齊明明，李建洋，劉憲華，邵宗澤

(1.天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300387； 2.自然資源部第三海洋研究所、自然資源部海洋遺傳資源重點實驗室、福建省海洋遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005)

海洋中存在各種來源的天然有機物，是一個巨大的碳庫，在全球碳循環(huán)中起著決定性作用[1-2]。海洋中有機物的礦化是全球碳循環(huán)的一個中心過程，影響著全球海洋生態(tài)系統(tǒng)與全球氣候的變化走勢[3]，而各種微生物通過對有機物的分解代謝在這一過程中發(fā)揮著重要作用[4]。前人對海洋水體環(huán)境中由生物的碎片、糞球和細胞外多糖所聚集形成的懸浮顆粒物及其附著的異養(yǎng)細菌有較多研究[4]，然而對動植物組織及其大分子進入海洋環(huán)境中與微生物的相互作用研究不多。目前從海洋環(huán)境中分離得到的常見有機物降解菌多為好氧細菌，包括海桿菌屬(Marinobacter)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、產(chǎn)氣單胞菌屬(Aeromonas)、弧菌屬(Vibrio)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonas)等[5]，種類多樣性較高。然而，有機物降解過程中消耗大量氧氣造成有機物局部微環(huán)境缺氧，海洋沉積物等厭氧環(huán)境下有機物降解菌的多樣性還有待進一步研究。

本實驗通過選取不溶于水的代表性天然有機物，于近海沉積物與海水表層環(huán)境中進行降解菌原位富集。底物包括魚鱗、蝦殼、海帶葉片、幾丁質(zhì)和殼聚糖，其中魚鱗、蝦殼和海帶葉片是從海洋中有機體脫落下來的以生物高分子聚合物為主要成分的生物組織；而幾丁質(zhì)和殼聚糖是海洋甲殼類外骨骼的重要成分，在海洋中含量豐富，但較難降解。據(jù)報道，實驗室分離得到的魚鱗降解菌多為芽孢桿菌類，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[6]、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)[7]等；海洋幾丁質(zhì)降解菌有粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、 環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、交替單胞菌屬(Alteromonas)等[8]；海洋殼聚糖降解的細菌主要來源于芽孢桿菌屬[9-11]、鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬[12]、微桿菌屬(Microbacterium)[13]，此外還有曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)[12]、青霉屬(Penicillium)[14]等真菌；海帶降解菌有芽孢桿菌屬[15-16]、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)[17]等。

目前有機物的降解菌主要通過實驗室好氧條件培養(yǎng)分離得到，而在海洋原位環(huán)境下，有哪些細菌真正參與了這些有機物的降解與礦化還不清楚。本研究結(jié)果將有助于我們認識難降解大分子天然有機物在近海環(huán)境下的微生物礦化過程，為分析有機物礦化與海洋碳循環(huán)提供參考。

1 材料與方法

1.1 近海原位培養(yǎng)

以魚鱗、海帶葉片、蝦殼、幾丁質(zhì)和殼聚糖為有機底物，分別取1.5 g樣品裝入50 cm3離心管，用300目紗絹封口，高溫120 ℃滅菌20 min后分別布放于廈門觀音山潮間帶(24.50°N，118.21°E)海水表層和沉積物兩種環(huán)境中，將離心管分別固定在懸浮繩索或埋藏在沉積物表層下10 cm處，每組設(shè)置3個平行。原位富集30 d后，于2018年9月1日取回實驗室，經(jīng)過孔徑為0.22 μm的聚碳酸酯膜(直徑為47 mm)采用負壓過濾的方法將微生物富集樣品收集到濾膜上[18]。過濾完成之后迅速將濾膜于-80 ℃保存，30 d內(nèi)完成 DNA 樣品的提取。

1.2 富集菌群的基因組DNA提取和16S rRNA基因的高通量測序

將采集的濾膜樣品剪碎研磨，按照DNA提取試劑盒(上海賽百勝基因技術(shù)有限公司)的步驟說明進行DNA提取。利用NanoDrop 2000核酸測定儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]測定樣品DNA濃度。限于實驗條件，選取每組平行樣品中高濃度的DNA樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序，細菌引物為338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，進行雙端測序。經(jīng)過序列篩選后，從10個環(huán)境樣本中共獲得590 708條序列和326 100個分類操作單元(Operational Taxonomic Unit， OTU,通常對大于97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，各樣本序列數(shù)范圍為43 660～72 433條，平均每個樣本約59 071條序列。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

為保證后續(xù)數(shù)據(jù)的準確性，對高通量測序得到的數(shù)據(jù)進行質(zhì)控分析得到去掉 Barcode的Clean數(shù)據(jù)。利用USEARCH軟件[19]對序列進行拼接去重復(fù)，將相似度大于97%的物種聚類為1個OTU。通過Greengene數(shù)據(jù)庫對所得到的OTU進行分類比對，利用Mothur軟件[20]對序列進行抽平計算α-多樣性指數(shù)Sobs、Shannon、Simpson、Ace、Chao和Coverage。在不同分類學(xué)水平上對樣品進行主成分分析，繪制相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 天然有機物原位富集樣品30 d后表觀描述

