g(4 ℃)下離心30 min，將上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，28 500×g(4 ℃)條件下離心65 min，去除上清，沉淀用緩沖液重懸，同時(shí)加入PMSF、DTT至終濃度，分裝保存于-82 ℃冰箱中。

1.3.3谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 取羽化后7～14 d德國小蠊成蟲10只，雌雄各半，剪掉雙翅和六足，在預(yù)冷的pH 6.5的0.1 mol/L磷酸緩沖液中冰浴勻漿，然后在4 ℃，10 000 g離心30 min，取上清液作為酶源。

1.4 抗性選育和生物測定

抗性品系的選育采用逐代淘汰篩選法，用丙酮將高效氯氰菊酯原藥稀釋成5個(gè)濃度，取2.5 mL工作液于500 mL錐形瓶，放置一夜使丙酮完全揮發(fā)。在錐形瓶中制成均勻藥膜。每個(gè)濃度重復(fù)3次，再統(tǒng)一設(shè)置單純丙酮為無藥對照組。之后于各瓶頸處涂石臘油和凡士林的等量混合物。每瓶放10頭羽化后7～14 d德國小蠊成蟲，雌雄各半，24 h后記錄死亡數(shù)，測得德國小蠊對高效氯氰菊酯的半數(shù)致死濃度(LC50)。以殺死種群50%左右個(gè)體的選擇壓力配制殺蟲劑溶液，按前述制成藥膜，24 h后記錄死亡率并將存活個(gè)體作為下一代親本轉(zhuǎn)入正常飼養(yǎng)。每代用殺蟲劑進(jìn)行淘汰選擇前均進(jìn)行LC50測定，確定篩選劑量。

以丙酮為溶劑將高效氯氰菊酯配制成有效成分為0.05%的工作液。每次選取10頭羽化后7～14 d德國小蠊雄性成蟲，觀察擊倒情況，測定各品系試蟲半數(shù)擊倒時(shí)間(KT50)，記錄抗性發(fā)展情況。最后一次抗性篩選后，存活個(gè)體用PBO預(yù)處理，30 min后測定KT50，將最后擊倒的5只德國小蠊取出，液氮速凍后-70 ℃保存作為下一步提取DNA的實(shí)驗(yàn)材料，重復(fù)5次。

1.5 酶活測定

1.5.2細(xì)胞色素P450 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將標(biāo)準(zhǔn)品7-羥基香豆素加入緩沖液中，使終濃度為0～10 nmol/L，讀取激發(fā)波長為368/456 nm下的熒光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ethoxy-coumarin-O-deethylase，ECOD)活性測定：主要參照文獻(xiàn)方法(Hungetal.,1989；邱立紅等，1999)。1.5 mL反應(yīng)體系中包含0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)、150 mmol/L KCl、1 mmol/L EDTA、0.5 mL 0.02 mmol/L的乙氧香豆素(用緩沖液溶解)。加入10 μL 10 mmol/L NADPH 啟動反應(yīng)，34 ℃反應(yīng)1 min。

1.5.3谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 參照文獻(xiàn)方法(Habig，1981)，以CDNB為底物，采用900 μL體系，依次加入pH 6.5 0.1 mol/L磷酸緩沖液，30 mmol/L GSH，酶液，30 mmol/L CDNB。在340 nm處測定其光吸收值在5 min內(nèi)的變化(OD340/min)。每組樣品活性測定至少3個(gè)獨(dú)立重復(fù)，每次重復(fù)測定3次。

1.6 德國小蠊鈉離子通道ⅡS4～S6區(qū)擊倒抗性基因片段序列分析

引物設(shè)計(jì)：根據(jù)文獻(xiàn)(Dongetal.,1998)中報(bào)道的德國小蠊鈉離子通道擊倒抗性基因序列設(shè)計(jì)引物：forward primer(F)：5′-G G A T A T G C C G A G A T G G A A C T T T A C-3′，reverse primer(R)：5′-C C C T G A C C A A C C T G T G A A-3′。反應(yīng)體系：10×緩沖液5.0 μL，dNTPs 4.0 μL，上游(F)、下游(R)引物各2.0 μL，Pyrobest DNA Polymerase(5 U/μL)5 μL，模板2.5 μL，用無酶水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min；94℃50 s、56℃30 s、72 ℃ 1 min 50 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物直接測序，引物F、R用于產(chǎn)物的測序。

2 結(jié)果

2.1 德國小蠊對高效氯氰菊酯的抗藥性選育

高效氯氰菊酯對德國小蠊連續(xù)篩選10代后抗性增至約8倍(表1)。由表1可知F0～F1代初次用藥篩選后抗性增加較快，抗性倍數(shù)增加0.87。F1～F5代抗性倍數(shù)較均勻增加，平均每次用藥后抗性倍數(shù)增加0.41。F5～F7抗性上升緩慢，變化不大，但F7～F10抗性發(fā)展迅速，平均每次用藥后抗性倍數(shù)增加1.46。

表1 高效氯氰菊酯對德國小蠊的抗藥性選育

2.2 德國小蠊敏感品系和抗性品系CarE、細(xì)胞色素P450和GSTs比活力比較

以α-NA為底物對德國小蠊敏感和抗性品系羧酸酯酶活性進(jìn)行測定，測定結(jié)果顯示，抗性品系的羧酸酯酶比活力高于敏感品系，為敏感品系的2.02倍?？剐云废蹬c敏感品系比活力差異顯著(P<0.05)(表2)。德國小蠊成蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450的活性不是很高，但是抗性品系細(xì)胞色素P450比活力與敏感品系相比有所升高，為敏感品系的1.88倍，抗性品系與敏感品系細(xì)胞色素P450比活力差異顯著(P<0.05)(表2)。德國小蠊抗性品系GSTs 活性高于敏感品系，為敏感品系的2.70倍，抗性品系GSTs 比活力與敏感品系差異顯著(P<0.05)(表2)。

