羅勇為，唐林波，張平軍

(1廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣東廣州510316；2廣東省綠色制糖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510316；3桂林萊茵生物科技股份有限公司，廣西桂林541004；4桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西桂林541200)

0 引言

甘蔗糖蜜色素是由甘蔗中原有色素和在制糖過(guò)程中形成的色素2部分組成，包括酚類色素、焦糖色素、美拉德色素和己糖堿性降解色素等，并最終將絕大部分累積于糖蜜中，因此，甘蔗糖蜜色素是含有多種色素成分的混合色素[1]。這些色素具有高附加值，其中焦糖色素廣泛應(yīng)用于釀造、焙烤、糖果、飲料等行業(yè)，作為食品添加劑，具有色、香、味的強(qiáng)化功能且食用安全[2]。美拉德色素和酚類色素則具有抗氧化作用，同時(shí)還具有耐高溫等特點(diǎn)。從糖蜜中分離出色素是目前開(kāi)發(fā)利用糖蜜資源重要的課題[3]。

甘蔗糖蜜中的弱極性色素濃度高、種類多、分子量分散，給色素回收及精制造成很大的困難，相關(guān)研究者對(duì)此已作了多方面的研究[1,4-5]，如有活性炭吸附法、膜分離法、樹(shù)脂法等。其中，活性炭吸附法和膜分離法用于制糖脫色單元成本較高；樹(shù)脂法相比活性炭法和膜分離法更經(jīng)濟(jì)，具有較高的脫色性能，但樹(shù)脂不易再生且產(chǎn)生大量再生廢液。

超臨界流體萃取(Supercritical Fluid Extraction，SFE)是近代化工分離中出現(xiàn)的高新技術(shù)，將傳統(tǒng)的蒸餾和有機(jī)溶劑萃取結(jié)合一體[6-9]。通過(guò)改變壓力或溫度使超臨界流體的密度大幅改變。在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地依次把極性大小、沸點(diǎn)高低和相對(duì)分子質(zhì)量大小不同的成分萃取出來(lái)。超臨界CO2具有類似氣體的擴(kuò)散系數(shù)、液體的溶解力，表面張力為 0，能迅速滲透進(jìn)固體物質(zhì)之中，提取其精華，具有高效、不易氧化、純天然、無(wú)化學(xué)污染等特點(diǎn)。目前，采用超臨界流體萃取技術(shù)提取甘蔗糖蜜色素的相關(guān)研究較少，本研究旨在對(duì)甘蔗糖蜜中色素類物質(zhì)最佳萃取工藝條件和其抗氧化活性等方面進(jìn)行研究，為未來(lái)的規(guī)模化生產(chǎn)提供理論支持和現(xiàn)實(shí)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

濃縮的甘蔗糖蜜固形物含量約88%，取于廣東某糖廠；2，2-二苯基-1-三硝基苯肼(DPPH)，購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；CO2，純度＞99.9%，購(gòu)于廣州嘉堯氣體科技有限公司；無(wú)水乙醇等其它試劑，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器

SFE221-50-06型超臨界二氧化碳流體萃取儀，海安超臨界萃取儀器有限公司；LYOQUEST-55型冷凍干燥機(jī)，西班牙Telstar公司；TU-1901型紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BSA223S型分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；FlowMem0015型微孔濾膜設(shè)備，廈門(mén)福美科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超臨界二氧化碳萃取的工藝條件

取100.0 g濃縮的甘蔗糖蜜物料，加入10.0 g粒徑為2 mm的玻璃珠，置于1 L萃取釜中，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇夾帶劑種類、夾帶劑用量、萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間以及二氧化碳流量等因素，然后，在45℃條件下，將萃取的色素依次經(jīng)過(guò)蒸發(fā)濃縮和冷凍干燥，測(cè)定色率、紅色指數(shù)及抗氧化活性等相關(guān)指標(biāo)[10-11]，研究分析超臨界二氧化碳萃取甘蔗糖蜜中色素的工藝。

實(shí)驗(yàn)單因素水平如下：夾帶劑種類分別為乙醇、乙酸乙酯；夾帶劑質(zhì)量濃度為 90%、80%、70%、60%、50%；萃取溫度為 25、35、45℃；萃取壓力為15、20、25、30、35 MPa；萃取時(shí)間為30、60、90、120、150 min；二氧化碳流速為15、20、25、30 L/h。

