周芬敏，文一惠，凌江紅，3，郭錦榮，陳珺明

（1.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院，上海 200021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021）

金剛藤為百合科植物菝葜Smilax chinaL.的塊莖，具有利濕去濁、祛風除痹、解毒散瘀的功效，臨床上常用于治療盆腔炎、類風濕關(guān)節(jié)炎、腰腿痛等疾病。近年來，藥理學(xué)研究證實金剛藤具有抗多種腫瘤的作用［1-2］。本課題組前期研究表明，金剛藤能夠促進肝癌細胞凋亡，從而發(fā)揮抗肝癌的作用［3］。自噬是細胞為維持自身穩(wěn)態(tài)的一種通過細胞內(nèi)溶酶體途徑降解的過程，通過自身降解受損的細胞器或錯誤折疊蛋白，為細胞提供能量。自噬與腫瘤細胞關(guān)系密切，適當自噬能夠為腫瘤細胞提高能量，促進細胞生長及增殖，而過度自噬則會啟動細胞自噬性死亡［4］，微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）參與了自噬體的形成［5］。本研究通過觀察金剛藤對自噬相關(guān)蛋白LC3 的影響，初步探討金剛藤對肝癌細胞自噬的影響，為金剛藤的抗腫瘤機制提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥材 金剛藤（產(chǎn)自廣西，批號：161201），由桂林鼎康中藥飲片有限公司提供。

1.2 動物及細胞株 SPF級SD雄性大鼠16只，鼠齡8～10 W，體質(zhì)量160～200 g，購自上海十指生物科技有限公司，動物合格證號：SCXK（滬）2018-0004。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后用于實驗，喂養(yǎng)期間大鼠自由進食及飲水。人肝癌SMMC-7721細胞株由上海中科院細胞庫提供。

1.3 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗混合液（美國GIBCO 公司）；胎牛血清（美國GIBCO 公司）；Apoptosis Detection Kit（上海翊圣生物科技有限公司）。

1.4 儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；高速低溫離心機（美國Sigma 公司）；蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 金剛藤水煎液的制備 取金剛藤飲片200 g，加入水至高出藥面2～3 cm，浸泡2 h，武火煮沸后，改用文火煎煮30 min，冷卻后，過濾取藥液，濾渣如上法再煎2 次，混合3 次藥液，濃縮成100 ml，即藥物濃度為2 g/ml，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 含藥血清的制備 將16 只大鼠隨機分為空白對照組、金剛藤低劑量組（JGT-L 組）、金剛藤中劑量組（JGT-M 組）和金剛藤高劑量組（JGT-H 組），每組4只。金剛藤低、中、高劑量組大鼠分別以金剛藤水煎液 0.5 g/ml、1 g/ml、2 g/ml 灌胃，每次 4 ml；空白對照組大鼠每天給予等量生理鹽水灌胃；各組均每天灌胃2 次，間隔 12 h，連續(xù)給藥 3 d。末次給藥 1 h 后，大鼠予CO2窒息處死，心臟取血，靜置，離心15 min取血清，過濾、滅活除菌，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇存活下來的SMMC-7721細胞置于10 cm 細胞培養(yǎng)皿中，細胞接種106個/板，培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS+1%雙抗，于37 ℃、5%CO2恒溫恒濕的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2 d 換液傳代1 次，待細胞進入對數(shù)生長期后進行實驗。

2.4 CCK-8 法檢測各組細胞增殖的抑制率 取對數(shù)生長期SMMC-7721 細胞，用DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為 1×105個/ml，加入 96 孔培養(yǎng)板，每孔 0.1 ml，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，待細胞貼壁約70%～80%時，棄去細胞培養(yǎng)液，按上述實驗分組方法分別加入相應(yīng)含藥血清，空白對照組及金剛藤低、中、高劑量組分別給予空白血清、金剛藤含藥血清（0.5 g/ml、1 g/ml、2 g/ml）0.2 ml，培養(yǎng)48 h后行CCK-8實驗，每組重復(fù) 6 個副孔，每孔分別加入 10 μl 的 CCK-8 溶液，繼續(xù)再置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h。用酶標儀在450 nm 波長處測定各孔的光密度值（OD 值）。按以下公式計算細胞增殖抑制率（IR）：IR=（1－實驗組OD值均數(shù)/對照組OD值均數(shù)）×100%。

