廖書漪，徐立新，宋小凱，李祥瑞，嚴若峰，2*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095；2.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

旋毛蟲病(Trichinosis)是由旋毛形線蟲(Trichinellaspiralis)引起的一種食源性人獸共患病，對動物生產(chǎn)和人類公共衛(wèi)生安全帶來嚴重危害[1]。該病在我國人群和動物中廣泛流行，已在豬、犬、牛、羊、貓、鼠、狐貍、黃鼠狼、貂、貉、熊及麂等多種動物中發(fā)現(xiàn)該病，隨著飼養(yǎng)動物及居民肉類消費量的增加，以及感染動物種類的增加，人的發(fā)病率不斷呈上升和擴散趨勢[2-4]。我國旋毛蟲病的防治工作任務(wù)艱巨，研究旋毛蟲的免疫機理、發(fā)掘新的免疫保護性抗原，對防控該病具有重要意義。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲二肽基肽酶1(dipeptidyl peptidase 1,Dpp1)在體外對大鼠外周血單個核細胞的增殖、遷移、一氧化氮分泌和吞噬功能等具有促進作用[5]。但該蛋白是否具有免疫保護作用等尚不清楚。鑒于此，本研究在大鼠體內(nèi)開展了Dpp1的免疫保護試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與蟲株

Wistar大鼠、SD大鼠和BALB/c小鼠購自揚州大學實驗動物中心。旋毛蟲蟲株為中國河南豬分離株，國際編號為ISS534，由本實驗室傳代保存于BALB/c小鼠體內(nèi)。

1.2 菌種和重組蛋白

重組菌株BL21/pET-32a和BL21/pET-32a-Dpp1由本實驗室保存。pET-32a空載體蛋白和rDpp1重組蛋白的表達和純化方法均參考文獻[5]。

1.3 主要試劑

大鼠IL-4、IL-9、IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和IFN-γ的ELISA檢測試劑盒購自南京金益柏生物有限公司。HRP標記的山羊抗小鼠IgG、IgG1、和IgG2a抗體為Abcam公司產(chǎn)品。RPMI細胞培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco公司。

1.4 rDpp1對大鼠分泌細胞因子的影響

將50只標準體重的SD大鼠隨機分成5組(n=10)。第1組腹腔注射PBS，第2組腹腔注射160 μg pET-32a空載體蛋白，第3～5組分別腹腔注射10、40和160 μg重組蛋白rDpp1，每組每只大鼠注射體積均為1 mL。于注射前(第0天)，注射后第1、2、3、4、5和6天采集血清，用ELISA試劑盒檢測IL-4、IL-9、IL-17、TGF-β和IFN-γ等細胞因子的變化。

1.5 rDpp1抗體的制備

將200 μg重組rDpp1蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化后，對Wistar大鼠背部皮下多點注射進行第1次免疫。2周后將與第1次免疫同等體積的重組蛋白混合弗氏不完全佐劑乳化后，進行第2次免疫。之后，每隔1周進行第3次和第4次免疫。第4次免疫1周后，眼眶采血，分離血清并分裝，-20 ℃凍存。

1.6 rDpp1抗體對旋毛蟲肌肉幼蟲感染能力的抑制作用

將30只BALB/c小鼠隨機分成3組(n=10)，分別為PBS組、陰性血清組和抗rDpp1血清組。在細胞培養(yǎng)板(6孔板選其中3孔)每孔加入8 000條旋毛蟲肌肉幼蟲，再分別加入500 μL的PBS、陰性血清以及抗rDpp1血清，用含20%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液補至2 mL，37 ℃孵育2 h。檢查蟲體活力，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，每只小鼠經(jīng)口感染500條肌肉幼蟲。小鼠感染5 d后，取小腸，收集成蟲并計數(shù)。

1.7 rDpp1的免疫程序與攻蟲

將60只BALB/c小鼠隨機分成3組(n=20)，分別命名為rDpp1、pET-32a和PBS組。采用背部皮下多點注射方法進行免疫，于第0天用弗氏完全佐劑乳化蛋白(40 μg rDpp1或pET-32a空載體蛋白)或PBS進行第1次免疫，第14天用弗氏不完全佐劑乳化蛋白或PBS進行第2次免疫。于第28天對每只小鼠灌胃感染肌肉幼蟲400條。

1.8 抗rDpp1抗體的檢測

分別于免疫后第0、7、14、21和28天，從小鼠眼眶后靜脈叢采血，收集血清，用ELISA方法檢測抗rDpp1特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體水平。

1.9 成蟲和肌肉幼蟲荷蟲數(shù)分析

于第33天(人工感染5 d后)，每組隨機選取10只小鼠，取小腸，分離旋毛蟲成蟲并計數(shù)。于第63天(人工感染35 d后)，取每組剩下的10只小鼠、撲殺，分離肌肉組織、稱重、剪碎、消化，計算每克肌肉中旋毛蟲肌肉幼蟲的數(shù)量。具體方法參考文獻[6]。

2 結(jié)果

2.1 rDpp1對大鼠分泌細胞因子的影響

腹腔注射重組蛋白rDpp1后，大鼠體內(nèi)IFN-γ的分泌水平顯著高于PBS空白對照組與pET-32a空載體蛋白對照組(圖1A)；IL-17的分泌在第2、3天顯著低于PBS空白對照組與pET-32a空載體蛋白對照組(圖1B)。而與對照組相比，IL-4(圖1C)、IL-9(圖1D)和TGF-β(圖1D)的分泌水平無顯著變化。

