張雅夢 宋敬卉 朱曉巖 孫雪純 程雨菲 馬愛軍

[摘要] 目的 分析一個早發(fā)型家族性阿爾茨海默?。ˋD）家系的大腦葡萄糖代謝特點并明確其基因診斷。方法 收集并分析該家系成員的臨床資料，對該家系中現(xiàn)存活的4例病人進行18F-FDG PET腦顯像，分析其大腦葡萄糖代謝特點，應(yīng)用二代測序及Sanger測序方法檢測早老素蛋白1（PSEN1）基因突變位點。結(jié)果 AD病人大腦葡萄糖代謝特點為雙側(cè)額葉、顳頂聯(lián)合皮質(zhì)區(qū)、顳葉外側(cè)部及皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)的代謝減低。Sanger測序發(fā)現(xiàn)此家系攜帶PSEN1基因突變（c.417G>c，p.M139I），為錯義突變。結(jié)論 本研究在中國人群中首次報道了PSEN1基因p.M139I位點突變，擴大了PSEN1基因突變譜，該位點突變可能導(dǎo)致早發(fā)型家族性AD。

[關(guān)鍵詞] 阿爾茨海默病;早老素1;突變;大腦;葡萄糖代謝障礙;氟脫氧葡萄糖F18Symbol`@@

[中圖分類號] R745.7;R394 ?[文獻標(biāo)志碼] A ?[文章編號] 2096-5532（2020）06-0662-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.150 [開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200714.1202.002.html;

[ABSTRACT] Objective To investigate the features of cerebral glucose metabolism and genetic diagnosis of a family with early-onset familial Alzheimer disease （AD）. Methods Clinical data were collected from the members of this family， and 18F-FDG PET brain imaging was performed for the four surviving patients in this family to analyze the features of cerebral glucose metabolism. Next-generation sequencing and Sanger sequencing were used to detect the mutation sites of the presenilin 1 （PSEN1） gene. Results The features of cerebral glucose metabolism were reductions in metabolism in the bilateral frontal lobes， the temporoparietal cortex， the lateral temporal lobe， and the subcortical structure in the patients with AD. Sanger sequencing showed that this family carried a missense mutation of the PSEN1 gene （c.417G>C， p.M139I）. Conclusion This study reports the p.M139I mutation of the PSEN1 gene in the Chinese population for the first time， which expands the mutation spectrum of the PSEN1 gene， and mutation at this site may lead to early-onset familial AD.

[KEY WORDS] Alzheimer disease; presenilin-1; mutation; cerebrum; glucose metabolism disorders; fluorodeoxyglucose F18

阿爾茨海默?。ˋD）是老年癡呆最常見的類型，其特征是記憶和其他認知領(lǐng)域的進行性損傷[1]。以發(fā)病年齡65歲為界，可以分為早發(fā)型AD（EOAD）和晚發(fā)型AD（LOAD），其中EOAD是常染色體顯性遺傳病，占AD的2%～10%[2]。早老素蛋白1（PSEN1）[3]、早老素蛋白2（PSEN2）[4]、β淀粉樣前體蛋白（APP）[5]基因的突變是EOAD的重要遺傳致病因素，其中PSEN1是EOAD最常見的突變基因，突變頻率為18%～50%[6]。本課題組既往報道了一個EOAD家系[7]，其家庭成員在40歲左右出現(xiàn)以認知功能下降為特征的癡呆癥，5代人中已有3代發(fā)病，最近家系中再次發(fā)現(xiàn)1例新發(fā)男性病例，發(fā)病者已達7例。該家系病人發(fā)病年齡輕，病情進展迅速，病程僅5～7年，國內(nèi)少見類似報道。本研究對現(xiàn)存活的第3代的4例病人進行18F-FDG PET/CT腦顯像檢查，分析大腦葡萄糖代謝特點，并對家系成員進行基因測序，尋找致病基因。

