溫慧玲，廖梅香，陳嬌婷，張道英，黃 浩

（贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州341000）

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.Var.officininalis（Dodo）huang和疏毛吳茱萸Euodia Rutaecarpa（Juss.）Benth.Var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果實(shí)［1］。吳茱萸是常用的溫里中藥，常用于治療厥陰頭痛、寒病腹痛、經(jīng)行腹痛、朊腹脹痛等癥。歷代中醫(yī)藥文獻(xiàn)均記載本品因其性溫燥有毒［2］，傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為吳茱萸通過合理的炮制能起到減毒增效的作用，故多以炮制品入藥。

樟幫傳統(tǒng)中藥炮制始于東漢時(shí)期，藥祖葛玄在樟樹閣皂山洗藥煉丹，守藥行醫(yī)，開創(chuàng)了樟幫藥業(yè)的先河，后經(jīng)南宋著名藥師侯逢丙來樟樹設(shè)藥加工，開店經(jīng)營，奠定了樟幫藥業(yè)的基礎(chǔ)，至明代逐漸形成了完整的樟幫藥業(yè)發(fā)展體系，該過程前后歷時(shí)1 800多年［3］。樟樹中藥炮制，不論炒、浸、泡、炙或烘、曬、切、藏均十分考究，獨(dú)樹一幟，成為南北藥材集散和炮制中心。樟樹藥幫的先賢通過千百年的努力，贏得了“藥不到樟樹不齊，藥不過樟樹不靈”的美譽(yù)，成為海內(nèi)外藥界同仁認(rèn)可的中國藥都，形成了獨(dú)具特色的樟幫法炮制飲片工藝［4］。樟幫法中藥炮制雖炒、浸、泡、炙或烘、曬、切、藏十分考究，但千百年來這些做法只是作為一種經(jīng)驗(yàn)傳承下來，大部分只是停留于口頭，尚未形成科學(xué)可循的“炮制規(guī)范”。

吳茱萸藥材是江西省傳統(tǒng)的道地藥材之一。樟幫法炮制吳茱萸有別于中國藥典法，該炮制過程是以其獨(dú)特的泡制為其特色。吳茱萸的泡制方法始見于漢代著名醫(yī)家張仲景所著的幾部書中。如《金匱玉函經(jīng)》和《注解傷寒論》中都提到“洗”法，這是一個(gè)比較籠統(tǒng)和模糊的概念［5］。不過，在其同一時(shí)期成書的由后人輯錄的《新輯宋本傷寒論》中明注：“洗，湯洗七遍”為較具體方法。湯，古人稱熱水為湯。這也是張氏首次提出用熱水來炮制吳茱萸的方法。以后的晉、齊、梁等代都是承襲此法而無甚發(fā)展。可見樟幫泡吳茱萸法歷史悠久。如2008版《江西省中藥炮制規(guī)范》記載的泡吳茱萸炮制工藝為取吳茱萸，用開水泡約1 h至頂端開口，再置于鍋中炒熱，灑入鹽水至發(fā)香氣，焙干。每100 kg吳茱萸，用食鹽3 kg［6］。炮制工藝中雖然有些參數(shù)規(guī)定，但是不完全。為了使炮制更加具有可操作性，現(xiàn)對樟幫法炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。以期為建立樟幫泡吳茱萸的最佳炮制工藝，為后續(xù)的炮制機(jī)理研究提供穩(wěn)定的樣品。

1 儀器與材料

戴安3000高效液相色譜儀（UV檢測器），UNICO-2000紫外可見分光光度（尤尼康檢測儀器有限公司），Sartorius BS214-D（萬分之一），Mettler AE240天平（十萬分之一），KQ3200超聲波清洗器（昆山超聲儀器廠），F(xiàn)W100高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），CFP-110X50型報(bào)喜龍電炒鍋（報(bào)喜龍電器廠），TN408LC型紅外測溫槍（上海儀迷杰光電技術(shù)有限公司），TDGC-2型接觸式調(diào)壓器（環(huán)宇集團(tuán)公司），GZX-9146MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），自動(dòng)雙重蒸餾水器（上海亞榮生化儀器有限公司）；吳茱萸堿，吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯對照品（中國藥品生物制品檢定所提供110802-200504，110801-200505，110800-20040）；乙腈（色譜純，TEDIA），甲醇（色譜純，TEDIA），雙蒸餾水（自制），甲醇（分析純，上海振興化工廠一廠），其他試劑均為分析純。吳茱萸藥材購于江西省樟樹慶仁飲片公司，經(jīng)藥學(xué)院李加林副教授鑒定為吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth。