2.5 Western Blot檢測各組LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達 金剛藤含藥血清培養(yǎng)SMMC-7721 細胞48 h，PBS 漂洗，分別提取細胞總蛋白定量后，取20 μg的等量蛋白樣品，12%SDS-PAGE進行凝膠電泳，后將蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，加入一抗LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ（均1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入羊抗鼠IgG（1∶50 000）37 ℃孵育2 h，PBST 洗膜3 次，每次 5 min。采用Oddsey 掃描儀掃描保存圖片，用Image J軟件對目的條帶進行灰度值計算。以目的條帶（LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ）與內(nèi)參條帶（β-actin）的總灰度值之比為標準評價結(jié)果，即目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組細胞增殖抑制率比較 見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率比較 （±s）

表1 各組細胞增殖抑制率比較 （±s）

注：與空白對照組比較，①P＜0.05；與JGT-L 組比較，②P＜0.05；與JGT-M組比較，③P＜0.05

組 別空白對照組JGT-L組JGT-M組JGT-H組n 4 4 4 4 OD 值2.139±0.126 1.611±0.078 0.737±0.062 0.184±0.054抑制率（%）0±5.887 24.667±3.633①65.523±2.900①②91.381±2.539①②③

表1結(jié)果顯示，與空白對照組比較，金剛藤各劑量組對人肝癌SMMC-7721 細胞株的抑制率均顯著增加（均P＜0.05）；與JGT-L 組比較，JGT-M、JGT-H 組對人肝癌SMMC-7721 細胞株的抑制率均顯著增加（均P＜0.05）；與 JGT-M 組 比 較 ，JGT-H 組 對 人 肝 癌SMMC-7721 細胞株的抑制率顯著增加（P＜0.05）。顯示金剛藤高劑量組抑制率最高，抑制作用與濃度呈正相關(guān)。

3.2 各組細胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相對表達量比較 與空白對照組比較，金剛藤各劑量組LC3-Ⅰ蛋白相對表達量無顯著性差異，金剛藤各劑量組LC3-Ⅱ蛋白相對表達量均顯著升高（均P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均顯著升高（均P＜0.05）。結(jié)果見表2及圖1。

表2 各組細胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相對表達量比較 （±s）

表2 各組細胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ相對表達量比較 （±s）

注：與空白對照組比較，①P＜0.05

組 別空白對照組JGT-L組JGT-M組JGT-H組n 4 4 4 4 LC3-Ⅰ0.913±0.055 0.970±0.095 0.897±0.051 0.957±0.047 LC3-Ⅱ0.900±0.148 1.360±0.043①1.217±0.050①1.317±0.091①LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ0.990±0.096 1.267±0.150①1.230±0.026①1.283±0.148①

