崔 平，方素芳，顧小龍，索 勛

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100094；2.河北北方學(xué)院動(dòng)科院，河北張家口 075000）

兔球蟲?。≧abbit coccidiosis）是一類由艾美耳屬（Eimeria）及其他屬的球蟲寄生于家兔肝膽管及腸上皮細(xì)胞內(nèi)而引起的寄生性原蟲?。?］。本病流行非常普遍，世界各地均有發(fā)生，具有很高的發(fā)病率和病死率［2］。隨著養(yǎng)兔規(guī)模不斷擴(kuò)大，對養(yǎng)兔業(yè)的危害也日益嚴(yán)重，尤以斷奶至2月齡的幼兔最易感，感染率本研究在對河北省兔球蟲流行病學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)極高，幾乎達(dá)100%。

本研究在對河北省兔球蟲流行病學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上，分離出致病力強(qiáng)的大型艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲以及致病力中等但感染率很高的中型艾美耳球蟲，進(jìn)一步研究在接種劑量、兔的品種、日齡相同的情況下，卵囊產(chǎn)量和排卵高峰與兔艾美耳球蟲蟲種關(guān)系，以此為兔球蟲的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 無球蟲試驗(yàn)用兔 從張家口市實(shí)驗(yàn)?zāi)翀鲑徺I新斷奶的塞北兔。單籠飼養(yǎng)于經(jīng)過火焰消毒過的鐵絲籠中，飼喂經(jīng)過高溫處理的自配兔飼料，在飼料中加入莫能菌素，每天用飽和鹽水漂浮法檢查兔糞中有無球蟲卵囊，直至查不到卵囊時(shí)開始停藥1周，1周內(nèi)持續(xù)檢查卵囊有無，確定試驗(yàn)兔不再排出卵囊時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 主要設(shè)備 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，SPX智能型生化培養(yǎng)箱，雙目顯微鏡，數(shù)碼相機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 4種兔艾美耳球蟲蟲株的獲得 兔糞來自張家口、邢臺、保定、廊坊、衡水等地區(qū)的農(nóng)戶飼養(yǎng)和養(yǎng)兔場的不同日齡兔，采用常規(guī)方法處理兔糞，收集卵囊孢子化，在高倍鏡下根據(jù)形態(tài)學(xué)特征確定大型艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲及中型艾美耳球蟲，分離純種。無菌接種無球蟲幼兔，根據(jù)不同種的潛在期收集糞便從而獲得4種兔艾美耳球蟲的純種卵囊，培養(yǎng)至孢子化。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將培養(yǎng)獲得的20只45日齡無球蟲兔，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，4個(gè)感染組和1個(gè)未感染對照組，每組4只，感染組經(jīng)口接種1×104個(gè)卵囊／只。從感染后第4天開始，根據(jù)不同種的潛在期，在每種艾美耳球蟲排出前1天，每隔2h用飽和鹽水漂浮法糞檢，直至有卵囊排出，在卵囊排出期間每24h收集糞便1次。

1.2.3 樣品OPG的計(jì)算 將每天收取的糞便用天平稱取2g放入燒杯內(nèi)，先加飽和鹽水10mL，用玻璃棒攪拌均勻后再加入飽和鹽水50mL，攪拌均勻，立即用吸管插入液體中央吸取液體，加入麥克馬斯板的計(jì)數(shù)室內(nèi)，使其充滿，置于顯微鏡下，靜置2min后開始計(jì)數(shù)，不遺漏不重復(fù)計(jì)數(shù)（計(jì)數(shù)室內(nèi)1cm2均分為100個(gè)小格）刻度中的蟲卵總數(shù)×200即為每克糞便中的蟲卵數(shù)。

圖1 大型艾美耳球蟲Fig.1 E.magna

圖3 黃艾美耳球蟲Fig.3 E.flavescens

2 結(jié)果

2.1 4種兔艾美耳球蟲的純化

根據(jù)單卵囊分離的常規(guī)方法成功獲得大型艾美耳球蟲（圖1）、腸艾美耳球蟲（圖2）、黃艾美耳球蟲（圖3）及中型艾美耳球蟲（圖4）的純種。

圖2 腸艾美耳球蟲Fig.2 E.intestinalis

圖4 中型艾美耳球蟲Fig.4 E.media

2.2 繁殖力及日排卵量

4種艾美耳球蟲的繁殖力及每天的排卵量見表1。腸艾美耳球蟲排卵量為365.76×106個(gè)，中型艾美耳球蟲為317.26×106個(gè)、黃艾美耳球蟲為304.36×106個(gè)，大型艾美耳球蟲排卵量為200.12×106個(gè)。

2.3 顯露期及日排卵囊量占總量的百分率

由于每種球蟲的潛在期不同，卵囊排出的時(shí)間也不同，其中大型艾美耳球蟲在感染后第6.5天有卵囊排出，第 10.5 天達(dá) 到高峰 （66.50×106個(gè)／只），占總量的33.23%，第11.5天排卵囊量顯著減少，并延續(xù)至第16.5天；腸艾美耳球蟲在感染后第9天有卵囊排出，第13天達(dá)到高峰（138.40×106個(gè)／只），占總量的37.83%，第14天排卵囊量顯著減少，并延續(xù)至第20天；黃艾美耳球蟲在感染后第9天有卵囊排出，第11天達(dá)到高峰（102.80×106個(gè)／只），占總量的33.78%，第13天排卵囊量顯著減少，并延續(xù)至第20天；中型艾美耳球蟲在感染后第4.5天有卵囊排出，第6.5天達(dá)到高峰（167.8×106個(gè)／只），占總量的52.89%，第8.5天排卵囊量顯著減少，并延續(xù)至第12.5天。各蟲株的顯露期及每天排卵囊量占總量的百分率詳見圖5～圖6。