2 方法與結(jié)果

2.1 吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯的含量測定

2.1.1 色譜條件色譜柱為Diamonsil ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈∶水=50∶50；檢測波長，225 nm；柱溫：室溫；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量為：20μL（見圖1）。

2.1.2 對照品溶液的配制取吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，分別加入甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.490、0.580、0.760 mg·mL-1的對照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 供試品溶液的制備通過對提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間提取容量的單因素考察，綜上確定了供試品的制備方法為：精密稱取吳茱萸炮制品粉末（粉碎，過40目篩）約0.2 g，置于錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱重，超聲提取60 min，放冷，加甲醇補(bǔ)重，搖勻，過濾，0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察精密吸取各對照品溶液適量，分別配制成不同濃度的對照品溶液，以色譜峰面積對進(jìn)樣量進(jìn)行回歸分析，得到回歸方法：Y吳茱萸堿=4.465 3X+0.983 8，r=0.999 7，Y吳茱萸次堿=1.916 7X－0.471 2，r=0.999 6，Y吳茱萸內(nèi)酯=0.061 8X+0.020 9，r=0.999 7。結(jié)果表明，吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯分別在2.45～34.08μg·mL-1、1.45～58μg·mL-1、22～760μg·mL-1范圍內(nèi)，與峰面積的值呈良好線性關(guān)系（見表1）。

2.1.5 精密度試驗(yàn)分別精密的吸取吳茱萸內(nèi)酯，吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得吳茱萸內(nèi)酯的峰面積分別為1.363 8、1.371 2、1.410 8、1.401 7、1.375 2、1.380 7，RSD%為1.33%；吳茱萸堿的峰面積分別為40.910 0、42.249 0、42.244 4、41.162 2、41.115 7、41.209 5，RSD%為1.45%；吳茱萸堿的峰面積分別為8.396 7、8.652 4、8.678 4、8.496 4、8.569 7、8.808，RSD%為1.69%。結(jié)果表明精密度良好。

圖1吳茱萸供試品色譜圖

表1測定成分的線性關(guān)系和線性范圍

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取同一批的吳茱萸（炮制品）樣品一份，按照“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣，每次進(jìn)樣20μL，結(jié)果吳茱萸內(nèi)酯含量分別為3.143%、3.062%、3.115%、3.143%、3.062%、3.115%，RSD%為1.20%；吳茱萸堿含量分別為0.445%、0.436%、0.446%、0.445%、0.436%、0.456%，RSD%為1.67%；吳茱萸次堿含量分別為0.147%、0.144%、0.144%、0.147%、0.144%、0.148%，RSD%為1.09%。結(jié)果表明，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批的吳茱萸（炮制品）樣品6份，按照“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，準(zhǔn)確吸取20μL進(jìn)樣分析，進(jìn)行含量測定。計(jì)算得吳茱萸內(nèi)酯含量分別為2.543%、2.462%、2.542%、2.552%、2.554%、2.463%，RSD%為1.75%；吳茱萸堿含量分別為0.302%、0.303%、0.310%、0.301%、0.304%、0.302%，RSD%為1.05%；吳茱萸次堿含量分別為0.227%、0.230%、0.224%、0.228%、0.228%、0.230%，RSD%為0.98%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取樟幫炮制品粉末6份，每份約0.1 g，分別精密加入相當(dāng)于樣品中指標(biāo)成分量100%的3種成分對照品溶液即吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯，按“供試品溶液制備”方法處理并測定，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯的回收率均在95%～105%，RSD值均小于2%，符合加樣回收率要求（見表2）。

2.2 樟幫泡吳茱萸炮制工藝的優(yōu)選

2.2.1 凈選工藝取吳茱萸，揀凈果梗，篩去灰屑，備用。

2.2.2 正交表的設(shè)計(jì)通過樟幫法泡吳茱萸的預(yù)試驗(yàn)，確定以吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量為指標(biāo)，以開水泡制時(shí)間（注：指加入開水后放置涼處的時(shí)間），加鹽的量，炒制溫度及炒制時(shí)間為考察因素（因素水平表見表3），每個(gè)因素選取4個(gè)水平，按L16（45）正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（正交表設(shè)計(jì)見表4）。

2.2.3 樣品的炮制取大小均勻，色澤均一的吳茱萸16份，每份50 g，按照1∶4（1份藥材，4份水的量浸泡），按表4的工藝條件進(jìn)行炮制，控制溫度和時(shí)間，出鍋后放涼，篩去灰屑，即得。