表2 德國小蠊敏感品系和抗性品系CarE、細(xì)胞色素P450和GSTs比活力比較

2.3 德國小蠊擊倒抗性基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果

將-70 ℃凍存保存的25只德國小蠊個(gè)體單只提取基因組DNA后進(jìn)行擊倒抗性基因型檢測，同時(shí)以25個(gè)敏感品系個(gè)體作為對照。測定結(jié)果顯示，共檢測出3種基因型，即SS(敏感純合)、抗性雜合(RS)和抗性純合(RR)(圖1)。敏感品系不攜帶有抗性基因，抗性品系100%攜帶抗性基因，其中抗性雜合子占到了56%，抗性純合子占到了44%(表3)。

表3 德國小蠊抗性等位基因檢測結(jié)果

圖1 德國小蠊kdr抗性的基因型種類

3 討論

本文在室內(nèi)連續(xù)篩選10代后，德國小蠊對高效氯氰菊酯的抗性倍數(shù)增至8.06倍，說明在殺蟲劑的選擇壓力下，室內(nèi)篩選和野外品系一樣抗性發(fā)展迅速。從篩選10代的結(jié)果來看，德國小蠊抗藥性的增加沒有明顯的規(guī)律性，后續(xù)還應(yīng)繼續(xù)篩選以發(fā)現(xiàn)抗性增加的規(guī)律以及獲得更高抗性的品系。

生理、生化過程的改變是導(dǎo)致害蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的主要機(jī)制之一，其變化的程度決定著害蟲的抗性水平。昆蟲體內(nèi)解毒酶的量變和質(zhì)變是昆蟲對化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗性的重要原因之一(韓曉莉等，2017)。本文研究結(jié)果顯示，德國小蠊抗性品系CarE活性顯著高于敏感品系，說明CarE活性水平的提高可能是德國小蠊產(chǎn)生抗性的原因之一。

德國小蠊抗性品系的P450酶系中ECOD比活力高于敏感品系,這表明德國小蠊對高效氯氰菊酯產(chǎn)生的抗性可能與P450介導(dǎo)的解毒代謝作用具有一定的關(guān)系。上述結(jié)果與對抗擬除蟲菊酯蠅(Leeetal.,1989)、銅綠蠅(Kotze, 1993)以及小菜蛾(李衛(wèi)民等，1997)的研究結(jié)果相似。但是本實(shí)驗(yàn)中只測定了P450酶系中ECOD一種組分的活性，其他組分也可能參與了P450酶的代謝抗性。不同的殺蟲劑可能使細(xì)胞色素P450酶系的不同組分或者不同的P450同工酶的表達(dá)上升，而對另一些組分沒有影響或使其受到抑制。P450酶系各組分對不同類型殺蟲劑的抗性分子機(jī)理可能也不一樣，它們之間可能共同作用導(dǎo)致抗性的產(chǎn)生。

從德國小蠊本身GSTs的生物學(xué)特性研究抗藥性的產(chǎn)生機(jī)制及其影響因素，對加強(qiáng)抗性監(jiān)測及尋找克服或延緩抗性發(fā)展的有效方法具有重要意義。許多研究證據(jù)已表明，昆蟲對殺蟲劑的抗性與GSTs對CDNB(或DCNB)的高活性有關(guān)。如草地粘蟲的幾個(gè)田間品系對擬除蟲菊酯、有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的抗性與GSTs對CDNB和DCNB的活性增加有關(guān)(Yu, 1992)。表2的結(jié)果顯示北京地區(qū)德國小蠊野外種群GSTs的比活力普遍高于敏感品系，表明GSTs對底物的催化能力提高，從而加快對有毒物質(zhì)的排泄，降低其毒性進(jìn)而參與抗性形成?？剐云废刁w內(nèi)GSTs的活性要顯著高于敏感品系，其分子機(jī)制可能是由于GSTs基因擴(kuò)增或者表達(dá)量上調(diào)，或GSTs序列的活性位點(diǎn)突變等原因。

目前，生物測定法對于害蟲防治效果的預(yù)測和評估仍然是十分必要的。本文用PBO預(yù)處理試蟲，抑制德國小蠊部分解毒酶的活性(Youngetal., 2005)，從而得到擊倒抗性更強(qiáng)的試蟲，再通過分子生物學(xué)檢測法檢測出其攜帶的抗性基因類型，這對于能鑒別出一個(gè)表現(xiàn)型為敏感卻攜帶有大量抗性基因的雜合子的種群尤其重要。因?yàn)榭剐曰蝾l率與擬除蟲菊酯的媒介生物控制效果密切相關(guān)，又因?yàn)閗dr抗性突變具有多樣性，所以對一些抗性機(jī)制復(fù)雜的種群，在使用由單點(diǎn)突變設(shè)計(jì)的分子診斷方法時(shí)，可能抗性水平相同，kdr基因頻率卻不完全相同(Soderlund, 2003)。本文以德國小蠊為研究對象，研究了鈉離子通道基因選擇對抗性表型的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性品系個(gè)體中均存在kdr點(diǎn)突變，因此，德國小蠊抗性的產(chǎn)生可能與kdr基因的定向選擇相關(guān)。