表1 4種艾美耳球蟲感染后每只兔日排卵囊量Table 1Dairy Oocyst Production every rabbit of the four species of Eimeria ×106個(gè)

圖5 大型艾美耳球蟲與中型艾美耳球蟲的繁殖力及日排卵囊量占總量的百分率Fig.5Multiplication rate and the percentage of oocyst production daily for E.magnaand E.media

圖6 腸艾美耳球蟲與黃艾美耳球蟲的繁殖力及日排卵囊量占總量的百分率Fig.6Multiplication rate and the percentage of oocyst production daily for E.intestinalis and E.flavescens

3 討論

繁殖潛力是以每個(gè)卵囊接種到每只兔子的產(chǎn)量為特征的，而繁殖潛力依賴于個(gè)體種特殊的生活史，生活史是以無性生殖的代數(shù)和以每一代B型裂殖體產(chǎn)生的裂殖子數(shù)目為特征的［3］。黃艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲無性生殖代數(shù)分別為5代、4代、4代、3代，且腸艾美耳球蟲配子生殖定位在空腸和回腸后部的隱窩和絨毛內(nèi)［3］，所以產(chǎn)卵量比其他3個(gè)種多。

本試驗(yàn)表明，兔艾美耳球蟲繁殖力在不同種間有差異，以1×104個(gè)孢子化卵囊／只，感染45日無球蟲兔，腸艾美耳球蟲排卵量最多3.66×108個(gè)／只，與Eckert J等［4］報(bào)道的腸艾美耳球蟲最大卵囊產(chǎn)量為30×108個(gè)／只～50×108個(gè)／只結(jié)果相差很大，也與Licois D等［5］報(bào)道的3×109個(gè)／只～7×109個(gè)／只有差別，這可能與接種的劑量與兔的個(gè)體有關(guān)。其次為中型艾美耳球蟲3.17×108個(gè)／只，與Licois D等［6］報(bào)道的中型艾美耳球蟲最大卵囊產(chǎn)量為2×108個(gè)／只～4×108個(gè)／只結(jié)果相符。黃艾美耳球蟲3.04×108個(gè)／只與Eckert J等報(bào)道的黃艾美耳球蟲最大卵囊產(chǎn)量為25×108個(gè)／只～5×108個(gè)／只結(jié)果相符，張龍現(xiàn)等［7］用感染量1 000個(gè)卵囊／只，感染后第9天，均排出卵囊，收集10d～14d排出的所有糞便，共收集到2.26×109個(gè)卵囊，分析差別與接種的劑量有關(guān)。大型艾美耳球蟲排卵量最少（2.00×108個(gè)／只）與Eckert J等報(bào)道的大型艾美耳球蟲最大卵囊產(chǎn)量為1.5×108個(gè)／只～3×108個(gè)／只結(jié)果相符，與Licois D等［8］報(bào)道的大型艾美耳球蟲原始株最大排卵量為1.7×108個(gè)／只相符。不同種繁殖力不同，顯露期也不相同，可能與不同的地理株有關(guān)。大型艾美耳球蟲在感染后第6.5天有卵囊排出，這比蔣金書［9］報(bào)道的潛在期為7～8天早半天，排卵持續(xù)到第16.5天與蔣金書報(bào)道的明顯期持續(xù)15d～19d相一致；腸艾美耳球蟲在感染后第9天有卵囊排出，這比蔣金書報(bào)道的潛在期為10d早1d，排卵持續(xù)到第20天與蔣金書報(bào)道的明顯期不超過10天相一致，與殷佩云等［10］報(bào)道的排卵持續(xù)到第19～20天一致；黃艾美耳球蟲在感染后第9天有卵囊排出與蔣金書報(bào)道的潛在期為8d～11d相一致，排卵持續(xù)到第20天；中型艾美耳球蟲在感染后第4.5天有卵囊排出，比蔣金書報(bào)道的潛在期為6d～7d早1.5d，排卵持續(xù)到第12.5天，與蔣金書報(bào)道的明顯期持續(xù)6d～8d相一致。

就不同種艾美耳球蟲每日排卵囊量占總量百分率而言，大型艾美耳球蟲在感染后第10.5天排卵量達(dá) 到 高 峰 （66.50×106個(gè)／只），占 總 量 的33.23%，腸艾美耳球蟲在感染后第13天達(dá)到高峰（138.40×106個(gè)／只），占總量的37.83%，黃艾美耳球蟲在感染后第11天達(dá)到高峰（102.80×106個(gè)／只），占總量的33.78%，中型艾美耳球蟲在感染后第6.5天達(dá)到高峰（167.8×106個(gè)／只），占總量的52.89%。對比4個(gè)兔球蟲種排卵曲線，黃艾美耳球蟲從排卵開始，排卵量就很大，這與黃艾美耳球蟲的寄生在盲腸和結(jié)腸有很大關(guān)系，只要從寄生部位上皮細(xì)胞落入腸腔，很快從肛門排出。其他3個(gè)種都在空腸和回腸寄生，不會(huì)出現(xiàn)這種情況。因此，在蟲種傳代或疫苗生產(chǎn)時(shí)，可在感染后排卵量達(dá)到高峰的時(shí)間收集卵囊。

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