1 資料和方法

1.1 一般資料

家系共65名成員，均為漢族，男性33人，女性32人。其中Ⅲ21為先證者，女，于36歲出現(xiàn)近事記憶減退，并出現(xiàn)暴躁、固執(zhí)易怒等人格方面的障礙。先證者的父親（Ⅱ5），于42歲出現(xiàn)遺忘、反應(yīng)遲鈍，并逐漸出現(xiàn)人格改變、定向障礙，生活不能自理，于49歲死亡。先證者的祖父（Ⅰ1），45歲發(fā)病，表現(xiàn)為記憶力下降、反應(yīng)遲鈍、人格改變等，50歲左右死亡，死因不明。先證者的伯父（Ⅱ3），43歲發(fā)病，癥狀類似，50歲時死亡。先證者的兄長（Ⅲ17）和堂姐（Ⅲ13）分別于42歲和43歲出現(xiàn)健忘、計算力下降、反應(yīng)遲鈍。新發(fā)病人（Ⅲ15）為先證者的堂弟（40歲），于2016年出現(xiàn)遺忘，以近事遺忘為主，伴計算能力下降，并逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、人格改變、定向障礙等;查體：發(fā)育正常，營養(yǎng)良好，神志清楚，表情淡漠，言語流利，記憶力、計算力、定向力下降，理解力尚保留，腦神經(jīng)檢查無陽性體征，四肢肌力、肌張力正常，腱反射對稱，感覺及共濟運動正常，病理征未引出。家系圖見圖1。本研究所有受試者在神經(jīng)心理學(xué)測試、PET檢查及基因檢測前均經(jīng)過本人或者其法定代理人的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 神經(jīng)心理學(xué)檢查 對新發(fā)病人Ⅲ15進行神經(jīng)心理學(xué)檢查，涉及記憶、語言、定向力、應(yīng)用能力、注意力、知覺（視、聽、感知）和執(zhí)行能力等7個領(lǐng)域。①簡易精神狀態(tài)量表（MMSE）用于臨床初篩，最高得分為30分，27～30分為正常，<27分為認知功能障礙。癡呆嚴(yán)重程度分級：輕度，MMSE≥21分;中度，MMSE 10～20分;重度，MMSE≤9分。②日常生活能力量表（ADL）用于評定被試者的日常生活能力，最高64分，總分16分為完全正常，>16分表明有不同程度的功能下降。③Haehinski缺血量表（HIS）僅用于血管性癡呆和老年性癡呆的鑒別診斷，滿分18分，得分在4分以下者，屬老年性癡呆;7分以上者，則屬血管性癡呆。

1.2.2 PET/CT檢查及圖像處理和分析 PET/CT檢查前行顱腦CT或MRI檢查排除腦出血、腫瘤等腦器質(zhì)性病變。PET掃描儀型號為GE Discovery LS PET/CT。受試者（Ⅲ13、Ⅲ15、Ⅲ17和Ⅲ21）檢查前空腹至少6 h，避免高糖飲食，于肘靜脈注射示蹤劑18F-FDG，休息45 min后進行PET腦顯像。以PET/CT中心的健康查體者作為健康對照。圖像處理及分析采用視覺分析法和SPM分析法，在Mtalab平臺上，應(yīng)用SPM 10軟件對圖像進行預(yù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，根據(jù)糖代謝變化區(qū)域的Talariach坐標(biāo)值確定各腦區(qū)。

1.2.3 基因組 DNA提取 采集包括先證者在內(nèi)的現(xiàn)存活的4例病人及49例健康家系成員的外周血5 mL，置于EDTA抗凝管中，使用血液基因組DNA抽提試劑盒（北京天根科技有限公司）提取血液樣本的基因組DNA。

1.2.4 PSEN1基因突變檢測 在金域醫(yī)學(xué)檢驗集團股份有限公司協(xié)助下對提取的血液樣本基因組DNA進行癡呆相關(guān)基因（PSEN1、PSEN2、APP和APOE等）的檢測。

1.2.5 Sanger測序驗證 引物由生工生物工程技術(shù)（上海）股份有限公司設(shè)計與合成。PCR反應(yīng)體系共20 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次。反應(yīng)完成后對所得PCR產(chǎn)物進行測序。應(yīng)用Chromas軟件分析圖像，應(yīng)用NCBI Blast對測序結(jié)果進行序列比對，并排除基因多態(tài)性現(xiàn)象。

2 結(jié) ?果

2.1 神經(jīng)心理學(xué)評估

新發(fā)病人Ⅲ15 MMSE評分18分，量表總分及各單項得分均有不同程度地降低;ADL評分28分，明顯大于16分，表明日常生活自理能力明顯下降;HIS評分0分，排除血管性癡呆。

