王增妹 ， 王金晶 ， 李 磊 ， 鄭飛云 ， 李 崎 *

（1. 江南大學 生物工程學院， 江蘇 無錫 214122； 2. 江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室， 江蘇 無錫214122）

啤酒酵母是啤酒釀造的靈魂。 啤酒酵母的生理狀態(tài)通常通過活力和活性兩個方面來評價。 細胞活性表示一個細胞群體中活細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例。 而細胞活力表示細胞的生理能力， 包括胞內(nèi)ATP 含量、線粒體膜電位、酶活性等[1]。 在啤酒釀造過程中，啤酒酵母活力及活性的變化影響著諸多代謝物質(zhì)的產(chǎn)生，如有機酸、高級醇、高級酯、醛類化合物等，進而影響啤酒的風味與成品質(zhì)量[2]。 啤酒發(fā)酵結(jié)束后，企業(yè)通常將酵母泥回收，置于酵母儲罐中。 在回收時，因罐內(nèi)酵母泥稠密，難以實現(xiàn)良好散熱，通常向酵母儲罐中加入無菌水來降低酵母泥溫度。 此后，酵母將被儲存一段時間，直至下一輪發(fā)酵使用。 在這種營養(yǎng)匱乏的條件下，儲存時間的延長與溫度的升高會導致酵母在隨后的發(fā)酵過程中發(fā)酵能力下降[3]。 同時，隨著精釀啤酒的推廣，市場上出現(xiàn)了越來越多的現(xiàn)釀啤酒吧。 在現(xiàn)釀啤酒生產(chǎn)過程中，同樣存在著運輸及儲存酵母的需求。 在啤酒產(chǎn)量劇增的夏季，高溫增加了酵母的運輸和儲存成本。 因此，無論對于大規(guī)模的啤酒工廠還是小規(guī)模的現(xiàn)釀啤酒吧來說，研究酵母對熱脅迫的響應并提高酵母的耐熱性都是十分重要的。

海藻糖是一種由兩個葡萄糖通過α-1，1-糖苷鍵鏈接起來的非還原性二糖。 隨著對海藻糖功能研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)海藻糖對生物體的作用遠不止于扮演碳源的角色[4]。 在某些生物體中，海藻糖可以作為信號分子，指導和控制代謝途徑，或通過保護細胞膜和蛋白質(zhì)實現(xiàn)在各類脅迫條件下對生物體的保護作用[5-8]。 海藻糖本身十分穩(wěn)定，被視為抵抗各種脅迫環(huán)境的保護劑[9-10]。這種保護作用使海藻糖具有廣泛的生物學功能，可用于對食物、酶制劑、疫苗、細胞等的保護上。 熱脅迫是影響酵母發(fā)酵目標產(chǎn)物產(chǎn)量的重要影響因素之一，海藻糖對酵母耐熱性的影響及其機制已經(jīng)被廣泛討論[11-14]。 有報導指出，增加酵母胞內(nèi)海藻糖含量可以使酵母耐熱性增強，而這種作用與糖轉(zhuǎn)運基因的上調(diào)有關(guān)[14]。也有研究人員認為，提升酵母耐熱性的重要因素不在于海藻糖，而在于海藻糖合成途徑上的Tps1 蛋白[12]。但對于外源海藻糖是否對啤酒酵母的耐熱性起作用，目前尚未有文獻報道。

作者通過向啤酒酵母儲存壞境中添加海藻糖，探究外源海藻糖對啤酒酵母在熱脅迫下的保護作用。

1 材料與方法

1.1 菌種

啤酒酵母 G-03（S. pastorianus）：工業(yè)菌株，由作者所在實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母提取物10 g/L，加蒸餾水溶解，于115 ℃高溫滅菌15 min。

0.5 mol/L 三氯乙酸溶液（TCA）：稱取 8.17 g 三氯乙酸用蒸餾水溶解，定容至100 mL。

80%濃硫酸： 將81.6 mL 98%的濃硫酸緩緩注入20 mL 蒸餾水中，防止飛濺。

蒽酮溶液： 稱取0.2 g 蒽酮溶解至80%的硫酸中，定容至100 mL，蒽酮溶液需要新鮮配制。

亞甲基紫染液：參照文獻[15]配制。

1 mg/mL 標準海藻糖溶液： 將海藻糖在105 ℃烘干至恒質(zhì)量，準確稱取10 mg 海藻糖，用蒸餾水定容至100 mL，獲得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的海藻糖溶液。

海藻糖溶液的配制： 稱取 18.92、37.83、75.66 g海藻糖， 分別用蒸餾水溶解并定容到1 000 mL，制成濃度分別為50、100、200 mmol/L 的海藻糖溶液。

亞甲基紫、蒽酮、三氯乙酸：國藥集團化學試劑有限公司；海藻糖：江蘇省奧谷生物科技有限公司；BacTiter-GloTM Microbial Cell Viability Assay ATP檢測試劑盒：Promega 公司；其他試劑：均為分析純，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 儀器與設備

SWCJ-1Cu 雙人無菌操作臺： 蘇州凈化有限公司；AL104 電子天平：梅特勃-托利多儀器（上海）有限公司；SPX-250 生化培養(yǎng)箱：上海躍進有限公司；HPX-180BS-II 恒溫恒濕培養(yǎng)箱： 上海新苗有限公司；Tecan Infinite?200 多功能酶標儀： 瑞士 Tecan公司；CX21 顯微鏡：日本OLYMPUS 公司；細胞振蕩破碎儀及配套使用的破壁管和0.5 mm 玻璃珠：美國Biospec 公司；HVE-50 全自動高壓蒸汽滅菌鍋：日本HIRAYAMA 株式會社；TGL-16G 臺式離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.4 培養(yǎng)方法與脅迫條件

取一環(huán)斜面保存的G-03 酵母至10 mL YPD培養(yