張麗娜，孔祥珍，華欲飛

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

糖尿病是世界上最普遍和發(fā)展最快的慢性代謝疾病之一，其中2型糖尿病占90%～95%[1-2]。二肽基肽酶4(DPP-Ⅳ)抑制劑是針對(duì)2型糖尿病的最新治療方法[3]。腸促胰島素包括胰高血糖素樣肽1(GLP-1)和葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)，具有維持血糖穩(wěn)態(tài)的作用。DPP-IV是一種普遍存在的酶，可以降解腸促胰島素，引起血糖控制水平的紊亂[4]。因此，通過(guò)抑制DPP-IV的活性來(lái)防止內(nèi)源性腸促胰島素的降解，從而可以更好地實(shí)現(xiàn)血糖調(diào)節(jié)。目前，許多天然的食物蛋白質(zhì)，例如牛奶、燕麥、大米和鰱魚(yú)等，都是DPP-IV抑制肽的良好來(lái)源[5-8]。

核桃粕是核桃油提取過(guò)程的副產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是生產(chǎn)生物活性肽的潛在來(lái)源[9]。為了充分利用核桃的蛋白質(zhì)資源，創(chuàng)造高附加值產(chǎn)品，將核桃粕在蛋白酶作用下水解，以提供更具市場(chǎng)價(jià)值的核桃蛋白水解物，賦予其對(duì)人類健康有益的功能特性。據(jù)報(bào)道，通過(guò)蛋白酶水解產(chǎn)生的核桃蛋白水解物具有多種生物活性，包括抗氧化性、ACE抑制活性、抗高尿酸活性、抗增殖活性和神經(jīng)保護(hù)活性等[10-13]。但迄今為止，尚未報(bào)道核桃蛋白水解物的DPP-IV抑制活性。因此，研究核桃蛋白DPP-IV抑制肽具有巨大的潛力。

本文首先研究了由5種商業(yè)蛋白酶水解的核桃蛋白水解物的DPP-IV抑制活性，選擇制備DPP-IV抑制肽的最適水解酶，通過(guò)超濾結(jié)合離子交換層析分離純化高活性DPP-IV組分。隨后，研究了溫度、pH和模擬胃腸道消化對(duì)核桃蛋白DPP-IV抑制肽活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

核桃粕，晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司；堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；二肽基肽酶4(DPP-Ⅳ)、甘氨酰-脯氨酸-對(duì)硝基苯胺(Gly-Pro-PNA)，Sigma公司；SP Sephadex C-25陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，GE公司；乙腈，色譜純；鹽酸、冰醋酸、氫氧化鈉、氯化鈉、乙酸鈉、甘氨酸、三羥基氨基甲烷、三氟乙酸，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SC-15智能節(jié)能恒溫槽，HimacCR-21G型冷凍離心機(jī)，D-2000 Elite高效液相色譜儀，SCIENTZ-10ND冷凍干燥機(jī)，Enspire型多功能酶標(biāo)儀，Agilent 1100型全自動(dòng)氨基酸分析儀，賽普膜分離裝置。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 核桃蛋白的酶法水解

將核桃粕按料液比1∶10分散在去離子水中，溫育至每種蛋白酶的最適溫度，酶添加量為2%，所有反應(yīng)均在每種酶的最適pH下水解5 h(最適水解條件見(jiàn)表1)。水解結(jié)束后調(diào)節(jié)pH至中性，100℃加熱10 min滅酶，然后冰水浴冷卻至4℃，再在9 000 r/min下離心20 min，取上清液冷凍干燥，得核桃蛋白水解物，-20℃保存。

表1 不同酶的最適水解條件

1.2.2 水解度的測(cè)定

核桃蛋白的水解度按照pH-stat方法測(cè)定[14]，記錄水解過(guò)程中NaOH的添加量，按下式計(jì)算水解度(D)。

D=B×cb/(α×mp×htot)×100%

(1)

式中：B為NaOH消耗量，mL；cb為NaOH的濃度，mol/L；mp為核桃蛋白的質(zhì)量，g；htot為核桃蛋白肽鍵總數(shù)，mmol/g(核桃蛋白htot=7.35 mmol/g)；α為α-氨基的解離度。