2.2 18F-FDG PET/CT腦顯像分析

視覺法分析顯示，大腦皮質(zhì)示蹤劑呈局灶性不均勻分布，雙側(cè)顳頂聯(lián)合皮質(zhì)區(qū)、額葉及顳葉外側(cè)部等腦區(qū)示蹤劑攝取減少（圖2）。SPM法分析顯示，雙側(cè)顳頂聯(lián)合皮質(zhì)區(qū)、顳葉外側(cè)部、額葉及皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)代謝減低，以顳頂聯(lián)合皮質(zhì)區(qū)及額葉為著（圖3）。

1～5列為正常對照：腦部各結(jié)構(gòu)顯示清晰，大腦皮質(zhì)、皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)及小腦示蹤劑分布均勻、對稱;6～10列為病人Ⅲ15：雙側(cè)額葉、顳頂聯(lián)合皮質(zhì)區(qū)及顳葉外側(cè)部等腦區(qū)示蹤劑攝取減少。

2.3 DNA測序

該家系Ⅲ21（先證者）、Ⅲ13（先證者堂姐）、Ⅲ17（先證者兄長）、Ⅲ15（先證者堂弟）均在PSEN1基因的第5外顯子發(fā)現(xiàn)第417位核苷酸由鳥嘌呤（G）突變?yōu)榘奏ぃ–），導(dǎo)致第139號密碼子編碼的氨基酸由蛋氨酸（Met）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖le），描述為p.M139I;APP、PSEN2及APOE基因無異常。家系內(nèi)健康成員基因組DNA中均未發(fā)現(xiàn)PSEN1、APP、PSEN2和APOE基因突變。見圖4。

3 討 ?論

AD是一種與年齡有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶力下降、認知障礙、視空間損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等，其特征性病理改變?yōu)棣碌矸蹣拥鞍祝ˋβ）的沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元變性和突觸缺失等[8-9]。由于AD病人腦內(nèi)神經(jīng)元大量丟失和突觸活性減低，神經(jīng)元對能量需求減低，進而導(dǎo)致大腦的葡萄糖代謝減低，因此FDG PET腦顯像能夠在體外反映AD病人大腦不同部位對FDG的攝取，從而反映大腦葡萄糖代謝的特點[10]。AD病人18F-FDG PET腦顯像以顳頂葉、后扣帶回、楔前葉及額葉低代謝為主要特征[11]。本家系中病人18F-FDG PET腦顯像結(jié)果顯示，大腦雙側(cè)額葉、顳頂聯(lián)合皮質(zhì)區(qū)、顳葉外側(cè)部及皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)葡萄糖代謝減低，符合AD的大腦葡萄糖代謝特征。傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查手段，如顱腦CT和MRI，主要用于排除顱內(nèi)占位性病變、腦出血、腦梗死等疾病和發(fā)現(xiàn)AD的特異性影像學(xué)表現(xiàn)，如腦萎縮和腦室擴大等，而18F-FDG PET在臨床癥狀和腦結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化之前，即可發(fā)現(xiàn)AD腦內(nèi)異常功能變化，提示18F-FDG PET檢查有利于早期AD的鑒別診斷[12]，可以為研究不同發(fā)病年齡AD病人的大腦葡萄糖代謝特征提供線索。

家族性AD（FAD）是指家族中有連續(xù)2代或者2代以上，至少2位一級親屬罹患AD，且發(fā)病年齡小于60歲。常染色體顯性遺傳的EOAD可由已知的PSEN1、PSEN2和APP基因突變所致，這3個基因中的AD連鎖突變具有高度外顯性（>85%），因此，這3個基因被認為是EOAD的“診斷生物標(biāo)志物”[13]。但APP、PSEN1和PSEN2的致病性突變只能解釋早發(fā)型FAD家系的一小部分，大量遺傳原因不明的EOAD病人表明有其他的致病基因尚未被鑒定[14]。APOEε4等位基因的純合性是LOAD的主要遺傳危險因素，是顯著增加EOAD風(fēng)險的獨立遺傳因素[15]。但是，與APP、PSEN1和PSEN2的突變不同，APOEε4等位基因不被認為是導(dǎo)致EOAD的重要原因，而僅僅是一個危險因素[16]。全基因組測序和全外顯子測序等二代測序技術(shù)還發(fā)現(xiàn)，TYROBP、NOTCH3和SORL1可能是引起EOAD的基因[17-18]。近20年以來，在AD病人中發(fā)現(xiàn)了超過200個PSEN1基因突變，其中大多數(shù)是致病性的。約70%的PSEN1基因突變發(fā)生在第5～8外顯子[19]。本研究對一個AD家系進行常見致病基因篩查，發(fā)現(xiàn)PSEN1基因第5外顯子第417位核苷酸由G突變?yōu)镃（c.417G>C），致使PSEN1編碼蛋白第139位蛋氨酸被異亮氨酸替代，即p.M139I。先前有研究描述了M139I基因突變，但不同的是，其DNA序列中堿基對變化不同，為ATG→ATA[20]，或位于不同的外顯子上[21]。本研究中位于PSEN1基因第5外顯子的139號密碼子的氨基酸突變，為國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的PSEN1基因突變位點。

