魯文賡，劉慶，徐鄭美，原冬偉，李維龍，毛瑩瑩，馮琳，杜珍珍，曹立明，司琳清，金吉東，劉麗麗,付世新，韓英浩*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；3.科菲特飼料(長春)有限公司，吉林 長春 130012；4.四川省水產(chǎn)學(xué)校，四川 成都 401520)

近幾年，我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)生了翻天覆地的變化，資本的融入推動(dòng)規(guī)?；⒓s化、現(xiàn)代化養(yǎng)殖在奶牛養(yǎng)殖模式中所占比重的迅速提升，使奶業(yè)的發(fā)展進(jìn)入了一個(gè)全新的時(shí)期。在短時(shí)間內(nèi)大幅提升規(guī)模化、集約化、現(xiàn)代化養(yǎng)殖水平雖卓有成效，但一些棘手的疾病依舊限制著我國奶業(yè)的振興和奶業(yè)的健康快速發(fā)展。奶牛的肢蹄病是奶牛生產(chǎn)中的常見病、多發(fā)病，其與乳腺疾病、繁殖障礙性疾病、前胃疾病并稱為危害奶牛養(yǎng)殖的四大疾病[1]。蹄葉炎(laminitis)是在奶牛肢蹄病中所占比例最高的疾病，可達(dá)41%，同時(shí)72%的奶牛至少有一個(gè)蹄曾發(fā)生過蹄葉炎[2]。蹄葉炎的高發(fā)病率給牧場的治療與經(jīng)營費(fèi)用上造成了高額經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。據(jù)報(bào)道，在美國因蹄葉炎給牧場所造成的直接和間接的經(jīng)濟(jì)損失為平均每年每頭牛177.62美元[4]。而我國每年因肢蹄病被迫過早淘汰的奶牛占總淘汰數(shù)的15%～30%，給奶牛業(yè)造成了巨大數(shù)額的經(jīng)濟(jì)損失[5]。而現(xiàn)如今尚未有一種能夠有效防治奶牛蹄葉炎，避免或減少牧場經(jīng)濟(jì)損失的方法，因而成為奶牛養(yǎng)殖場最為棘手的疾病之一。鑒于此，對(duì)奶牛蹄葉炎的防治研究已成為一個(gè)亟待解決的問題，尤其是將基礎(chǔ)理論研究成果轉(zhuǎn)化成臨床治療應(yīng)用上。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)具有來源廣泛、采集方便、體外易于擴(kuò)增、低免疫原性等特性，是目前再生醫(yī)學(xué)、組織工程、基因治療等方面比較理想的種子細(xì)胞[6-7]。AD-MSCs在特定的環(huán)境中可以定向分化，從而達(dá)到修復(fù)細(xì)胞和組織損傷的作用[8-9]。有研究表明，除了干細(xì)胞本身的分化作用外，其旁分泌所產(chǎn)生的細(xì)胞因子和外泌體在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)與組織修復(fù)過程中發(fā)揮了更大的作用[10-12]。目前干細(xì)胞療法在人類與犬貓疾病的治療方面達(dá)到了超乎預(yù)期的效果[13]。而在大動(dòng)物中，尤其是奶牛方面鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)探討了牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(bovine adipose-derived mesenchymal stem cells，bAD-MSCs)制劑對(duì)奶牛蹄葉炎的臨床療效，為探索新的、有效的、綠色的治療奶牛蹄葉炎方法提供了新思路和臨床應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小鼠，雄性36只，體重30～40 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，合格證號(hào)為SCXK(遼)2015-0001。新西蘭白兔雄性3只體重2.1～2.5 kg，由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)為SCXK(吉)2013-0002。荷斯坦奶牛雌性12頭，由黑龍江省北安市某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場提供。

1.2 細(xì)胞和主要試劑

原代bAD-MSCs由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM(Gibco公司，美國)，F(xiàn)BS(四季青公司，中國)，胰蛋白酶(Solarbio公司，中國)，蘇木精(上海蘭秀貿(mào)易有限公司，中國)，伊紅(天津大茂化學(xué)公司)。

