劉悅，汪飛燕，葉狀，宿世杰，侯照峰，許金俊，陶建平，劉丹丹*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

雞球蟲病是一種危害嚴(yán)重的寄生性原蟲病，每年給全球養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雞球蟲病通常由7種艾美耳屬球蟲單獨(dú)或混合感染引起，其中柔嫩艾美耳球蟲是致病性最強(qiáng)的蟲種，重度感染可引起急性盲腸球蟲病。目前國內(nèi)外主要通過化學(xué)藥物防控球蟲病，隨著抗球蟲藥大量廣范使用，耐藥性的產(chǎn)生以及藥物殘留引起的食品安全問題也逐漸為人們所重視，而傳統(tǒng)活疫苗免疫的方法也存在散播病原的風(fēng)險(xiǎn)且穩(wěn)定性較差，因此重組亞單位疫苗成為更被關(guān)注的球蟲病防治手段[1]。已有研究報(bào)道巨型艾美耳球蟲配子體基因Emgam56和Emgam82的原核表達(dá)重組蛋白免疫雛雞，可以有效降低卵囊產(chǎn)量和病變記分，具有一定的免疫保護(hù)力[2]，且2種配子體蛋白GAM56和GAM82在卵囊壁形成過程中發(fā)揮重要作用，推測(cè)其可能通過免疫阻斷作用阻斷卵囊發(fā)育[3-4]。本文對(duì)柔嫩艾美耳球蟲配子體蛋白編碼基因gam56(Etgam56)進(jìn)行了克隆和序列分析，構(gòu)建原核表達(dá)載體并進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的抗原性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，旨為研制新型球蟲亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株

柔嫩艾美耳球蟲揚(yáng)州株，由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室經(jīng)單卵囊分離建株，定期經(jīng)無球蟲污染的雞傳代保種。

1.2 主要試劑材料

pMD20-T載體，購自TaKaRa公司。大腸桿菌DH5α和BL21菌株、表達(dá)載體pET-28a(+)，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。PrimeSTAR GXL DNA Polymerase，Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR，Hind Ⅲ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶，TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit等，均購自寶生物工程(大連)有限公司；Ni-NTA親和層析介質(zhì)，購自金斯瑞生物科技公司；6×Loading Buffer，購自碧云天公司；硝酸纖維素膜，購自默克公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑，購自Tanon公司；Anti-6×HIS標(biāo)簽小鼠單抗和HRP標(biāo)記的家兔抗小鼠IgG，購自BBI公司；HRP標(biāo)記的綿羊抗雞IgG，購自HPL公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中收錄的柔嫩艾美耳球蟲Etgam56基因序列(XM_013376832.1)，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)3條特異性引物，F(xiàn)1：5′-ATGACTCGCCTCAGCCTCT-3′；F2：5′-TTACGGAGGAACGGGGCCGAA-3′；F3：5′-TACAGCTACAGGTACCCCTCC-3′。引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.4 球蟲卵囊總DNA的提取

取實(shí)驗(yàn)室提取、保存的柔嫩艾美耳球蟲配子體，按TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit說明提取基因組DNA。

1.5 Etgam56基因的擴(kuò)增

參照PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase說明書，PCR法擴(kuò)增Etgam56，以F1為上游引物、F2為下游引物擴(kuò)增基因全長(zhǎng)序列，由于該基因下游GC含量較高，為保證擴(kuò)增序列的準(zhǔn)確性，以F3為上游引物、F2為下游引物單獨(dú)擴(kuò)增高GC片段。50 μL PCR反應(yīng)體系：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP混合物(每種2.5 mmol/L)4 μL，F(xiàn)1/F2/F3引物(10 mmol/L)各1 μL，模板(30 ng/μL)2 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.5 U/μL)1 μL，滅菌水31 μL，反應(yīng)條件為：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，68 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段分別為1 425 bp(引物F1和F2)和573 bp(引物F3和F2)。

