陳海燕，張 娟，鄒麗君

（贛南醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，江西 贛州341000）

苯是一種易揮發(fā)性有機(jī)化合物，廣泛存在于各種裝修材料、日用化學(xué)品的使用中，是造成室內(nèi)空氣污染的主要成分，也是某些職業(yè)人群面臨的主要的職業(yè)污染物［1］?？諝庵斜降暮可仙秊橐欢舛葧r(shí)，可使機(jī)體出現(xiàn)頭痛、惡心、嘔吐、四肢乏力等急性中毒表現(xiàn)，而長期吸入可造成慢性中毒，對(duì)人體的各大臟器產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害，特別是血液系統(tǒng)方面，重者可引起白血病等惡性疾病的發(fā)生［2］。國際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）已明確將苯列為人類的Ⅰ類致癌劑［3］，同時(shí)具有遺傳毒性。而關(guān)于其具體作用機(jī)制，尚未完全闡明，有研究認(rèn)為其與脂質(zhì)過氧化等多種因素有關(guān)［4］。因此，學(xué)者們?cè)谔骄勘街卸镜穆殬I(yè)保護(hù)措施外，亦不斷致力于如何減輕苯中毒者的毒性作用［5］。橙子為一種熱帶、亞熱帶蕓香科橙子亞科的果實(shí)。香精油是橙皮中提取的主要成分之一，占柑橘皮總重的0.5%～2%，以萜烯類、D-檸檬烯、倍半萜烯類、高級(jí)醇類、醛類、酮類、酯類等組成的含氧化合物為主要成分［6］，在食品及化妝品行業(yè)應(yīng)用廣泛。柑橘香精油具有多種功效，如消炎抑菌、抗氧化、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)、減輕應(yīng)激等［6-7］。近年來亦有研究發(fā)現(xiàn)，較多植物精油具有分解致癌物質(zhì)的有毒官能團(tuán)，抑制癌變細(xì)胞新陳代謝的作用［8］。而橙皮精油是否對(duì)苯所致的毒性作用具有保護(hù)作用，仍未見相關(guān)報(bào)道，因此本文旨在研究橙皮精油對(duì)苯染毒小鼠的保護(hù)作用，期望為探索苯染毒的保護(hù)措施提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑選取30只清潔級(jí)健康ICR小鼠，4～5周齡，雌雄各半，體重20～30 g。由贛南醫(yī)學(xué)院黃金校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為：SYXK（贛）：2007-2002。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，飲水禁食自由，飼養(yǎng)條件為：自由采光，室溫調(diào)節(jié)在20℃～25℃，濕度為50%～75%。本實(shí)驗(yàn)所用橙皮精油購自江西恒誠天然香油有限公司，密度為840 mg·mL-1；苯液（密度為880 mg·mL-1，分析純）、乙醇（分析純）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，三組小均購自山東德彥化工有限公司。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程符合動(dòng)物福利及相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)和指南要求。

1.2 動(dòng)物染毒將30只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、苯染毒組和苯+精油組，雌雄各半共10只。其中，苯染毒組以200 mg·kg-1體重的劑量進(jìn)行苯灌胃染毒，苯+精油組則灌胃給予苯+精油的混合溶液，對(duì)照組給予等量的乙醇溶液。均染毒30 d。其中，橙皮精油經(jīng)稀釋16.8倍，以595μL溶于10 mL乙醇中制作而成；苯液的配置方法為將其稀釋44倍，以227μL溶于10 mL乙醇中；苯+精油混合液的配制為取595μL精油和227μL的苯混合溶于20 mL乙醇中。

1.3 觀察指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 一般情況染毒初及染毒期間每隔1周稱重1次，記錄其體重情況，并觀察小鼠活動(dòng)量、皮毛、進(jìn)食量等的一般狀態(tài)。

1.3.2 血常規(guī)指標(biāo)末次染毒后禁食12 h，稱重后麻醉大鼠，由內(nèi)眥動(dòng)脈取血2 mL，膠體抗凝劑抗凝，采用邁瑞B(yǎng)C-3300全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（武漢科爾達(dá)醫(yī)療科技有限公司）進(jìn)行血常規(guī)的檢測，比較三組的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血紅蛋白（HGB）和血小板（PLT）的差異。

1.3.3 臟器系數(shù)解剖小鼠，打開腹腔取其心、肝、腎、脾、睪丸、卵巢、子宮等臟器，生理鹽水洗凈、濾紙吸干后稱重，計(jì)算各臟器的臟器系數(shù)，其計(jì)算公式為：臟器系數(shù)（%）=臟器重量（g）/體重（g）×100。凍存于-80℃的冰箱中。