1.3 bAD-MSCs制劑制備

將原代bAD-MSCs進(jìn)行復(fù)蘇，用10 cm培養(yǎng)皿進(jìn)行傳代，1個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中細(xì)胞計(jì)數(shù)為3.3×106個(gè)細(xì)胞，收集4個(gè)培養(yǎng)皿上的細(xì)胞，溶于30 mL滅菌生理鹽水中進(jìn)行超聲破碎，隨后離心取上清用濾膜過濾，測量其蛋白質(zhì)濃度，記為A液。收集4個(gè)培養(yǎng)皿中的上清液，透析除鹽，濾膜過濾后進(jìn)行凍干，凍干粉溶于8 mL滅菌生理鹽水中，記為B液。將A液與B液按照3∶1的比例進(jìn)行混合，制備成200 μg/mL的bAD-MSCs制劑。按照上述方法改變A液滅菌生理鹽水濃度，制備成不同濃度(400 μg/mL，800 μg/mL)的制劑。

1.4 小鼠毒性試驗(yàn)

小鼠分為4組，分別為對(duì)照組(0.9% NaCl溶液)、低劑量組(200 μg/mL bAD-MSCs制劑)、中劑量組(400 μg/mL bAD-MSCs制劑)、高劑量組(800 μg/mL bAD-MSCs制劑)，每組各9只，分別于腹腔注射0.1 mL，注射劑量為臨床試驗(yàn)的100倍以上。注射制劑后每日早晚兩次觀察各組小鼠的食欲，排糞，精神狀態(tài)等臨床癥狀。在其第0、1、3、7及14天，進(jìn)行稱重，記錄體重變化，評(píng)價(jià)bAD-MSCs制劑對(duì)小鼠正常飼喂的影響。小鼠注射制劑后14 d時(shí)將各組小鼠進(jìn)行最后1次稱重。隨后經(jīng)頸椎脫臼致死，剖開腹腔與胸腔取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進(jìn)行稱重。臟器系數(shù)按下列公式計(jì)算。臟器系數(shù)(%)=(臟器重量/體重)×100%。臟器稱重后用10%福爾馬林溶液固定，制作石蠟組織切片，經(jīng)HE染色。最后在顯微鏡下觀察其病理狀態(tài)。

1.5 熱原檢查方法

按照《中國藥典》三部(2015版)中的“熱原檢查法”進(jìn)行判定。當(dāng)日使用的家兔，正常體溫在38.0 ℃～39.6 ℃的范圍內(nèi)，且各兔間正常體溫之差不超過1.0 ℃。測定其正常體溫后15 min內(nèi)，對(duì)3只家兔，采取緣靜脈注射2 mL bAD-MSCs(400 μg/mL)制劑，注射劑量為臨床試驗(yàn)的100倍以上。然后每隔30 min按前法測量其體溫1次，共測6次，以6次中最高的1次溫度減去正常體溫，即為該兔體溫的升高溫度(℃)。

1.6 奶牛臨床試驗(yàn)方法

根據(jù)宋寶強(qiáng)的奶牛蹄葉炎診治方法，經(jīng)牧場獸醫(yī)在擠奶大廳對(duì)奶牛進(jìn)行臨床檢查，將蹄部腫大潮紅、患病蹄變形、站立時(shí)表現(xiàn)拱背、抵抗抬蹄檢查、蹄底與白線界限明顯、蹄底真皮層充血等癥狀的奶牛耳標(biāo)號(hào)記錄[14]。當(dāng)奶牛回到牛舍后按照之前記錄的耳標(biāo)號(hào)，先遠(yuǎn)觀其站立狀態(tài)，一般為前肢發(fā)病，后肢伸于腹下；后肢發(fā)病，前肢伸于腹下。后對(duì)其進(jìn)行驅(qū)趕，其行走步態(tài)跛行嚴(yán)重，不愿走動(dòng)喜臥。據(jù)此可確診奶?；加刑闳~炎。選取胎次平均為3次、其體況評(píng)分平均為2.5的泌乳中期蹄葉炎奶牛進(jìn)行分組。分為對(duì)照組6頭(未治療)和治療組6頭。治療組經(jīng)蹄間叉上緣注射5 mL 400 μg/mL bAD-MSCs制劑。各組奶牛分別于即將注射之前(0 h)及注射制劑后第6、24、48 h，5、7、14天測量其體溫呼吸數(shù)，并由牧場同一獸醫(yī)對(duì)各組奶牛進(jìn)行跛行評(píng)分等級(jí)盲評(píng)。跛行評(píng)分是評(píng)定奶牛正常行走能力的定性指數(shù)。評(píng)分值為1～5分，其中1分為正常；2分為輕度跛行；3分為中度跛行；4分為重度跛行；5分為嚴(yán)重跛行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠毒性試驗(yàn)

