李增強(qiáng)

（甘肅省蘭州市西固區(qū)元峁山林場，甘肅蘭州730060）

化學(xué)農(nóng)藥的使用為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了有力的支持，但是化學(xué)農(nóng)藥的大量不合理使用帶來的農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題，直接危害到人畜健康，影響到農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，且耗費(fèi)巨大的人力、物力。因此，高效、環(huán)保、無害的生物農(nóng)藥研發(fā)越來越顯示其重要的社會意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，已經(jīng)成為現(xiàn)代農(nóng)藥研發(fā)的發(fā)展方向。目前，生物農(nóng)藥，尤其是植物源農(nóng)藥的研究和開發(fā)逐步成為熱點(diǎn)。

狼毒素由甘肅國力生物科技開發(fā)有限公司從瑞香狼毒根中提取而來，是一種新型的植物源農(nóng)藥。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，瑞香狼毒提取物具有殺菌、殺線蟲活性[1-4]。黃瓜枯萎病菌（FusariumOxysporium）、馬鈴薯絲核病菌(Rhizoctonia solani)、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、番茄早疫病病菌（Alternaria solani）、茄子菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麥長蠕孢菌(Helminthosporiumsativum)、棉花炭疽病菌(Gromerella gossypii)、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、大麥赤霉菌(Fusarium graminearum)、西瓜蔓枯病菌(Didymella bryoniae)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、枸杞炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）是我國蔬菜和糧食作物上常見的植物病原菌，一直以來影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，其危害程度不容小覷，但是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治植物病原菌仍主要依賴于化學(xué)殺菌劑[5-7]?，F(xiàn)以上述幾種植物病原菌為供試生物材料，評價(jià)甘肅國力生物科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)的狼毒素原液和制劑對常見植物病原真菌的活性，明確其抑菌活性和制劑化對其活性的影響，為該產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種 黃瓜枯萎病菌、馬鈴薯絲核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、茄子菌核病菌、小麥長蠕孢菌、棉花炭疽病菌、油菜菌核病菌、大麥赤霉菌、西瓜蔓枯病菌、棉花枯萎病菌、枸杞炭疽病菌。

1.1.2 供試藥劑 1.6%狼毒素水乳劑、9.8%狼毒素原藥，均由甘肅國力生物科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 SPX智能生化培養(yǎng)箱、KQ2200E型超聲波清洗機(jī)、移液槍、培養(yǎng)皿、打孔器、超凈工作臺、三角瓶、燒杯、玻璃棒等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基的制備 在無菌條件下，將狼毒素與滅菌的PDA培養(yǎng)基混合，每種藥劑均配成1 mg/ml的濃度，最終濃度狼毒素水乳劑為160ug/ml、80 ug/ml、40 ug/ml、20 ug/ml、10 ug/ml，狼毒素原藥為980ug/ml、490ug/ml、245ug/ml、122.5ug/ml、61.25ug/ml，并作空白對照，每個處理重復(fù)3次。

1.2.2 培養(yǎng)及接種方法 待菌培養(yǎng)好后在無菌條件下，用直徑為5mm的滅菌打孔器打取菌餅，將打好的菌餅用無菌接菌針挑起迅速接入含毒PDA平板的中央，蓋上培養(yǎng)皿蓋，放置24～26℃下培養(yǎng)，各濃度條件下抑菌活性成分對菌落生長的抑制作用是用生長速率法進(jìn)行測定，并用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.3 生物測定方法 參考生長速率法[3，4]，在常溫、無菌條件下，取1 ml提取液至25 ml刻度試管，對照組加入等量對應(yīng)溶解溶劑，再倒入融化的PDA培養(yǎng)基至10 ml，充分混勻后在50～55℃時，倒入90 mm培養(yǎng)皿中制成平板，平板凝固后接入生長一致的菌餅(Φ=0.5 cm)。每皿接1個菌餅，每處理重復(fù)3次，25～27℃培養(yǎng)并觀察結(jié)果。用十字交叉法測量供試真菌菌落生長直徑，用下述公式計(jì)算抑制率：

菌落直徑（mm）=測量菌落直徑平均值Q 5

2 結(jié)果與分析

2.1 2種藥劑的抑菌效果

從表1可以看出，狼毒素水乳劑除對枸杞炭疽病和小麥長蠕孢的抑菌率較低外，對其他10種植物病原菌均有較好的抑制作用。在濃度為160 ug/ml時，對番茄早疫、馬鈴薯絲核、茄子菌核、棉花炭疽、大麥赤霉、西瓜蔓枯、油菜菌核的抑菌率較大，均在55%以上；在濃度為80 ug/ml時，對番茄早疫、馬鈴薯絲核、棉花炭疽、大麥赤霉、西瓜蔓枯、油菜菌核亦有較大的抑制作用，抑菌率均在50%左右；當(dāng)狼毒素水乳劑濃度低于40 ug/ml時，除了對大麥赤霉、西瓜蔓枯、棉花炭疽、番茄灰霉有較大的抑菌率外（抑菌率15%～50%），對其他植物病原菌的抑制作用相對較差（抑菌率低于15%）。