1.3.2 色率的測(cè)定

色率(或色價(jià))，它表示該提取樣品顏色的深淺，可決定其在食品及飲料中的添加量。色率的測(cè)定：準(zhǔn)確稱量1.00 g固體色素，以蒸餾水溶解，定容至1000 mL，然后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)測(cè)定樣品的吸光值A(chǔ)610nm，平行3次，取平均值A(chǔ)1，計(jì)算EBC色度：

EBC單位的定義：稀釋定量濃度的樣品在波長(zhǎng)610 nm下的吸光值為0.076，其色率為20000 EBC單位。

1.3.3 紅色指數(shù)的測(cè)定

紅色指數(shù)又稱色調(diào)，是表示色素中紅色物質(zhì)含量多少的一個(gè)量，它表示了色素的色澤，該數(shù)值越高，所含紅色物質(zhì)越多，其成品顏色亦越紅。紅色指數(shù)的測(cè)定：將上述1.3.2節(jié)的樣品，用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)測(cè)定樣品的吸光值A(chǔ)610nm及A510nm，平行3次，計(jì)算平均值分別為A1、A2，紅色指數(shù)計(jì)算公式如下：

1.3.4 抗氧化能力的測(cè)定

DPPH法廣泛用于定量測(cè)定抗氧化能力。樣品DPPH自由基清除率的測(cè)定：取一定量的提取物，加入70%(V/V)的乙醇溶液后定容至100 mL，配成含萃取物的量為 20 ug/mL的樣液。稱取 20 mg DPPH，用無(wú)水乙醇定容至250 mL，濃度為2×10-4mg/L的DPPH乙醇溶液。分別吸取樣品溶液2 mL，加入DPPH乙醇溶液(2×10-4mg/L) 2 mL，搖勻后避光反應(yīng)處置30 min，用分光光度計(jì)測(cè)定517 nm處的吸光度A樣品。同時(shí)，測(cè)定樣品溶液2.0 mL與乙醇2.0 mL混合液在517 nm處的吸光度A空白，再測(cè)定1.0 mL DPPH溶液與1.0 mL乙醇混合液在517 nm處的吸光度A對(duì)照。同一樣品重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 夾帶劑種類對(duì)萃取色素的影響

常用的超臨界二氧化碳流體萃取夾帶劑有甲醇、乙醇及乙酸乙酯等，它們的極性從高至低的排序?yàn)椋杭状迹疽掖迹疽宜嵋阴?。由于甲醇具有中等毒性，所以選擇乙醇和乙酸乙酯進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。夾帶劑∶色素按質(zhì)量比為4∶1的比例混合，移至萃取釜，具體的萃取實(shí)驗(yàn)條件為：二氧化碳流速設(shè)為20 L/h，萃取溫度為35℃，萃取壓力為20 MPa，萃取60 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1所示。

根據(jù)圖1中數(shù)據(jù)，無(wú)添加夾帶劑(空白)和添加乙醇、乙酸乙脂夾帶劑萃取的色素色率分別為21000、29000、28500 EBC單位，色素的紅色指數(shù)分別為2.68、1.76、2.02。無(wú)添加夾帶劑(空白)與添加夾帶劑對(duì)比，添加夾帶劑萃取的色素色率顯著升高，而其紅色指數(shù)明顯降低。乙醇夾帶劑萃取產(chǎn)品的色率比乙酸乙酯萃取產(chǎn)品色率高500 EBC單位，表明乙醇夾帶劑萃取而得的有色物質(zhì)比乙酸乙酯多，且乙醇夾帶劑萃取而得的有色物質(zhì)DPPH自由基清除率達(dá)到74.2%(見(jiàn)表1)。在紅色指數(shù)方面，乙酸乙酯萃取色素比乙醇萃取色素高 12.9%。為提取糖蜜中有色物質(zhì)，選擇乙醇夾帶劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 夾帶劑種類對(duì)萃取色素的影響