PSEN1基因位于14q24.2號染色體上，其編碼蛋白是γ-分泌酶的一部分，當(dāng)PSEN1基因發(fā)生突變，會引起γ-分泌酶對APP切割異常，導(dǎo)致Aβ42/Aβ40比值的增加[22]。Aβ42比Aβ40更容易在腦內(nèi)形成淀粉樣聚集，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生[23]。PSEN1在促進和維持記憶以及神經(jīng)元存活方面可能起著重要作用[24-25]。與APP突變攜帶者及PSEN2突變攜帶者相比，PSEN1突變的病人通常發(fā)病年齡早，癥狀開始年齡平均比APP突變攜帶者早8.4歲（分別為42.9歲和51.3歲），比PSEN2突變攜帶者（57.1歲）早14.2歲[19]。有研究顯示，EOAD始于35歲之前，幾乎完全由PSEN1突變引起[26-27]。本家系中病人Ⅲ2136歲發(fā)病，Ⅲ1342歲發(fā)病，Ⅲ1743歲發(fā)病，均屬于EOAD，符合FAD發(fā)病年齡小的特點。除了典型的認知功能下降外，PSEN1基因突變相關(guān)的AD病人在疾病發(fā)展過程中還可出現(xiàn)癲癇和肌陣攣、痙攣性截癱、帕金森綜合征和小腦共濟失調(diào)等錐體外系表現(xiàn)，這是常染色體顯性遺傳EOAD的共同特征[28]，而本文報道的家系成員僅出現(xiàn)了認知功能減退及精神癥狀，尚未發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作及錐體外系癥狀，仍需進一步隨訪觀察。

本研究新發(fā)現(xiàn)的突變p.M139I在國內(nèi)為首次報道，擴大了PSEN1基因突變譜。中國人口雖然眾多，但關(guān)于FAD家系的報道及相應(yīng)突變位點的研究甚少。本文報道的AD家系病人疾病發(fā)展迅速，病程短，很快出現(xiàn)死亡，對于拓展遺傳性FAD研究思路具有重要的意義，后續(xù)我們將針對此新突變位點進行基因功能分析。

[參考文獻]

[1] QUERFURTH H W， LAFERLA F M. Alzheimers disease[J]. New England Journal of Medicine， 2010，362（4）：329.

[2] BERTRAM L， LILL C M， TANZI R E. The genetics of Alzheimer disease： back to the future[J]. Neuron， 2010，68（2）：270-281.

[3] SHERRINGTON R， ROGAEV E I， LIANG Y， et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimers disease[J]. Nature， 1995，375（6534）：754-760.

[4] LEVY-LAHAD E， WASCO W， POORKAJ P， et al. Candidate gene for the chromosome 1 familial Alzheimers disease locus[J]. Sci N Y N Y， 1995，269（5226）：973-977.

[5] GOATE A， CHARTIER-HARLIN M C， MULLAN M， et al. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial[J]. Nature， 1991，349（6311）：704-706.

[6] RADEMAKERS R， CRUTS M， VAN BROECKHOVEN C. Genetics of early-onset Alzheimer dementia[J]. The Scientific World Journal， 2003，3（3）：497-519.

[7] 馬愛軍，郭曉軍，韓瑩，等. 早發(fā)性Alzheimer病一家系六例[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志， 2014，31（5）：674-675.

[8] CASTELLANI R J， ROLSTON R K， SMITH M A. Alzheimer disease[J]. Disease A Month， 2010，56（9）：484-546.

[9] GALLAWAY P J， MIYAKE H， BUCHOWSKI M S， et al.??Physical activity： a viable way to reduce the risks of mild cognitive impairment， Alzheimers disease， and vascular dementia in older adults[J]. Brain Sci， 2017，7（2）：22.

[10] MARTNEZ G， VERNOOIJ R W， FUENTES PADILLA P， et al. 18F PET with florbetaben for the early diagnosis of Alzheimers disease dementia and other dementias in people with mild cognitive impairment （MCI）[J]. Cochrane Database Syst Rev， 2017，11：CD012883.