表1 狼毒素水乳劑對12種病原真菌的抑菌率（5 d）

從表2可以看出，狼毒素原藥除對小麥長蠕孢的抑制作用不明顯，對其他11種植物病原菌均有良好的抑制效果。在濃度為980 ug/ml時，對12種植物病原菌的抑制作用最顯著，特別是對馬鈴薯絲核、西瓜蔓枯、枸杞炭疽、油菜菌核的抑制作用最明顯，抑菌率均在70%以上；濃度為490 ug/ml時，抑菌率明顯下降，只有對西瓜蔓枯和油菜菌核的抑菌率在65%以上；當(dāng)濃度低于245 ug/ml時，狼毒素原藥對番茄早疫、馬鈴薯絲核、棉花炭疽、大麥赤霉、西瓜蔓枯、油菜菌核表現(xiàn)出明顯的抑制作用，抑菌率45%～50%，而對其他植物病原菌的抑制作用不明顯，抑菌率1%～44%。

2.2 2種藥劑的顯著性差異分析

從表1和表2可以看出，狼毒素水乳劑在160 ug/ml濃度下，番茄早疫、馬鈴薯絲核、茄子菌核、大麥赤霉、西瓜蔓枯、油菜菌核最為敏感；在80 ug/ml濃度下，馬鈴薯絲核、西瓜蔓枯、油菜菌核最為敏感；在40 ug/ml濃度下，對番茄灰霉、馬鈴薯絲核、棉花炭疽、大麥赤霉、西瓜蔓枯、油菜菌核作用最為明顯；在20 ug/ml和10 ug/ml濃度下，均對西瓜蔓枯作用最為顯著。

狼毒素原藥在980 ug/ml和490 ug/ml濃度下，均對西瓜蔓枯和油菜菌核的抑菌作用最顯著；在245 ug/ml濃度下，對番茄早疫、馬鈴薯絲核、棉花炭疽、大麥赤霉、西瓜蔓枯、油菜菌核抑菌作用最為顯著；在122.5 ug/ml濃度下，對番茄早疫、棉花炭疽、大麥赤霉、油菜菌核的抑制作用最為顯著；在61.25 ug/ml濃度下，番茄早疫和油菜菌核表現(xiàn)最敏感。油菜菌核在各個濃度下均表現(xiàn)出對狼毒素原藥的敏感性。

表2 狼毒素原藥對12種病原真菌的抑菌率（5 d）

表3 狼毒素水乳劑對12種病原真菌的毒力測定結(jié)果（5 d）

表4 狼毒素原藥對12種病原真菌的毒力測定結(jié)果（5 d）

2.3 2種藥劑對12種植物病原菌的毒力測定

從表3可以看出，狼毒素水乳劑對12種植物病原菌的EC50由小到大的順序?yàn)槲鞴下?8.4252ug/ml、油菜菌核72.001 4 ug/ml、大麥赤霉77.982 4 ug/ml、馬鈴薯絲核81.462 6 ug/ml、棉花炭疽95.357 ug/ml、番茄早疫 98.0565ug/ml、茄子菌核99.3082ug/ml、番茄灰霉 182.7267ug/ml、棉花枯萎 237.1037ug/ml、黃瓜枯萎239.788 6 ug/ml、小麥長蠕孢635.509 1 ug/ml、枸杞炭疽1 413.07 ug/ml。狼毒素水乳劑抑制一半的西瓜蔓枯、油菜菌核、大麥赤霉、馬鈴薯絲核、棉花炭疽、番茄早疫和茄子菌核等菌絲生長所需濃度最低，EC50均在100 ug/ml以下，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。

從表4可以看出，狼毒素原藥對12種植物病原菌的EC50由小到大的順序?yàn)橛筒司?44.4695ug/ml、西瓜蔓枯278.7175ug/ml、大麥赤霉279.6489ug/ml、番茄早疫291.1714ug/ml、馬鈴薯絲核311.0716ug/ml、棉花炭疽352.1423ug/ml、棉花枯萎460.5456 ug/ml、枸杞炭疽461.9345ug/ml、茄子菌核491.2509ug/ml、番茄灰霉526.5388ug/ml、黃瓜枯萎588.0612ug/ml、小麥長蠕孢1 505.391 ug/ml。狼毒素原藥抑制一半的油菜菌核、西瓜蔓枯、大麥赤霉、番茄早疫、馬鈴薯絲核、棉花炭疽、棉花枯萎、枸杞炭疽和茄子菌核的菌絲生長的濃度最低，均在500 ug/ml以下，對這9種植物病原菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺菌活性。

從總體上看，狼毒素原藥對病原菌的EC50要比狼毒素水乳劑的高，其中只有狼毒素原藥對枸杞炭疽的EC50比狼毒素水乳劑的低；狼毒素水乳劑的抑菌效果比狼毒素原藥好。2種藥劑均對西瓜蔓枯、油菜菌核、大麥赤霉、馬鈴薯絲核、棉花炭疽、番茄早疫和茄子菌核等7種病原菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，而對其他病菌的抑菌活性較弱。

3 小結(jié)與討論

除了狼毒素原藥對小麥長蠕孢抑菌作用不明顯，狼毒素水乳劑對枸杞炭疽病和小麥長蠕孢抑菌效果不佳外，狼毒素原藥和水乳劑對上述10種植物病原菌均有良好的抑制效果，其中狼毒素原藥的抑菌率整體上大于狼毒素水乳劑，但EC50原藥大于水乳劑，因此狼毒素水乳劑對12種供試菌種的抑菌效果比狼毒素原藥好。可以看出，未來狼毒素具有廣闊的應(yīng)用前景，只是狼毒素原藥溶解性方面有待改進(jìn)，狼毒素水乳劑有較好的抑菌效果，狼毒素水乳劑只在室內(nèi)進(jìn)行了毒力測定，要讓狼毒素真正投入農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中還需進(jìn)行進(jìn)一步的田間試驗(yàn)。