1.6 Etgam56基因的克隆與序列分析

將含有目的片段的PCR產(chǎn)物分別經(jīng)試劑盒純化回收后，參照Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR?說明書對(duì)純化的PCR產(chǎn)物3′端添加“A”堿基，構(gòu)建pMD20-T-Etgam56克隆質(zhì)粒，常規(guī)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑選白斑，提取質(zhì)粒，經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切鑒定為陽性的克隆，送華大基因科技股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序得到的兩段核苷酸序列進(jìn)行拼接，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.7 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏嗜性，將Etgam56基因序列進(jìn)行優(yōu)化合成后連接至pET-28a(+)，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a(+)-Etgam56，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，挑取陽性重組菌進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)。

1.8 重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化與可溶性分析

1.8.1 IPTG濃度的確定

將陽性重組菌的單菌落接種卡那霉素(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)，按1∶100轉(zhuǎn)接種3 mL含相同濃度卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)4 h后，分別加入終濃度為0.10、0.30、0.50、0.70和1.00 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h；取誘導(dǎo)后重組菌1 mL，PBS洗滌3次后，200 μL PBS重懸菌體，加入40 μL 6×SDS-PAGE上樣緩沖液，12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

1.8.2 最佳誘導(dǎo)溫度的確定

將重組菌分組接種到含有卡那霉素(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)4 h后，分別加入終濃度為0.10 mmol/L的IPTG，分別置于10 ℃、16 ℃、20 ℃、37 ℃環(huán)境中誘導(dǎo)表達(dá)20 h；取誘導(dǎo)后重組菌1 mL，懸浮于200 μL PBS中，冰浴超聲裂解(功率30%，超聲2 s，間歇3 s，5 min)，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后分別取上清和沉淀(沉淀用200 μL PBS稀釋)進(jìn)行SDS-PAGE。

1.8.3 最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定

將重組菌分組接種到含有卡那霉素(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)4h后，分別加入終濃度為0.10 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，分別于誘導(dǎo)后1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、8.0、12.0、16.0及20.0 h取重組菌1 mL，PBS洗滌3次后，200 μL PBS重懸菌體，加入40 μL 6 × SDS-PAGE上樣緩沖液，12 000 r/min離心10 min后分別取上清進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

1.9 重組蛋白的特異性檢測(cè)

將誘導(dǎo)的陽性重組菌蛋白、pET-28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌蛋白以及未經(jīng)轉(zhuǎn)化的BL21菌體蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到NC膜上。轉(zhuǎn)印結(jié)束后參照劉丹丹等[5]方法進(jìn)行Western blot檢測(cè)。其中一抗為6×HIS標(biāo)簽單抗(用封閉液按1∶5 000倍稀釋)，二抗為HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(用封閉液按1∶15 000倍稀釋)。ECL化學(xué)發(fā)光顯色，天能5200成像系統(tǒng)觀察顯色結(jié)果并掃描保存。

1.10 重組蛋白的純化與復(fù)性

取誘導(dǎo)后的重組菌250 mL，離心收集沉淀，經(jīng)PBS洗滌后重懸于10 mL PBS中，冰浴超聲釋放包涵體；4 ℃ 12 000 r/min 離心 15 min，棄上清，將沉淀重懸于10 mL LE Buffer，冰浴超聲加速包涵體溶解；4℃ 12 000 r/min 離心 15 min，將上清移入Ni-NTA親和純化層析柱中，4℃結(jié)合30 min；用2×層析柱體積的Washing Buffer洗滌層析柱3次，用2×層析柱體積的Elution Buffer洗滌層析柱3次，收集Elution Buffer的洗脫液，轉(zhuǎn)移至透析袋中，分別置于含有6、4、2及1 mol/L尿素的透析液和0.1 mol/L PBS 中4 ℃復(fù)性6～8 h，最終PEG8 000濃縮，收集蛋白。