1.2.3 Tricine-SDS-PAGE分析

參考Schagger[15]的方法。取適量樣品與樣品溶解液混合，稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，還原電泳需加入20 μL 1 mol/L DTT煮沸5 min，上樣10 μL。濃縮膠4%、分離膠16%，樣品在濃縮膠中電壓為30 V，進(jìn)入分離膠調(diào)整電壓為100 V，直至電泳結(jié)束。將所得凝膠固定、染色和脫色，然后用凝膠成像儀掃描拍照。

1.2.4 DPP-Ⅳ抑制率的測(cè)定

根據(jù)Zhang等[16]的方法測(cè)定。在96微孔板中，將25 μL一定質(zhì)量濃度的樣品(溶解在pH 8.0、100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液中)與25 μL Gly-Pro-PNA(1.6 mmol/L)混合，在37℃孵育10 min，加入50 μL DPP-Ⅳ(8 U/L)，于37℃反應(yīng)60 min，然后添加100 μL乙酸鈉緩沖液(1 mol/L，pH 4.0)中止反應(yīng)，于405 nm處測(cè)量吸光度。以Tris-HCl緩沖液代替DPP-Ⅳ溶液作為空白組，以Tris-HCl緩沖液代替樣品作為對(duì)照組測(cè)量吸光度。按下式計(jì)算DPP-Ⅳ抑制率(Y)。

(2)

式中：As、Ab和Ac分別為樣品組、空白組和對(duì)照組的吸光度。

1.2.5 DPP-Ⅳ抑制肽的分離純化

1.2.5.1 超濾

將堿性蛋白酶水解物凍干樣品溶于去離子水配制成50 mg/mL溶液，依次通過(guò)10 kDa和5 kDa的超濾膜，收集不同相對(duì)分子質(zhì)量(>10 kDa、5～10 kDa、<5 kDa)的肽組分，冷凍干燥并保存在-20℃下，測(cè)定不同組分的DPP-Ⅳ抑制率。

1.2.5.2 陽(yáng)離子交換層析

SP Sephadex C-25陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱用50 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH 4.0)平衡，將超濾后凍干的小于5 kDa的組分用10 mmol/L乙酸緩沖液(pH 4.0)配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的溶液后上樣，首先收集未吸附的組分A，然后用含2 mol/L NaCl的醋酸緩沖液洗脫，收集組分B，將A、B組分分別濃縮，并用截留相對(duì)分子質(zhì)量為100 Da的透析袋在去離子水中透析48 h，冷凍干燥并保存在-20℃下，測(cè)定不同組分的DPP-Ⅳ抑制率及氨基酸組成。氨基酸組成分析參考王俊強(qiáng)等[17]的方法，采用OPA FMOC柱前衍生，通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的穩(wěn)定性分析

1.2.6.1 熱穩(wěn)定性

將核桃蛋白DPP-IV抑制肽溶于去離子水中配制成5 mg/mL的肽溶液，分別在37、50、60、70、80、90、100℃和121℃加熱30 min后，冷卻到室溫，以未加熱(25℃)的樣品作為對(duì)照組，測(cè)定其DPP-Ⅳ抑制率，并表示為相對(duì)于對(duì)照組的活性。

1.2.6.2 pH穩(wěn)定性

用2 mol/L HCl或NaOH將按1.2.6.1配制的5 mg/mL肽溶液的pH分別調(diào)節(jié)為1、3、5、7、9和11，在室溫下孵育30 min。調(diào)節(jié)樣品溶液pH至7.0，測(cè)定其DPP-Ⅳ抑制率，并表示為相對(duì)于對(duì)照組(未經(jīng)任何處理)的活性。

1.2.6.3 體外模擬胃腸道消化穩(wěn)定性

將按1.2.6.1配制的5 mg/mL肽溶液調(diào)節(jié)pH至2.0，加入2%胃蛋白酶，在37℃下孵育120 min，模擬胃消化。然后將混合物pH調(diào)節(jié)至6.8，加入2%胰酶，在37℃下孵育120 min，模擬腸消化。在體外消化過(guò)程中，分別在0、0.5、1、2、2.5、3、4 h取樣，將取得的樣品快速放入沸水浴中10 min，測(cè)定其DPP-Ⅳ抑制率。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS Statistics Base 17.0和OriginPro 8.5分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃蛋白酶法水解條件的確定

2.1.1 蛋白酶的篩選

按照1.2.1方法，采用5種蛋白酶對(duì)核桃蛋白進(jìn)行水解，對(duì)所得核桃蛋白水解物進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：M.Marker；C.核桃蛋白；A、P、F、T、N分別為堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶水解物。

