祝清燦

［國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂（貴州）制藥有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550026］

藏藥烈香杜鵑精油為杜鵑花科植物烈香杜鵑Rhododendron anthopogonoidesMaxim.、毛花杜鵑Rhododendron cephalanthumFranch.或報(bào)春花狀杜鵑Rhododendron primulaeflarumBur.et Franch.的嫩枝葉及花經(jīng)水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油，為淡黃色至棕黃色或淡綠色至黃綠色的液體，具有特異的香氣，味辛，是藏藥婦潔搽劑（收載于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》外科婦科分冊(cè)）的主要成分之一［1-2］。烈香杜鵑精油中主要含有芐基丙酮（4-苯基-2-丁酮），尚含α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、大牻牛兒酮（杜鵑酮）、檜腦、γ-卡蒂烯等成分［3-6］，具有平喘、鎮(zhèn)咳、抑菌、擴(kuò)張血管等作用［7-10］。劉彬［11］對(duì)黃花杜鵑揮發(fā)油的抑菌作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)以苯甲酸為陽(yáng)性對(duì)照，黃花杜鵑揮發(fā)油對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、普通變形菌、巨大芽孢桿菌的抑菌效果都比苯甲酸強(qiáng)。在藏族地區(qū)民間，烈香杜鵑葉廣泛用于治療支氣管炎、喉炎、尿道炎、消化不良、胃下垂、胃擴(kuò)張、水腫及手、足癬等皮膚?。?2-13］。為了控制產(chǎn)品質(zhì)量，確保臨床療效，本文對(duì)烈香杜鵑精油進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，采用薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別，并參照文獻(xiàn)［14-17］采用氣相色譜法（GC）對(duì)其中的芐基丙酮進(jìn)行含量測(cè)定，為制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫6890A-5973 氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；AB104-N 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；ZF-I三用紫外分析儀（上海銀澤儀器設(shè)備有限公司）；YOKO-ZS 薄層色譜成像儀（武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)）。

1.2 試藥與試劑 烈香杜鵑由青海省食品藥品檢驗(yàn)所楊鳳梅主任鑒定，烈香杜鵑精油樣品（批號(hào)：2015605、20151002、20160503、20170201、20171102、20180703、20181104、20181105、20190506、20191007），由青海普蘭特藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；芐基丙酮對(duì)照品（北京百靈威科技有限公司，批號(hào)LA70N59，含量：99%）；烈香杜鵑油對(duì)照提取物（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111657-200301）；化學(xué)試劑均為分析純（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；硅膠G 預(yù)制板（德國(guó)默克公司生產(chǎn)，批號(hào)HX242369）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別 取本品20 mg，加乙酸乙酯2 ml使溶解，作為供試品溶液。另取烈香杜鵑油對(duì)照提取物，同法制成對(duì)照提取物溶液。再取芐基丙酮對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含10 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法［18］試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（20∶10∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。在日光下觀察，供試品色譜中，在與對(duì)照提取物和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。

圖1 烈香杜鵑精油薄層色譜圖

2.2 芐基丙酮的GC法含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取芐基丙酮對(duì)照品適量，精密稱定，加正己烷制成每1 ml 含0.1 mg 的溶液，作為芐基丙酮對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取烈香杜鵑精油約0.1 g，精密稱定，置50 ml 量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，得烈香杜鵑精油供試品溶液。

2.2.3 氣相色譜條件與系統(tǒng)適用試驗(yàn) 色譜柱為TR-5 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，膜厚0.25 μm）；載氣為高純度氮?dú)猓兌龋?9.999%），流速1.0 ml/min；采用程序升溫：初始溫度為110 ℃，保持8 min 后，以50 ℃/min 的速率升溫至220 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度為220 ℃；檢測(cè)器溫度為240 ℃；分流進(jìn)樣，分流比為20∶1。理論板數(shù)按芐基丙酮峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。見圖2。

在上述色譜條件下，對(duì)照品芐基丙酮的出峰時(shí)間為5.845 min（圖2-A），供試品色譜中，出現(xiàn)與對(duì)照品芐基丙酮相同保留時(shí)間的峰（圖2-B），且與樣品中其他組分色譜峰達(dá)到基線分離。

圖2 烈香杜鵑精油及芐基丙酮GC圖

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 對(duì)烈香杜鵑油供試品溶液進(jìn)行氣相-質(zhì)譜聯(lián)用分析，具體參數(shù)如下：色譜柱：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純度氦氣（純度＞99.999%），流速0.7 ml/min；柱溫為程序升溫：初始溫度為80 ℃，以7 ℃/min 的速率升溫至240 ℃，保持8 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；檢測(cè)器為260 ℃；分流進(jìn)樣，分流比為20∶1。電離方式：EI；離子源溫度：230 ℃；連接線溫度：280 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃。見圖3、圖4。