2.2.4 指標(biāo)測定選用正交表L16（45）安排試驗(yàn)，以吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量為指標(biāo)，引用綜合指標(biāo)“隸屬度”［7］，將各個(gè)指標(biāo)統(tǒng)一綜合考察。因試驗(yàn)測定的三種成分指標(biāo)越大越好，故指標(biāo)隸屬度=（指標(biāo)值－指標(biāo)最小值）／（指標(biāo)最大值－指標(biāo)最小值），因?yàn)楦髦笜?biāo)的重要性一樣，故綜合分?jǐn)?shù)（Y）就直接將各指標(biāo)隸屬度相加（Y=吳茱萸內(nèi)酯的隸屬度+吳茱萸堿的隸屬度+吳茱萸次堿的隸屬度）。以綜合指標(biāo)來優(yōu)選最佳炮制工藝參數(shù)。采用同樟幫泡吳茱萸（甘草水泡制）炮制品相同數(shù)據(jù)處理方法優(yōu)選最佳炮制工藝參數(shù)。炮制品按照“吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量測定方法的建立”項(xiàng)下的“供試品溶液的制備”方法制備樣品。精密吸取樣品20μL進(jìn)樣進(jìn)行含量測定。結(jié)果見表4。

表2吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內(nèi)酯加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3樟幫法泡吳茱萸（開水泡制）的因素水平表

表4 L16（45）樟幫法泡吳茱萸（開水泡制）的正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果表

由表4得到A（開水泡的時(shí)間）對于吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿均有顯著性的影響，B（鹽水的量）對于3個(gè)指標(biāo)無顯著性的影響，C（炒的時(shí)間）對吳茱萸內(nèi)酯有顯著性的影響，D（炒的溫度）對于吳茱萸堿有顯著性的影響。由直觀分析得到最佳泡制工藝為：A2B4C4D3，考慮到鹽的用量對于指標(biāo)沒有顯著性的影響，還有成本考慮，故鹽水的用量定為水平一，即最佳泡吳茱萸工藝為：A2B1C4D3，即取凈吳茱萸一定量，用開水泡1 h（按照1份藥材，4份水的量浸泡），然后取出放入250℃的炒鍋中加鹽一定量，炒18 min，炒干后撈出，放冷，篩去灰屑。每100 kg吳茱萸，加鹽3 kg。

2.2.5 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)取大小均勻，色澤均一的吳茱萸3份，每份500 g，按照2.2.4的優(yōu)選工藝制備3批樣品，分別測定各指標(biāo)成分的含量，求出綜合評價(jià)值Y′，結(jié)果見表5。

結(jié)果表明，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)樣品綜合評價(jià)值Y′與優(yōu)選結(jié)果Y相近，說明優(yōu)選工藝條件穩(wěn)定可行。

表5三批樣品驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)含量測定結(jié)果

3 討論

泡吳茱萸為江西樟幫特色炮制飲片，尚未見其炮制工藝的報(bào)道。雖然對于吳茱萸其他炮制品的炮制工藝的研究報(bào)道較多［8-12］，但是對于樟幫法泡制吳茱萸的炮制工藝研究卻報(bào)道很少。2015年版《中國藥典》收載吳茱萸炮制品有吳茱萸和制吳茱萸。全國部分省市中藥飲片炮制規(guī)范均收錄了吳茱萸和制吳茱萸，其中僅廣東、福建和江西三個(gè)省份的中藥飲片炮制規(guī)范收載了泡吳茱萸的炮制方法［13］。有文獻(xiàn)研究表明吳茱萸經(jīng)過不同方法炮制后其酚酸類及黃酮類成分均有所減少。而生物堿類成分因炮制方法的不同有所差異。比如，甘草制吳茱萸中生物堿的含量大于生品中的含量。但是熱水浸泡吳茱萸中生物堿的含量低于生品中的含量［8］。其中甘草制吳茱萸中生物堿的含量大于生品中的含量，推測可能是因?yàn)楦什葜懈什菟岷透什荽嗡岬人嵝猿煞帜艽龠M(jìn)生物堿類成分的溶出［14］。而泡制對吳茱萸飲片中酚酸、黃酮和生物堿類成分均有降低的作用，可能提示泡制品獨(dú)特炮制的原因。該炮制工藝穩(wěn)定、可靠、可操作性強(qiáng)，為后續(xù)的樟幫泡吳茱萸炮制機(jī)理研究提供穩(wěn)定可靠的樣品。