表1 不同夾帶劑對(duì)色素DPPH值的影響

2.2 夾帶劑濃度對(duì)萃取色素的影響

夾帶劑濃度變化，可影響萃取流體的極性。乙醇夾帶劑∶色素按質(zhì)量比依次為9∶1、4∶1、7∶3、3∶2、1∶1的比例混合，即乙醇夾帶劑的質(zhì)量濃度分別是90%、80%、70%、60%、50%，分別移至萃取釜，具體的萃取實(shí)驗(yàn)條件為：二氧化碳流速設(shè)為20 L/h，萃取溫度為35℃，萃取壓力為20 MPa，萃取60 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2所示。由圖2中可知，乙醇夾帶劑的質(zhì)量濃度分別是 90%、80%、70%、60%、50%時(shí)，萃取色素的色率為 79800、28900、31000、40500、31600 EBC單位，萃取色素的紅色指數(shù)為 3.89、1.75、1.72、1.68、1.02。當(dāng)乙醇夾帶劑質(zhì)量濃度為 90%～60%時(shí)，隨著夾帶劑含量的減少，色率呈逐步上升趨勢(shì)，而當(dāng)夾帶劑質(zhì)量濃度為50%時(shí)，萃取產(chǎn)品的色率顯著下降，表明夾帶劑質(zhì)量濃度為60%時(shí)，最適合萃取糖蜜色素中的有色物質(zhì)。乙醇夾帶劑質(zhì)量濃度用量為90%時(shí)，紅色指數(shù)為3.89，但當(dāng)乙醇夾帶劑質(zhì)量濃度少于80%，紅色指數(shù)均在1.80以下。為提取糖蜜中有色物質(zhì)，選擇 乙醇夾帶劑質(zhì)量濃度為60%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 夾帶劑濃度對(duì)萃取色素的影響

2.3 溫度對(duì)萃取色素的影響

夾帶劑溫度變化導(dǎo)致二氧化碳的密度變化，可影響萃取流體的極性，為了避免萃取溫度過(guò)高導(dǎo)致發(fā)生反應(yīng)而影響萃取色素質(zhì)量和抗氧化活性，選擇25～45℃范圍進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。乙醇夾帶劑∶色素按質(zhì)量比為3∶2的比例混合3份，分別移至萃取釜，具體的萃取實(shí)驗(yàn)條件為：萃取溫度分別為25、35、45℃，萃取壓力為20 MPa，萃取時(shí)間為60 min，二氧化碳流速設(shè)為20 L/h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3所示。由圖3中數(shù)據(jù)可知，萃取溫度分別是25、35、45℃時(shí)，萃取色素的色率為40700、40400、43600 EBC單位，萃取色素的紅色指數(shù)為1.62、1.70、1.89。在實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，萃取色素產(chǎn)品的色率及紅色指數(shù)，隨著溫度的升高而升高。表明萃取溫度增加，則被萃取溶質(zhì)的揮發(fā)性能力和擴(kuò)散系數(shù)也會(huì)增加。因此選取最優(yōu)萃取溫度為45℃。

圖3 萃取溫度對(duì)萃取色素的影響

2.4 萃取壓力對(duì)萃取色素的影響

乙醇夾帶劑∶色素按質(zhì)量比為 3∶2的比例混合4份，分別移至萃取釜，具體的萃取實(shí)驗(yàn)條件為：萃取溫度為45℃，萃取壓力分別為15、20、25、30、35 MPa，萃取時(shí)間為60 min，二氧化碳流速設(shè)為20 L/h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4所示：根據(jù)圖4可知，在萃取壓力為15～30 MPa范圍時(shí)，隨萃取壓力的增加，萃取產(chǎn)品的色率和紅色指數(shù)隨之增加：萃取壓力為15 MPa時(shí)取得最小值，色率為34300 BEC單位、紅色指數(shù)為1.85；萃取壓力位30 MPa時(shí)達(dá)到最大值，色率為44760 EBC單位、紅色指數(shù)為2.02。這是由于在一定壓力范圍內(nèi)，萃取壓力越大，萃取流體二氧化碳的密度越大，被萃取物的溶解度越大。而當(dāng)萃取壓力位35 MPa時(shí)，萃取產(chǎn)品的色率和紅色指數(shù)顯著下降，色率降至 14500 EBC單位、紅色指數(shù)為1.08。

另外，根據(jù)圖5，DPPH自由基清除率先升后降，在30 MPa左右達(dá)到最大值，壓力高于30 MPa后，DPPH自由基清除率有所下降。在一定的壓力范圍內(nèi)，壓力的增大，使超臨界二氧化碳流體的密度增大，利于色素成分的提取，但是，超臨界二氧化碳流體的擴(kuò)散系數(shù)隨壓力的增大而減小，不利于活性色素成分的提取?？紤]成本等各方綜合因素，選擇萃取壓力為25 MPa。