1.11 重組蛋白的免疫學(xué)鑒定

參照1.9的方法，分別以雞抗柔嫩艾美耳球蟲康復(fù)血清、雞抗毒害艾美耳球蟲康復(fù)血清(由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室制備保存)為一抗，以HRP標(biāo)記的綿羊抗雞IgG為二抗，對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western blot抗原性和種間交叉反應(yīng)性檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增得到的目的片段大小分別為1 425 bp、673 bp左右，與預(yù)期大小相符(圖1)。

2.2 核苷酸序列分析

將酶切鑒定為陽性的克隆(圖2)進(jìn)行測(cè)序，將分段克隆的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，兩段序列重疊237 bp左右，拼接后所得序列全長(zhǎng)為1 425 bp。將所測(cè)序列與發(fā)表在GenBank中的Eagam56(XM_013395657.1、XM_013395658.1)、Emgam56(AY129951.2、XM_013478110.1、XM_013478111.1)和Engam56(XM_013585547.1)進(jìn)行序列比對(duì)，同源性分別為67.3%、51.0%、68.9%、51.0%、69.1%、87.9%。

M.DL2000 DNA Marker；1.Etgam56擴(kuò)增產(chǎn)物(F1，F(xiàn)2)；2.Etgam56擴(kuò)增產(chǎn)物(F3，F(xiàn)2)圖1 Etgam 56的PCR擴(kuò)增

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，2.重組質(zhì)粒HindⅢ和BamHⅠ雙酶切產(chǎn)物圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.3 氨基酸序列分析

氨基酸序列分析顯示，Etgam56基因共編碼474個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為53.74 ku，等電點(diǎn)(PI)為4.92，pH值為7.0時(shí)電離點(diǎn)為-10.641，含有33個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸(K、R)，44個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸(D、E)，98個(gè)疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)，170個(gè)極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。該蛋白富含脯氨酸(13.47%)、蘇氨酸(10.11%)、酪氨酸(9.68%)、絲氨酸(8.84%)、甲硫氨酸(7.58%)，且含有1個(gè)酪氨酸和絲氨酸富集區(qū)(第245-321位)和1個(gè)脯氨酸和甲硫氨酸富集區(qū)(第339-454位)。抗原決定簇在線分析顯示，此蛋白共含有9個(gè)抗原決定簇，顯示其具有較好的抗原性。

2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及不同條件對(duì)表達(dá)水平的影響

將重組質(zhì)粒pET-28(+)-Etgam56轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，重組蛋白(rEtGAM56)大小為56 ku左右。IPTG濃度為0.10 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)3 h的蛋白表達(dá)量最高。

2.5 重組蛋白的純化與復(fù)性

在最適表達(dá)條件下，大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，經(jīng)HIS標(biāo)簽Ni-NTA親和層析柱純化，收集純化過程中不同時(shí)期流出液進(jìn)行12% SDS-PAGE，結(jié)果顯示，裂解液中的蛋白能與Ni-NTA較好結(jié)合，經(jīng)3次Washing Buffer洗滌，可有效去除未與Ni-NTA結(jié)合的雜蛋白，Elution Buffer可以有效洗脫目的蛋白，純化效果較好，且復(fù)性過程中未發(fā)生蛋白降解(圖3)。

M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；1.包涵體尿素裂解后上清；2.裂解液與 Ni-NTA 結(jié)合后的流出液；3.Washing Buffer 第3次洗脫液；4.Elution Buffer第1次洗脫液；5.Elution Buffer第3次洗脫液；6.純化復(fù)性后蛋白圖3 重組蛋白的純化與復(fù)性

2.6 重組蛋白的鑒定

Western blot分析顯示，重組蛋白能被抗6×HIS標(biāo)簽單克隆抗體特異性識(shí)別(圖4)，在56 ku左右出現(xiàn)目的條帶，而pET-28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌蛋白對(duì)照組未見條帶，證實(shí)Etgam56基因成功體外表達(dá)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-28a(+)/BL21 IPTG誘導(dǎo)；2.pET-28a(+)-Etgam56/BL21 IPTG誘導(dǎo)圖4 重組蛋白的特異性鑒定