由圖1可看出，核桃蛋白在相對(duì)分子質(zhì)量8.0～75.0 kDa范圍內(nèi)觀察到13條明顯的條帶(泳道C)，不同蛋白酶水解過(guò)程中，高相對(duì)分子質(zhì)量的條帶被水解成低相對(duì)分子質(zhì)量的新條帶，核桃蛋白堿性蛋白酶水解物的蛋白條帶降解最大，其次是復(fù)合蛋白酶水解物，而對(duì)于風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶水解物，核桃蛋白條帶都顯示出較小的降解。

圖2為核桃蛋白及其5種蛋白酶水解物(0.5 mg/mL)的DPP-Ⅳ抑制活性。

注：1、2、3、4、5分別為核桃蛋白堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶水解物；不同字母表示有顯著差異(P<0.05)。

由圖2可看出，核桃蛋白表現(xiàn)出極低的DPP-Ⅳ抑制活性，DPP-IV抑制率小于5%，而5種蛋白酶水解物的DPP-Ⅳ抑制活性顯著高于核桃蛋白。堿性蛋白酶水解物表現(xiàn)出最高的DPP-Ⅳ抑制活性，其次是胰蛋白酶水解物，二者無(wú)顯著差異，但均顯著高于復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶水解物，與Zhang等[5]報(bào)道的胰蛋白酶處理的牛/山羊酪蛋白水解物具有較高的DPP-Ⅳ抑制活性結(jié)果一致。綜上，選擇堿性蛋白酶水解核桃粕。

2.1.2 水解時(shí)間的選擇

按照1.2.1方法，采用堿性蛋白酶分別水解核桃粕1、2、3、4、5 h，測(cè)定不同水解時(shí)間下核桃蛋白水解度及水解物的DPP-Ⅳ抑制活性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同水解時(shí)間下核桃蛋白水解度及水解物(0.5 mg/mL)的DPP-Ⅳ抑制率

由圖3可看出，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度增大，DPP-Ⅳ抑制活性不斷提高，水解5 h時(shí)，核桃蛋白水解物的水解度、DPP-Ⅳ抑制率基本保持不變。因此，選擇水解5 h的核桃蛋白堿性蛋白酶水解物進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 核桃蛋白DPP-IV抑制肽的分離純化

2.2.1 超濾分離組分的DPP-Ⅳ抑制活性

堿性蛋白酶水解物經(jīng)超濾分離的3個(gè)不同相對(duì)分子質(zhì)量肽組分的DPP-Ⅳ抑制活性如圖4所示。

注：對(duì)照為堿性蛋白酶水解物。

由圖4可看出，超濾獲得的3個(gè)肽組分均表現(xiàn)出DPP-Ⅳ抑制活性，與核桃蛋白堿性蛋白酶水解物相比，5～10 kDa和小于5 kDa組分顯示出更強(qiáng)的DPP-Ⅳ抑制活性，在0.25 mg/mL的質(zhì)量濃度下其DPP-Ⅳ抑制率分別為28.65%和31.71%，而大于10 kDa組分與核桃蛋白堿性蛋白酶水解物沒(méi)有顯著差異。因此，將具有較高DPP-Ⅳ抑制活性的小于5 kDa組分凍干，用于SP Sephadex C-25陽(yáng)離子交換層析進(jìn)一步純化。

2.2.2 陽(yáng)離子交換層析各組分的DPP-IV抑制活性

采用1.2.5.2方法由堿性蛋白酶水解物小于5 kDa組分進(jìn)一步分離得到的組分A和B的DPP-Ⅳ抑制活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5，氨基酸組成及含量見(jiàn)表2。

圖5 陽(yáng)離子交換層析各組分(0.25 mg/mL)的DPP-Ⅳ抑制率

由圖5可看出，在0.25 mg/mL的質(zhì)量濃度下，組分B的DPP-Ⅳ抑制率為76.19%，顯著高于組分A(38.94%)，比未分離的堿性蛋白酶水解物的高約3倍。