以3組不同劑量的bAD-MSCs制劑對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠精神狀態(tài)良好，食欲飲欲正常，試驗(yàn)期間未見死亡。試驗(yàn)組與對(duì)照組隨著時(shí)間變化的小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。試驗(yàn)組組間比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠體重變化

臟器系數(shù)是反映動(dòng)物器官健康的重要指標(biāo)。研究結(jié)果顯示，低、中、制劑處理組與對(duì)照組的小鼠所有臟器系數(shù)相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，均無明顯差異(P>0.05)；試驗(yàn)組組間相比所有臟器系數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無明顯差異(P>0.05)，見表1。解剖觀察各組小鼠均未發(fā)現(xiàn)明顯臟器病變，經(jīng)HE染色的病理組織切片顯示，各組小鼠所有臟器無明顯病理學(xué)改變。

表1 bAD-MSCs制劑對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

2.2 熱原檢查判定

經(jīng)家兔耳緣靜脈注射bAD-MSCs制劑進(jìn)行熱原試驗(yàn)。在受試的3只家兔中，體溫升高均低于0.6 ℃，且3只家兔體溫升高總和低于1.3 ℃。

2.3 患病奶牛臨床治療效果

利用bAD-MSCs制劑對(duì)患病奶牛進(jìn)行治療。如表2所示，本研究所用奶牛的胎次與體況評(píng)分無顯著差異；試驗(yàn)前與試驗(yàn)后呼吸數(shù)和體溫變化也無顯著差異(P>0.05)。對(duì)同一患蹄葉炎的奶牛進(jìn)行驅(qū)趕，治療前的狀態(tài)為行走時(shí)右后腿拖拽行走，蹄部只可輕微著地，不能完全受力，患病蹄腫大潮紅；治療后7 d時(shí)的治療效果為行走時(shí)步態(tài)正常，四肢受力均勻、步履矯健、更可起跳騰空(蹄部為受力點(diǎn))，患病蹄可見其腫大面積減小和潮紅消退。試驗(yàn)期間對(duì)照組奶牛跛行程度未見改善，且隨著時(shí)間的延長，跛行程度可見更加的嚴(yán)重。而在治療組在給藥6 h后其跛行程度開始逐漸變輕。在注射后48 h奶牛的跛行評(píng)分在治療組和對(duì)照組分別是3.25 ±0.25和4.5±0.29，治療效果明顯(P<0.05)；在注射后120 h奶牛的跛行評(píng)分在治療組和對(duì)照組分別是2.75±0.25和4.5±0.29 (P<0.01)，在注射后168 h兩組的跛行評(píng)分分別是 2.5±0.29和4.5±0.29(P<0.01)，其治療效果表現(xiàn)出顯著性差異；而在注射后336 h 奶牛的跛行評(píng)分在治療組和對(duì)照組分別是1.75±0.25和4.75±0.25，其治療效果表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.001)(圖2)。