樣品原位富集30 d后，沉積物環(huán)境下離心管中充滿黑色液體，有刺鼻的硫化氫氣味；水上環(huán)境下離心管中液體渾濁，不同環(huán)境下底物均有剩余。

2.2 天然有機物原位富集降解菌群的細菌α-多樣性分析

通過高通量測序，共獲得兩種環(huán)境5種有機底物的10個富集菌的16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)，通過α-多樣性分析獲得多樣性指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果(表1)?？梢钥闯?，所有樣品的序列Coverage值均在0.99以上，說明測序數(shù)據(jù)有效可靠。由表1中Sobs、Chao、Ace指數(shù)顯示，兩種環(huán)境下不同有機物原位富集的物種豐度和多樣性存在明顯的差異。水體環(huán)境富集樣品的物種豐富度明顯高于沉積物環(huán)境。推測相對于水體富集物，沉積物樣品中各種有機物在第30天優(yōu)勢降解菌群得到更顯著的富集。

表1 大于97%相似水平下不同樣品的α-多樣性指數(shù)Tab.1 α-diversity indexes at more than 97% similarity level in different samples

續(xù)表1

2.3 各種原位富集物的細菌群落組成

從OTU 聚類結(jié)果來看，本次實驗共得到45個門，95個綱，214個目，360個科，598個屬。其中占比較高的細菌門分別是：變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和熱袍菌門。沉積物環(huán)境下海帶葉片樣品中占比最大的為熱袍菌門，占總細菌的比例為50.87%，而在其他所有富集樣品中，變形菌門占有絕對優(yōu)勢，占總細菌的比例分別為：①海水表層環(huán)境中，魚鱗：57.49%、海帶葉片：54.08%、殼聚糖：33.27%、幾丁質(zhì)：25.33%、蝦殼：30.71%；②沉積物環(huán)境中，幾丁質(zhì)：70.69%、蝦殼：38.44%、殼聚糖：35.38%、魚鱗：32.51%、海帶葉片：24.80%。沉積物海帶葉片富集樣品中的OTU數(shù)目僅為470，物種組成明顯較低。

在綱水平上，各樣品中細菌組成差異較大，如圖1所示。在沉積物中，除海帶葉片富集菌群中的優(yōu)勢菌群為熱袍菌綱外，其他均為δ-變形菌綱。在海水中，海帶葉片、魚鱗富集菌的優(yōu)勢類群為γ-變形菌綱。擬桿菌綱在殼聚糖和蝦殼樣品中占比較大，而Modulifexia綱是幾丁質(zhì)富集樣品的優(yōu)勢類群，占比達到18.70%，但在其他樣品中占比均比較低。

圖1 廈門近岸海水與沉積物中大分子聚合物原位富集過程中細菌在綱水平上的群落結(jié)構(gòu)Fig.1 Community structure of bacteria at the class level during in situ enrichment of macromolecules in nearshore seawater and sediments of Xiamen水體：HDW表示海帶葉片，JDZW表示幾丁質(zhì)，KJTW表示殼聚糖，XKW表示蝦殼，YLW表示魚鱗；沉積物：HDS表示海帶葉片，JDZS表示幾丁質(zhì)，KJTS表示殼聚糖，XKS表示蝦殼，YLS表示魚鱗,下同。

2.4 不同有機物富集菌群群落間相似性分析

基于OTU水平構(gòu)建物種相似樹圖(圖2)，同一種有機物，海水表層與沉積物環(huán)境中富集菌群結(jié)構(gòu)差異較大。不同底物樣品，海水表層環(huán)境富集樣品OTU組成雖然也有較大差異，但傾向于匯集一起。

圖2 基于OTU的樣品間聚類關(guān)系樹Fig.2 Similarity tree based on OTU samples

幾丁質(zhì)和殼聚糖樣品無論是海水表層還是沉積物環(huán)境中，相似性都最高。沉積物環(huán)境中它們以δ-變形菌綱為優(yōu)勢菌綱(>20%)，在海水表層環(huán)境中，γ-變形菌綱為優(yōu)勢菌綱(>20%)，沉積物中海帶葉片樣品與其他樣品差別較大。

在屬水平構(gòu)建相似性熱圖(圖3)，其中色塊顏色梯度來展示樣本中不同物種的占比變化情況?？傮w上看，在所有樣品中脫硫桿菌屬(Desulfobacter)是優(yōu)勢菌屬；而弧菌屬在沉積物樣品殼聚糖和幾丁質(zhì)中占比較高，其中幾丁質(zhì)樣品中占比高達26.21%，表明其參與了幾丁質(zhì)降解。比較不同環(huán)境下幾丁質(zhì)樣品在屬水平上群落組成發(fā)現(xiàn)，沉積物環(huán)境下弧菌含量明顯高于海水表層環(huán)境，推測沉積物環(huán)境下的條件更有利于弧菌的活性。在目前研究中，莫照蘭等(2000)在蝦池中篩選出了高效降解菌Vibriospp.[21]，肖湘等(2003)分離得到了幾丁質(zhì)高效降解弧菌Vibriosp.11211[22]，暗示了弧菌菌株可能高效地降解幾丁質(zhì)同時研究發(fā)現(xiàn)弧菌可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)，獲得生長所需碳源和氮源[23]。本研究通過近海原位培養(yǎng)，證明弧菌在自然海洋環(huán)境中是幾丁質(zhì)的重要分解者。