圖4 萃取壓力對(duì)萃取色素的影響

圖5 萃取壓力對(duì)色素DPPH值的影響

2.5 萃取時(shí)間對(duì)萃取色素的影響

乙醇夾帶劑∶色素按質(zhì)量比為 3∶2的比例混合4份，分別移至萃取釜，具體的萃取實(shí)驗(yàn)條件為：萃取溫度為45℃，萃取壓力為25MPa，萃取時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min，二氧化碳流速設(shè)為20 L/h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6所示。由圖6中數(shù)據(jù)可知，萃取時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min時(shí)，萃取色素的色率為21000、44100、47000、48100、48900 EBC單位，萃取色素的紅色指數(shù)為2.48、2.01、1.96、1.93、1.82?？梢钥闯觯弘S著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，色素色率在前期增長(zhǎng)速率很快，但當(dāng)萃取時(shí)間大于90 min時(shí)，糖蜜色素的色率變化速率趨于平緩；另外，萃取產(chǎn)品的紅色指數(shù)，隨著萃取時(shí)間的增加而降低。綜上所述，為節(jié)約能源以及流體成本，選用最優(yōu)的萃取時(shí)間是90 min。

2.6 二氧化碳流速對(duì)萃取色素的影響

圖6 萃取時(shí)間對(duì)糖蜜色素的影響

乙醇夾帶劑∶色素按質(zhì)量比為 3∶2的比例混合4份，分別移至萃取釜，具體的萃取實(shí)驗(yàn)條件為：萃取溫度為45℃，萃取壓力為25 MPa，萃取時(shí)間分別為90 min，二氧化碳流速分別為15、20、25、30 L/h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7所示。由圖7中數(shù)據(jù)可知，二氧化碳流速分別為15、20、25、30、35 L/h時(shí)，萃取色素的色率為 29800、46900、49760、50100、50250 EBC單位，萃取色素的紅色指數(shù)為2.07、1.97、1.83、1.62、1.32。結(jié)果表明：二氧化碳流速范圍為 15～25 L/h時(shí)，產(chǎn)品色率的增加速率較快，而當(dāng)二氧化碳流速高于25 L/h時(shí)，萃取產(chǎn)品的色率變化不明顯，推測(cè)是因?yàn)檩腿∫呀咏K點(diǎn)，增加二氧化碳的流速對(duì)增加被萃取物萃取效果不顯著；萃取色素的紅色指數(shù)隨著二氧化碳流速的增加而降低。

另外，由圖8可知，在二氧化碳流速為15～25 L/h時(shí)，DPPH自由基清除率較快速的升高；在二氧化碳流速為25～35 L/h時(shí)，色素類化合物的活性基本保持穩(wěn)定?？紤]設(shè)備維護(hù)成本等因素，選取二氧化碳流速的最優(yōu)水平為25 L/h。

綜上所述，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果得最佳工藝條件為：乙醇夾帶劑質(zhì)量濃度60%、萃取溫度為45℃、萃取壓力為25 MPa、萃取時(shí)間為90 min以及二氧化碳流量25 L/h，此條件下，超臨界二氧化碳萃取甘蔗糖蜜中的色素總量為2.83%、色率為49570 EBC單位、紅色指數(shù)為1.85，此色素對(duì)DPPH自由基清除率為76.2%。

圖7 二氧化碳流速對(duì)糖蜜色素的影響

圖8 二氧化碳流速對(duì)色素DPPH值的影響

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，選擇確定夾帶劑種類、夾帶劑用量、萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間以及二氧化碳流量等因素的最優(yōu)取值范圍。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得最佳工藝條件為：乙醇夾帶劑質(zhì)量濃度60%、萃取溫度為45℃、萃取壓力為25 MPa、萃取時(shí)間為90 min以及二氧化碳流量 25 L/h，此條件下試驗(yàn)超臨界二氧化碳萃取甘蔗糖蜜中的色素總量為 2.83%、色率為49570 EBC單位、紅色指數(shù)為1.85，此色素對(duì)DPPH自由基清除率為76.2%。超臨界二氧化碳萃取技術(shù)是利用極性的差異將糖蜜中低極性色素成分萃取出來(lái)，結(jié)果表明：采用此方法能在低溫下高效提取糖蜜中油溶性色素，且能保護(hù)活性成分不受破壞，具有良好的抗氧化活性。研究結(jié)果可為資源化利用糖蜜中色素提供理論和技術(shù)依據(jù)。