2.2 抗rDpp1抗體對旋毛蟲肌肉幼蟲感染能力具有抑制作用

將抗rDpp1抗體與旋毛蟲肌肉幼蟲共孵育后感染小鼠，對腸道成蟲數(shù)進行分析，結(jié)果如圖2所示，PBS對照組旋毛蟲成蟲數(shù)為(438±116)個，陰性血清組為(423±54)個，抗rDpp1血清組為(266±50)個?？箁Dpp1血清組成蟲數(shù)量顯著低于PBS組(P<0.05)，成蟲減少率為39.27%。陰性血清組和PBS對照組間差異不顯著。

注：與PBS組比較，*P<0.05，**P<0.01；***P<0.001。下同A.IFN-γ；B.IL-17；C.IL-4；D.IL-9；E.TGF-β圖1 rDpp1對大鼠細胞因子分泌的影響

圖2 抗rDpp1抗體對旋毛蟲肌肉幼蟲感染能力的影響

2.3 rDpp1免疫后宿主抗體水平的變化

抗rDpp1特異性IgG、IgG1亞型和IgG2a亞型抗體的檢測結(jié)果如圖3所示，第一次免疫7天后，rDpp1重組蛋白免疫組IgG水平顯著高于PBS和pET-32a組(P<0.05)，且PBS空白對照組和pET-32a空載體蛋白組之間差異不顯著(P>0.05)。第二次免疫后7天與14天(第21、28天)，rDpp1組抗體水平持續(xù)升高，與對照相比差異極顯著(P<0.001)。

A.IgG;B.IgG1;C.IgG2a圖3 小鼠血清特異性抗體的變化

2.4 成蟲和肌肉幼蟲荷蟲量的變化

腸道成蟲計數(shù)結(jié)果如圖4A所示，PBS空白對照組旋毛蟲成蟲數(shù)為(109±23)個，pET-32a組為(89±32)個，rDpp1重組蛋白免疫組為(57±20)個。rDpp1免疫組成蟲數(shù)量顯著低于PBS組(P<0.01)，成蟲荷蟲量減少47.70%。pET-32a組和PBS空白對照組差異不顯著(P>0.05)。

肌肉幼蟲計數(shù)統(tǒng)計結(jié)果如圖4B所示，PBS組每克肌肉中旋毛蟲肌肉幼蟲數(shù)量為(3 393±560)個，pET-32a組為(2 871±616)個，rDpp1重組蛋白免疫組為(1 203±125)個。rDpp1免疫組肌肉幼蟲數(shù)量顯著低于PBS組(P<0.001)，減蟲率為64.54%。pET-32a組和PBS組差異不顯著(P>0.05)。

圖4 旋毛蟲成蟲(A)和肌肉幼蟲(B)荷蟲數(shù)

3 討論

近年來，旋毛蟲病研究在流行病學、診斷、病原生物學等方面取得了重要進展[7-14]，特別是旋毛蟲基因組計劃的實施和基因草圖的完成[15]，為其分子生物學和免疫學等研究提供了重要支持。然而，目前仍然沒有商品化的疫苗用于該病的預防。深入研究旋毛蟲與宿主間相互作用，尤其是蟲體對宿主的免疫調(diào)節(jié)機制，對發(fā)掘新型疫苗候選抗原具有重要意義。體外試驗發(fā)現(xiàn)旋毛蟲二肽基肽酶1對宿主外周血單個核細胞的免疫功能具有顯著的刺激作用，是潛在的免疫保護性抗原[5]，本研究通過動物體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)重組Dpp1免疫小鼠后，成蟲和肌肉幼蟲分別減少了47.7%和64.5%，產(chǎn)生了較好的免疫保護效果。

在抗寄生蟲感染過程中，Th1和Th2型免疫反應及相關(guān)細胞因子發(fā)揮著重要作用[16]。旋毛蟲在腸道寄生階段，開始主要以Th1型免疫應答為主，之后以Th2型為主；在肌肉寄生階段則以Th2型免疫反應為主，并在肌肉組織附近誘導產(chǎn)生調(diào)節(jié)型T細胞(Treg)[17]。這些研究結(jié)果提示旋毛蟲具有較強的調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)的能力[18]。本研究檢測分別代表Th1、Th2、Th9、Th17和Treg等亞型免疫反應的細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-9、IL-17和TGF-β，探究rDpp1蛋白對宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射rDpp1后大鼠體內(nèi)IFN-γ的分泌水平顯著高于對照組，推測該重組蛋白能夠引起宿主Th1型免疫反應，這與Picherot等[19]認為旋毛蟲入侵機體后主要引起Th1型免疫應答相一致。

由Th2細胞介導的體液免疫所產(chǎn)生的特異性IgG抗體，在抗旋毛蟲感染中同樣發(fā)揮重要作用[20]。本研究通過體外抗體阻斷試驗也直接證明了抗體的抗感染作用。旋毛蟲感染誘導機體產(chǎn)生IgG，該類抗體也是免疫學診斷和流行病學調(diào)查的重要指標[21]。研究表明中性粒細胞和單核細胞對旋毛蟲肌幼蟲的殺傷作用主要依賴IgG，通過與IgG類抗體結(jié)合發(fā)揮ADCC效應[22-23]。IgGl亞型抗體主要反映Th2型免疫應答，而IgG2a亞型抗體水平反映Th1型免疫應答[20]。本研究結(jié)果顯示，佐劑乳化的rDpp1重組蛋白免疫小鼠后能引起特異性IgG抗體產(chǎn)生，為混合型Th1/Th2免疫應答。

綜上，本研究證實旋毛蟲rDpp1具有較好的免疫保護作用。研究結(jié)果為深入調(diào)查Dpp1功能奠定基礎(chǔ)。