2.5 不同環(huán)境下細菌群落差異性分析

在科水平上，采用“Wilcoxon秩和檢驗”雙尾檢驗方法，比較兩種環(huán)境下，全部樣品的菌落差異，如圖4所示，不同環(huán)境下種群分布和占比存在較大差異，其中在脫硫弧菌科、黃桿菌科、弧菌科和紅細菌科存在顯著差異(0.01

圖4 不同環(huán)境組間群落科水平上占比顯著性差異檢驗Fig.4 Tests for significant differences in compositions between different environmental groups at the family level“*”表示0.01

為了進一步比較不同環(huán)境下樣品群落結(jié)構(gòu)組成，選擇幾丁質(zhì)樣品，比較其在不同環(huán)境下科水平上菌落組成差異，結(jié)果如圖5所示。得到不同環(huán)境下，群落組成和占比存在極顯著差異(p<0.001)。

圖5 不同環(huán)境下幾丁質(zhì)樣品科水平上菌群比較 Fig.5 Comparison of microbial communities in chitin samples from different habitats at the family level“***”表示p<0.001，樣品中菌群差異性極顯著；圖中綠色代表沉積物環(huán)境下的幾丁質(zhì)樣品，紅色代表海水表層環(huán)境下的幾丁質(zhì)樣品。

2.6 討論

海洋細菌在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)重要的地位[24]，在海洋微食物網(wǎng)、有機物礦化與元素生物地球化學(xué)循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用。本研究通過利用不同天然有機物在近海環(huán)境中原位富集、高通量DNA測序，認識近海原位環(huán)境下海洋來源的高聚物降解菌多樣性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是海水表層還是沉積物環(huán)境富集物中，厭氧降解菌與好氧降解菌并存。從多樣性上看，海水表層富集物高于沉積物。在海水表層環(huán)境富集樣品中，黃桿菌科細菌占比較大，而沉積物樣品中脫硫桿菌科細菌為優(yōu)勢種。樣品在沉積物中埋藏7 d后，顏色明顯變黑，產(chǎn)生濃厚的硫化氫氣體，表明各種有機物厭氧降解過程耦合著硫酸鹽還原；而在海水表層，推測初期的好氧環(huán)境，隨著降解過程推進，也會導(dǎo)致樣品內(nèi)部缺氧。黃桿菌是擬桿菌門中最大的科，多為好氧，少量是微好氧與厭氧[25]。其中Kaoutari等(2013)在動物腸道菌群中發(fā)現(xiàn)，部分擬桿菌門細菌編碼較多糖苷水解酶和多糖裂解酶的基因，暗示該類微生物參與了多糖類有機物的降解[26]，陳三鳳等(1993)發(fā)現(xiàn)了1株可降解幾丁質(zhì)的黃桿菌B1[27]。脫硫桿菌菌株為嚴格厭氧，可以將有機物氧化成CO2，本研究中在沉積物富集樣品中，脫硫桿菌菌株作為優(yōu)勢菌之一，推測它們參與了有機物的降解。在沉積物富集中的蝦殼和魚鱗富集樣品，梭菌科占有絕對優(yōu)勢，其次為脫硫桿菌科。梭菌科為發(fā)酵型專性厭氧革蘭氏陰性桿菌，可以發(fā)酵有機物，產(chǎn)生各種有機酸，如乙酸、丙酸、丁酸、甲酸或琥珀酸[28]。魚鱗和蝦殼被梭菌科細菌降解發(fā)酵后，產(chǎn)生的有機酸可能為脫硫桿菌提供電子供體，也可能脫硫桿菌直接參與了蝦殼和魚鱗的厭氧降解。

本實驗通過對不同天然大分子有機聚合物原位富集30 d，得到不同有機物菌群組成和占比差異明顯，例如幾丁質(zhì)樣品在沉積物和海水表層環(huán)境下占比最大的分別為弧菌科；沉積物環(huán)境下，脫硫弧菌科在不同樣品中占比較大，推測可能在原位富集有機物降解中發(fā)揮較大的作用，但所占的比例差異明顯。同時結(jié)合現(xiàn)有研究報道[26-28]，原位條件下參與有機物降解的細菌與實驗室得到結(jié)果也存在一定差異。

3 結(jié)論

為研究在原位環(huán)境下參與有機物降解的菌群種類，本實驗選取蝦殼、魚鱗、海帶葉片、幾丁質(zhì)和殼聚糖作為有機底物，分別在海水表層和沉積物中進行富集，定期取樣，通過高通量測序分析菌群多樣性。得出不同富集環(huán)境下不同底物菌群結(jié)構(gòu)、物種多樣性存在較大差異，本研究分析結(jié)果可為研究有機物的礦化提供一定的理論依據(jù)。