[11] HERHOLZ K， SALMON E， PERANI D， et al. Discrimination between Alzheimer dementia and controls by automated analysis of multicenter FDG PET[J]. NeuroImage， 2002，17（1）：302-316.

[12] CHTELAT G， EUSTACHE F， VIADER F， et al. FDG-PET measurement is more accurate than neuropsychological assessments to predict global cognitive deterioration in patients with mild cognitive impairment[J]. Neurocase， 2005，11（1）：14-25.

[13] REITZ C， MAYEUX R. Alzheimer disease： epidemiology， diagnostic criteria， risk factors and biomarkers[J]. Biochemical Pharmacology， 2014，88（4）：640-651.

[14] CHOURAKI V， SESHADRI S. Genetics of Alzheimers di-sease[J]. Biomed Research International， 2013，2013（6326）：1410.

[15] LPEZ-RIQUELME N， ALOM-POVEDA J， VICIANO-MOROTE N， et al. Apolipoprotein E ε4 allele and malondialdehyde level are independent risk factors for Alzheimers di-sease[J]. SAGE Open Medicine， 2016，4：205031211562673.

[16] GENIN E， HANNEQUIN D， WALLON D， et al. APOE and Alzheimer disease： a major gene with semi-dominant inheri-tance[J]. Mol Psychiatry， 2011，16（9）：903-907.

[17] POTTIER C， RAVENSCROFT A， BROWN P H， et al. TYROBP genetic variants in early-onset Alzheimers disease[J]. Neurobiology of aging， 2016，48（2）：9-15.

[18] GUERREIRO R J， LOHMANN E， KINSELLA E， et al. Exome sequencing reveals an unexpected genetic cause of di-sease： NOTCH3 mutation in a Turkish family with Alzhei-mers disease[J]. Neurobiology of Aging， 2012，33（5）：1008.e17-1008.e23.

[19] CRUTS M， THEUNS J， VAN BROECKHOVEN C. Locus-specific mutation databases for neurodegenerative brain diseases[J]. Hum Mutat， 2012，33（9）：1340-1344.

[20] BOTEVA K， VITEK M， MITSUDA H， et al. Mutation ana-lysis of presenillin 1 gene in Alzheimers disease[J]. Lancet Lond Engl， 1996，347（8994）：130-131.

[21] KIM H J， KIM H Y， KI C S， et al. Presenilin 1 gene mutation （M139I） in a patient with an early-onset Alzheimers disease： clinical characteristics and genetic identification[J]. Neurol Sci： Off J Italian Neurol Soc Italian Soc Clin Neurophysiol， 2010，31（6）：781-783.

[22] SUN L F， ZHOU R， YANG G H， et al. Analysis of 138 pathogenic mutations in presenilin-1 on the in vitro production of Aβ42 and Aβ40 peptides by γ-secretase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2017，114（4）：E476-E485.

[23] JAN A， GOKCE O， LUTHI-CARTER R， et al. The ratio of monomeric to aggregated forms of Aβ40 and Aβ42 is an important determinant of amyloid-β aggregation， fibrillogenesis， and toxicity[J]. Journal of Biological Chemistry， 2008，283（42）：28176-28189.

[24] LEE S， SHARMA M， SUDHOF T C， et al. Synaptic function of nicastrin in hippocampal neurons[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2014，111（24）：8973-8978.

[25] TABUCHI K， CHEN G Q， SUDHOF T C， et al. Conditional forebrain inactivation of nicastrin causes progressive memory impairment and age-related neurodegeneration[J]. The Journal of Neuroscience， 2009，29（22）：7290-7301.

[26] HOLMES C. Genotype and phenotype in Alzheimers disease[J]. Br J Psychiatry： J Ment Sci， 2002，180（2）：131-134.

[27] CAMPION D， BRICE A， DUMANCHIN C， et al. A novel presenilin 1 mutation resulting in familial Alzheimers disease with an onset age of 29 years[J]. Neuroreport， 1996，7（10）：1582-1584.

[28] RUDZINSKI L A， FLETCHER R M， DICKSON D W， et al. Early onset familial Alzheimer disease with spastic paraparesis， dysarthria， and seizures and N135S mutation in PSEN1[J]. Alzheimer Dis Assoc Disord， 2008，22（3）：299-307.

（本文編輯 馬偉平）