表2 陽(yáng)離子交換層析各組分的氨基酸組成及含量%

由表2可看出，堿性蛋白酶水解物的主要氨基酸是谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸。堿性蛋白酶水解物、組分A和組分B含有的疏水性氨基酸比例分別為31.17%、33.85%和26.25%，酸性氨基酸比例分別為33.42%、40.97%和24.72%，堿性氨基酸比例分別為17.66%、7.47%和34.36%。與堿性蛋白酶水解物和組分A相比，組分B含有較高含量的堿性氨基酸，尤其是精氨酸。在陽(yáng)離子交換過(guò)程中，帶負(fù)電(Asp和Glu)的多肽未被吸附，帶正電(Arg、His和Lys)的多肽吸附后被洗脫[18]，所以組分A含有高含量的酸性氨基酸，組分B含有大量堿性氨基酸。

綜上，選擇組分B作為最終的核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽并進(jìn)行穩(wěn)定性分析。

2.3 核桃蛋白DPP-IV抑制肽的穩(wěn)定性

2.3.1 熱穩(wěn)定性(見(jiàn)圖6)

圖6 核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的熱穩(wěn)定性

由圖6可看出，分離純化得到的DPP-Ⅳ抑制肽經(jīng)過(guò)不同溫度處理后，仍保持較高的DPP-Ⅳ抑制活性。值得注意的是，在80℃加熱30 min，核桃肽的DPP-Ⅳ抑制活性提高了約4%，121℃處理30 min，DPP-Ⅳ抑制活性損失了約5%，結(jié)果表明核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽具有較好的熱穩(wěn)定性，可以應(yīng)用到熱處理食品中。

2.3.2 pH穩(wěn)定性(見(jiàn)圖7)

圖7 核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的pH穩(wěn)定性

由圖7可看出，在強(qiáng)酸(pH 1.0)和強(qiáng)堿(pH 11.0)條件下，核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的DPP-Ⅳ抑制活性略有損失，這可能是由于抑制肽在酸性或堿性過(guò)強(qiáng)的條件下降解成非活性片段[19]。核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的活性在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)十分穩(wěn)定，表明核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽可以應(yīng)用到寬pH范圍的食品體系中，并保留其生物活性。

2.3.3 體外模擬胃腸道消化穩(wěn)定性(見(jiàn)圖8)

圖8 核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的體外模擬胃腸消化穩(wěn)定性

為了使生物活性肽在體內(nèi)發(fā)揮其活性，要滿足的要求之一是能抵抗胃腸道消化和降解的能力，通過(guò)腸道能夠被完整吸收。體外模擬胃腸道消化可用于研究生物活性肽在體內(nèi)的生物利用度。由圖8 可看出，在胃環(huán)境中消化30 min，核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的DPP-Ⅳ抑制率由76.19%降低至73.29%，但隨著消化的繼續(xù)進(jìn)行，DPP-Ⅳ抑制活性有所提高，在十二指腸環(huán)境中，DPP-Ⅳ抑制活性繼續(xù)提高并趨于穩(wěn)定。我們推測(cè)在胃腸道消化后，可能產(chǎn)生了一些新的活性肽，這些肽具有較高的DPP-Ⅳ抑制活性，因此DPP-Ⅳ抑制率有所增加。有研究報(bào)道，相對(duì)分子質(zhì)量較小的短鏈肽通常對(duì)胃腸道酶具有抵抗力，對(duì)胃腸道消化實(shí)驗(yàn)顯示出非常穩(wěn)定的活性[20]。本研究結(jié)果表明，在模擬胃腸道消化過(guò)程中，核桃蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的活性結(jié)構(gòu)并沒(méi)有被胃腸道蛋白酶破壞，其活性得到很好的保留。

3 結(jié) 論

采用蛋白酶水解核桃粕中的蛋白質(zhì)，經(jīng)分離純化得到DPP-Ⅳ抑制肽，研究了DPP-Ⅳ抑制肽的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，堿性蛋白酶水解物經(jīng)過(guò)超濾和陽(yáng)離子交換層析分離后得到的核桃蛋白DPP-IV抑制肽，在0.25 mg/mL的質(zhì)量濃度下，DPP-Ⅳ抑制率為76.19%，其DPP-Ⅳ抑制活性在寬溫度和pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，且在模擬胃腸道系統(tǒng)中，消化后的DPP-Ⅳ抑制活性有所提高。本文研究結(jié)果為食源DPP-IV抑制活性肽作為人體降血糖功能膳食的開(kāi)發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。本課題組后續(xù)將進(jìn)一步研究DPP-IV抑制肽結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，并評(píng)估其抑制模式和體內(nèi)功效。