1.3.4 抗氧化指標(biāo)SOD、MDA水平取小鼠血樣3～4滴（促凝）及適量肝組織（冰浴下勻漿），3 500 r·min-1于4℃低溫離心機(jī)中離心10 min，取上清液保存于4℃冰箱內(nèi)。統(tǒng)一采用南京建成生物工程研究所的SOD測試盒（酶標(biāo)法）和MDA測試盒（酶標(biāo)法）對(duì)三組血清和肝組織中的SOD、MDA的含量進(jìn)行測定。

1.3.5 組織病理學(xué)檢測取適量肝臟組織，浸入10%的甲醛溶液中保存、固定，經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋等處理后，切片機(jī)切成厚度為5μm左右薄片，HE染色，在光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變。鼠的體重比較采用重復(fù)測量資料的方差分析，其余指標(biāo)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey方法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況喂養(yǎng)28 d內(nèi)，對(duì)照組小鼠的體重呈持續(xù)緩慢增長，活動(dòng)及精神狀態(tài)良好，皮毛正常（P＞0.05）；苯染毒組小鼠體重下降明顯（P＜0.05），呈現(xiàn)煩躁等表現(xiàn)，精神狀態(tài)不佳，皮毛無光澤；苯+精油組體重較為平穩(wěn)、略有下降（P＞0.05），煩躁表現(xiàn)減輕，精神尚可。三組小鼠在喂養(yǎng)第28 d前的體重對(duì)比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而28 d后的體重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其體重變化情況見表1、圖1。

表1三組小鼠的體重變化情況/g，-x±s

圖1三組小鼠的體重變化情況

2.2 臟器系數(shù)對(duì)比三組小鼠的心臟、腎臟的臟器系數(shù)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而在肝臟、脾臟和肺的臟器系數(shù)方面，苯染毒組＞苯+精油組＞對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 肝臟組織病理學(xué)變化對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈位于小葉中部，肝細(xì)胞形態(tài)未見異常，索竇比例正常，匯管區(qū)未見纖維組織增生、腫脹變性。而苯染毒組表現(xiàn)為明顯的肝細(xì)胞壞死，呈現(xiàn)為胞漿疏松、體積變大、細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核裂解、溶解，細(xì)胞膜不完整等，嚴(yán)重者氣球樣變，還可見脂肪變性，出現(xiàn)氣泡；苯+精油組亦呈現(xiàn)輕微肝細(xì)胞壞死現(xiàn)象，但較苯染毒組明顯減輕。見圖2。

表2三組小鼠臟器系數(shù)對(duì)比/±s

表2三組小鼠臟器系數(shù)對(duì)比/±s

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2.4 三組小鼠血常規(guī)指標(biāo)苯染毒組和苯+精油組小鼠的RBC、HGB和PLT均較對(duì)照組降低，且苯染毒組低于苯+精油組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而三組的WBC比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.5 三組抗氧化指標(biāo)苯染毒組和苯+精油組小鼠的血、肝SOD水平均較對(duì)照組降低，且苯染毒組低于苯+精油組；而血和肝MDA水平均高于對(duì)照組，且苯染毒組高于苯+精油組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

圖2三組小鼠的肝組織病理切片觀察（HE染色，×200倍）

表3三組小鼠血常規(guī)指標(biāo)對(duì)比/±s

表3三組小鼠血常規(guī)指標(biāo)對(duì)比/±s

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表4三組小鼠抗氧化指標(biāo)對(duì)比/±s

表4三組小鼠抗氧化指標(biāo)對(duì)比/±s

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3 討論

苯為一種無色透明的芳香烴類化合物，極易揮發(fā)，在空氣中主要以蒸汽形式存在，并可通過呼吸道、皮膚和消化道等多種途徑進(jìn)入體內(nèi)。目前已知苯是人類的強(qiáng)致癌物之一，可致多器官和系統(tǒng)的慢性毒作用，但造血系統(tǒng)為苯中毒的主要靶標(biāo)，所致?lián)p害最為突出，表現(xiàn)為紅細(xì)胞、血小板和白細(xì)胞數(shù)量的進(jìn)行性降低，進(jìn)而可能發(fā)生再生障礙性貧血、白血病等惡性腫瘤［9］。然而對(duì)于苯暴露所致的造血毒性的機(jī)制尚未明確，研究主要認(rèn)為與基因易感性、相關(guān)蛋白的損傷、表觀遺傳學(xué)改變、氧化應(yīng)激及DNA損傷等機(jī)制有關(guān)［10］。