2.7 重組蛋白抗原性分析

Western blot分析顯示，柔嫩艾美耳球蟲病雞康復(fù)血清(圖5)和毒害艾美耳球蟲的雞康復(fù)血清(圖6)特異性識(shí)別，而pET-28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌蛋白未與抗體發(fā)生反應(yīng)，顯示重組蛋白具有較好的抗原性和交叉抗原性。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-28a(+)/BL21 IPTG誘導(dǎo)；2.pET-28a(+)-Etgam56/BL21 IPTG誘導(dǎo)圖5 抗雞柔嫩艾美耳球蟲康復(fù)血清的Western blot檢測(cè)

M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量；1.pET-28a(+)-Etgam56/BL21 IPTG 誘導(dǎo)；2.pET-28a(+)/BL21 IPTG 誘導(dǎo)圖6 抗雞毒害艾美耳球蟲康復(fù)血清的Western blot檢測(cè)

3 討論

經(jīng)序列分析顯示Etgam56基因無內(nèi)含子序列，故本研究提取了柔嫩艾美耳球蟲配子體的基因組DNA，采用PCR方法擴(kuò)增目的基因，鑒于片段大小以及高GC含量，同時(shí)考慮到測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，特設(shè)計(jì)了中間引物F3擴(kuò)增序列后段的高GC區(qū)域，所得序列經(jīng)Lasergene7.0分析，拼接后的序列大小為1 425 bp，為一個(gè)完整閱讀框，編碼474個(gè)氨基酸，含有1個(gè)酪氨酸和絲氨酸富集區(qū)(第245-321位)、1個(gè)脯氨酸和甲硫氨酸富集區(qū)(第339-454位)，在線軟件(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)預(yù)測(cè)抗原決定簇，結(jié)果顯示，該蛋白共含有9個(gè)抗原決定簇，其中最長(zhǎng)的抗原決定簇富含酪氨酸和絲氨酸，且位于酪氨酸和絲氨酸富集區(qū)內(nèi)，符合雞球蟲配子體蛋白基因在氨基酸序列上的結(jié)構(gòu)域特征[6-7]。核酸序列分析顯示與其他配子體蛋白編碼基因具有較高的同源性，故證實(shí)研究獲得的基因確為柔嫩艾美耳球蟲Etgam56基因。

球蟲的生活史復(fù)雜，不同發(fā)育階段不同抗原的免疫原性也有較大的差別，配子體蛋白是卵囊壁的前體蛋白，推測(cè)其在囊壁形成過程中發(fā)揮重要作用。目前已經(jīng)報(bào)道的配子體蛋白編碼基因主要有：巨型艾美耳球蟲的Emgam56、Emgam82[8]和Emgam230[9]，柔嫩艾美耳球蟲的Etgam56 (Etgam56 tmp1)、Etgam59 (Etgam56 tmp2)和Etgam22[10]，毒害艾美耳球蟲的Engam59和Engam22[11]，堆型艾美耳球蟲的Eagam56[12]。有研究證明，分離于巨型艾美耳球蟲突然配子體內(nèi)的EmGAM56、EmGAM82和EmGAM230蛋白，以及體外重組表達(dá)的rEmGAM82和rEmGAM56，均能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)，在一定程度上抑制巨型艾美耳球蟲的發(fā)育，降低卵囊產(chǎn)量，具有一定的免疫保護(hù)效果[13]。本研究中獲得的重組蛋白rEtGAM56能被柔嫩艾美耳球蟲的雞康復(fù)血清所識(shí)別，同時(shí)也可被毒害艾美耳球蟲的雞康復(fù)血清所識(shí)別，顯示該重組蛋白具有良好的抗原性和一定的種間交叉反應(yīng)性，但其對(duì)雞體的免疫保護(hù)效果還有待進(jìn)一步研究。