表2 奶?；拘畔⒈?/p>

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖2 牛跛行評(píng)分變化

3 討論

奶牛蹄葉炎是一種無菌性炎癥，可誘發(fā)蹄白線病、蹄底潰瘍、蹄部變形等疾病，是引起奶牛跛行的主要原因[15]。關(guān)于蹄葉炎的誘發(fā)原因，學(xué)者們眾說紛紜，尚未有一定論。目前認(rèn)為蹄葉炎的誘發(fā)原因主要包括亞急性瘤胃酸中毒、脂質(zhì)代謝紊亂、牧場環(huán)境、年修蹄次數(shù)等[16-17]。但大家一致認(rèn)可的是，蹄葉炎的發(fā)病原理為蹄部的炎癥反應(yīng)、蹄真皮的血管破損、表皮細(xì)胞的異常分化[18]。針對(duì)其發(fā)病原理，牧場對(duì)蹄葉炎通常的治療方法可以簡單概括為：封閉療法、抗生素療法與保守療法。而這三種方法都存在著弊端，如封閉療法治標(biāo)不治本，容易復(fù)發(fā)；抗生素療法存在抗生素濫用現(xiàn)象，影響動(dòng)物食品安全；而保守療法見效慢，影響奶牛生產(chǎn)性能。因此，研發(fā)治療蹄葉炎的新方法，對(duì)我國奶業(yè)的振興和奶業(yè)的健康綠色發(fā)展具有重要意義。

在干細(xì)胞治療領(lǐng)域中，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells MSCs)應(yīng)用于臨床的可能性已經(jīng)得到了證實(shí)。僅在2006—2012 年基于MSCs產(chǎn)品向美國食品和藥物管理局(FDA)提交的研究性新藥申請數(shù)量較之前增加了大約3倍[19]。干細(xì)胞療法不僅應(yīng)用于人醫(yī)領(lǐng)域，在獸醫(yī)小動(dòng)物方面也有大量的研究[20]，但尚未見到與奶牛相關(guān)的報(bào)道。因而本試驗(yàn)將bAD-MSCs通過提純濃縮步驟，制作成不同蛋白濃度的制劑，首先進(jìn)行了小鼠毒性與家兔熱原試驗(yàn)。結(jié)果表明，bAD-MSCs制劑對(duì)小鼠的體重、主要臟器系數(shù)、臟器組織病理學(xué)均無影響，符合毒理學(xué)無毒性判定標(biāo)準(zhǔn)[21]。家兔熱原試驗(yàn)的家兔體溫變化結(jié)果也與《中國藥典》三部(2015版)中“熱原檢查法”規(guī)定的無熱原性判定標(biāo)準(zhǔn)相一致[22]。研究表明bAD-MSCs制劑是無毒性、無熱原性和無刺激性的制劑。

在奶牛臨床治療試驗(yàn)中，可以清晰地看出bAD-MSCs制劑有效地緩解奶牛病蹄的腫脹程度，顯著降低了患病牛跛行評(píng)分等級(jí)。利用人源AD-MSCs中純化的外泌體進(jìn)行miRNA模擬試驗(yàn)證明了miR-423-5p是外泌體中促血管生成的關(guān)鍵活性分子[23]。Vasilev等[24]在人源AD-MSCs對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療效果研究中闡明了AD-MSCs產(chǎn)生的分泌因子具有免疫調(diào)節(jié)作用。而Mitchel等[6]通過人源AD-MSCs的細(xì)胞外囊泡對(duì)光損傷的人真皮成纖維細(xì)胞的影響研究，闡明了AD-MSCs細(xì)胞外囊泡分泌的可溶性分子可以促進(jìn)肌肉生成的機(jī)理。據(jù)此可以推論出本試驗(yàn)所利用的bAD-MSCs制劑在治療奶牛蹄葉炎上所發(fā)揮出的較好療效，可能是bAD-MSCs中的分泌因子與外泌體修復(fù)了患病蹄內(nèi)部破損血管并抑制了蹄部炎癥反應(yīng)，從而減輕了臨床跛行的癥狀。

綜上所述，本試驗(yàn)證實(shí)了bAD-MSCs制劑對(duì)奶牛蹄葉炎具有較好的療效，為探索治療奶牛蹄葉炎方法提供了新思路。至于bAD-MSCs制劑對(duì)于蹄葉炎治療的具體分子機(jī)制，尚需進(jìn)一步深入探究。