近年來學(xué)者們?cè)谥铝τ诒饺径镜淖饔脵C(jī)制研究外，如何減輕或消除苯中毒的不良效應(yīng)及其相關(guān)的分子機(jī)制亦成為研究的重要課題［11-12］。橙皮精油是具有抑菌、鎮(zhèn)靜、抗氧化、抑制癌細(xì)胞新陳代謝等多種活性的天然物質(zhì)，隨著橙皮加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其各種潛在價(jià)值亦不斷受到重視，從而增加了產(chǎn)品的附加值［13］。因此，本研究采用橙皮精油干預(yù)苯慢性低劑量中毒小鼠，從血液學(xué)指標(biāo)、氧化損傷和DNA損傷等方面，觀察其在干預(yù)過程中的效果，旨在為探索苯中毒的發(fā)生機(jī)制和保護(hù)措施提供參考。

動(dòng)物的體重和臟器系數(shù)是毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中反映慢性和亞慢性毒性的兩種較靈敏指標(biāo)，可較好地反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受毒害的程度，及大體估計(jì)其內(nèi)臟器官病變的性質(zhì)和程度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯染毒組小鼠的體重及肝、脾、肺等器官的臟器系數(shù)均較對(duì)照組顯著下降，而苯+精油組均高于苯染毒組；三組肝組織病理學(xué)變化亦顯示，苯染毒造成了小鼠肝組織細(xì)胞的壞死，精油干預(yù)后肝細(xì)胞壞死現(xiàn)象更為輕微。說明苯對(duì)小鼠的身體機(jī)能及內(nèi)臟器官造成了一定程度的損害，引起了臟器的萎縮，橙皮精油可對(duì)這種損傷產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

血象分析是苯接觸的效應(yīng)生物標(biāo)志，檢測方法方便迅速，為當(dāng)前苯接觸人群的最常用監(jiān)測指標(biāo)［14］。有研究表明［15］，苯在機(jī)體內(nèi)經(jīng)代謝活化在骨髓中被轉(zhuǎn)化為終致癌物苯醌，可破壞骨髓的造血干、祖細(xì)胞及造血微環(huán)境，從而引起造血細(xì)胞的更新與分化異常，產(chǎn)生造血毒性。丁婷婷［16］的研究結(jié)果顯示，低、中、高濃度的亞慢性苯染毒均可導(dǎo)致小鼠的血液系統(tǒng)損傷，表現(xiàn)為白細(xì)胞、紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的降低。但低濃度苯暴露對(duì)人群是否存在血液毒性卻具有一定的爭議［17］。本次研究采用低劑量苯進(jìn)行灌胃染毒，觀察其亞慢性毒性作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在血液學(xué)指標(biāo)方面，苯染毒組和苯+精油組小鼠血液中的RBC、HGB和PLT均低于對(duì)照組，而苯+精油組高于苯染毒組（P＜0.05）。提示低劑量苯染毒可對(duì)小鼠的血液系統(tǒng)產(chǎn)生損傷，橙皮精油可有效改善其造成的損傷程度。分析其原因，可能與橙皮精油可降解苯的一些代謝毒產(chǎn)物，從而降低其相關(guān)損害作用有關(guān)［18］。

本次研究亦發(fā)現(xiàn)，在氧化指標(biāo)方面，苯染毒組和苯+精油組小鼠的血、肝SOD水平均較對(duì)照組降低，且苯染毒組低于苯+精油組；而血和肝MDA水平均高于對(duì)照組，且苯染毒組高于苯+精油組（P＜0.05）。說明苯低劑量亞慢性染毒可對(duì)小鼠的血液系統(tǒng)和肝臟造成氧化性損傷，而橙皮精油可通過增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶的活力，從而減輕其造成的氧化性損傷。究其原因，可能與橙皮精油具有較強(qiáng)的抗氧化作用有關(guān)。這與以往的研究結(jié)果具有一致性，如黃娜娜等［19］采用體外抗氧化測試方法研究柑橘精油的抗氧化作用發(fā)現(xiàn)，橙皮精油中含有萜烯化合物和Lγ-松油烯等活性成分，可顯著降低提高DPPH自由基的清除率，降低成纖維細(xì)胞氧化損傷模型的MDA含量，并改善其抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT的活力。筆者［20］在前期研究中亦有證實(shí)，橙皮精油具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除效果，對(duì)花生油的抗氧化作用較強(qiáng)。

綜上所述，低劑量亞慢性苯染毒可對(duì)小鼠的血液系統(tǒng)和抗氧化指標(biāo)造成損傷作用，橙皮精油可發(fā)揮顯著的改善作用。