圖1 各組細胞內(nèi)LC3蛋白的表達

4 討 論

多項研究發(fā)現(xiàn)金剛藤可抑制腫瘤細胞的增殖。于麗秀等［6］研究表明，菝葜提取物可以抑制A2780、HO8910PM 卵巢癌細胞的增殖，抑制作用呈劑量及時間依賴性。HU 等［2］研究表明，金剛藤可以促進卵巢癌A2780 細胞對順鉑和阿霉素的化學(xué)敏感性，提示金剛藤抗卵巢癌細胞不僅與其抑制卵巢癌細胞的增殖有關(guān)，還與其降低卵巢癌細胞對順鉑和阿霉素的耐藥性有關(guān)。吳先闖等［7］通過體外研究發(fā)現(xiàn)，金剛藤乙醇粗提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位能夠抑制肝癌細胞H22、HepG-2、BEL-7402 的增殖，且呈現(xiàn)劑量依賴性。本課題組前期觀察到金剛藤具有較好的抑制肝癌細胞生長及增殖的作用［8］。本實驗選用CCK-8 法檢測金剛藤對SMMC-7721 細胞增殖抑制率的影響，結(jié)果表明，金剛藤對SMMC-7721細胞增殖有明顯的抑制作用，且其抑制作用隨著金剛藤濃度的升高而增大，具有濃度依賴性，金剛藤高劑量組對細胞的作用最強，表明了金剛藤具有抗肝癌作用。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金剛藤抗腫瘤作用機制可能與增強免疫功能［9］、抑制腫瘤細胞增殖［6-7］、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［1、10］、抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［11］等作用有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金剛藤具有誘導(dǎo)肝癌細胞SMMC-7721 凋亡的作用，可能與下調(diào)POLD1 基因的表達有關(guān)［3］。細胞自噬是一個涉及多個自噬相關(guān)蛋白相互作用的動態(tài)過程，細胞在自噬形成的過程中產(chǎn)生雙層膜構(gòu)造，將細胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)包裹起來，形成細胞自噬體，進而與溶酶體結(jié)合成自噬溶酶體，分解其包裹的物質(zhì)，降解自身受損的結(jié)構(gòu)，為細胞提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，維持細胞的正常生長，并且能夠?qū)δ[瘤細胞的生長起著保護的作用［12］；另一方面，過度自噬則可以引起細胞自噬性死亡，亦稱Ⅱ型程序化細胞死亡，能夠主動誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［13］。研究表明，枸杞多糖誘導(dǎo)的肝癌細胞自噬，對肝癌細胞的生長起著保護作用，促進肝癌細胞的增殖，在和自噬抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后，細胞的凋亡率增高，表明枸杞多糖誘導(dǎo)的是保護性自噬［14］。南蛇藤素可誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生自噬，細胞增殖活力降低，但和自噬抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后，細胞增殖活力增強，表明南蛇藤素誘導(dǎo)的是殺傷性自噬［15］。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路誘導(dǎo)肝癌細胞自噬，從而促進肝癌細胞增殖［16］。這些研究說明自噬在腫瘤病理機制中的復(fù)雜性。

自噬相關(guān)蛋白LC3 參與了自噬的過程，LC3 一般以可溶性胞漿型LC3-Ⅰ的形式存在，細胞自噬時，LC3-Ⅰ酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)橹苄缘腖C3-Ⅱ［17］，LC3-Ⅱ是自噬體膜上的標志性蛋白，能反映細胞自噬體的數(shù)量，而LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值可以評價自噬體的形成［5］。自噬體的數(shù)量與其生成及降解的多少有關(guān)［18］。韓志偉等［19］研究發(fā)現(xiàn)，健脾消積方（太子參、黃芪、白花蛇舌草等藥物組成）能夠抑制SMMC-7721 細胞增殖，并且能夠上調(diào)LC3-Ⅱ和p62 的表達，提示其抗SMMC-7721 細胞可能是使自噬體的生成增多，抑制自噬體的溶解，細胞內(nèi)大量堆積自噬體而導(dǎo)致細胞死亡。龔永昌等［20］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制人胃癌AGS 細胞的增殖，上調(diào)LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62 的表達，姜黃素聯(lián)合自噬抑制劑氯喹進一步增強LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62 的表達，提示姜黃素抗AGS 細胞可能與其抑制細胞自噬流、自噬體降解，使自噬體大量堆積促進細胞死亡有關(guān)。本實驗中，經(jīng)不同濃度的金剛藤含藥血清作用 48 h 后，通過 Western Blot 法觀察 LC3 的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金剛藤可使SMMC-7721 細胞中LC3-Ⅱ的蛋白表達、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高，LC3-Ⅰ表達未見減少，并未出現(xiàn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變，提示自噬體數(shù)量增多，并且自噬體的增多可能與其降解減少有關(guān)。綜合上述實驗結(jié)果，我們認為金剛藤可抑制人肝癌細胞增殖，可能與其抑制肝癌細胞自噬體降解有關(guān)。