結(jié)果：在烈香杜鵑精油總離子流圖中，保留時(shí)間為8.656 min的分子離子峰與芐基丙酮峰相似，其裂解與芐基丙酮相同。烈香杜鵑精油供試品中芐基丙酮峰質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)（安捷倫Chemstation 色譜工作站NIST MS Search 2.0標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)）中芐基丙酮的質(zhì)譜圖匹配度為99%，其特征離子分別為148、105 和43，對(duì)應(yīng)質(zhì)譜碎片離子的質(zhì)荷比與對(duì)照品一致，其豐度比偏差在規(guī)定范圍內(nèi)，因此可認(rèn)為是同一物質(zhì)。

圖3 烈香杜鵑精油總離子流圖和芐基丙酮峰質(zhì)譜圖

圖4 芐基丙酮對(duì)照品總離子流圖和芐基丙酮峰質(zhì)譜圖

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取芐基丙酮對(duì)照品0.253 2 g（含量按99.0%計(jì)算），置100 ml量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，濃度為2.507 6 mg/ml。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml、2 ml、3 ml、5 ml、10 ml，置50 ml量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，配制系列濃度對(duì)照品溶液，濃度分別為：0.050 1 mg/ml、0.1003mg/ml、0.1504mg/ml、0.2508mg/ml、0.5015mg/ml。精密吸取1.0 l，注入氣相色譜儀，按照“2.2.3”項(xiàng)測(cè)定。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），芐基丙酮的線性回歸方程為：Y=6 884 451.81X-873 8.65，r=0.999 6。結(jié)果表明：芐基丙酮進(jìn)樣量在0.050 1～0.501 5 μg 范圍內(nèi)，與色譜峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取烈香杜鵑精油（批號(hào)20150605），按“2.2.2 供試品溶液制備”方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)測(cè)定，分別于 0 h、1 h、2.5 h、7.5 h、22 h 測(cè)定峰面積，供試品中芐基丙酮的峰面積平均值為1 102 237，RSD=1.9%（n=5），表明供試品溶液在22 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)烈香杜鵑精油樣品（批號(hào)20150605），精密稱取6 份，每份約0.1 g，精密稱定，按“2.2.2 供試品溶液制備”方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果芐基丙酮含量的平均值為84.79 mg/g，RSD 為1.9%（n=6），表明試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取芐基丙酮對(duì)照品0.050 5 g（含量按99.0%計(jì)算），置50 ml 量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，備用（芐基丙酮濃度為1.000 7 mg/ml）。

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)20150605，芐基丙酮含量為 84.79 mg/g）各 6 份，每份約 0.05 g，精密稱定，置50 ml 量瓶中，分別精密加入上述對(duì)照品溶液5 ml，按“2.2.2 供試品溶液制備”方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果：芐基丙酮的平均回收率為98.21%，RSD=1.92%（n=6），表明試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度較好。見表1。

2.2.9 樣品的測(cè)定 取烈香杜鵑精油10 批，按照“2.2.2 供試品溶液制備”方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)測(cè)定芐基丙酮的含量，結(jié)果見表2。

表1 芐基丙酮加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 （n=6）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

經(jīng)過上述方法學(xué)驗(yàn)證和耐用性試驗(yàn)考察，結(jié)果表明：在本試驗(yàn)的色譜條件下對(duì)芐基丙酮的定量測(cè)定具有專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、分離能力強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于烈香杜鵑精油的質(zhì)量控制。

3 討 論

3.1 薄層色譜鑒別條件選擇 采用環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（20∶10∶1）、環(huán)己烷-乙酸乙酯（17∶3）、石油醚（60～90 ℃）-甲苯-丙酮（20∶16∶1）等展開劑進(jìn)行分離，其中以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（20∶10∶1）分離效果最好，特征斑點(diǎn)清晰圓整。

3.2 氣相色譜法供試品提取溶劑選擇 芐基丙酮含量測(cè)定研究中，分別比較了正己烷、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、石油醚（30～60 ℃）為提取溶劑的芐基丙酮含量結(jié)果，結(jié)果表明：正己烷和乙酸乙酯作為提取溶劑，樣品中芐基丙酮含量較高，但乙酸乙酯空白溶劑在芐基丙酮色譜峰位置有吸收峰，影響含量測(cè)定結(jié)果，故最終選用正己烷為提取溶劑。

3.3 氣相色譜條件選擇 采用不同的進(jìn)樣口溫度（210 ℃、220 ℃、230 ℃）、不同的檢測(cè)器溫度（230 ℃、240 ℃、250 ℃）和不同的柱溫（100 ℃、110 ℃、120 ℃）及不同廠牌（Thermo 和Agilent）和不同長(zhǎng)度的毛細(xì)管柱（TR-5，30 m×0.32 mm，0.25 m 和 HP-5，25 m×0.32 mm，0.17 m）進(jìn)行耐用性試驗(yàn)考察，結(jié)果表明，選擇TR-5 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm），進(jìn)樣口溫度為220 ℃，檢測(cè)器溫度為240 ℃，柱溫為110 ℃時(shí)分離效果最好。

由于烈香杜鵑精油中含有抑菌成分，廣泛應(yīng)用于臨床及藏藥制劑的生產(chǎn)，因此，建立烈香杜鵑精油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制精油質(zhì)量顯得尤為重要，本文的研究結(jié)果為制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。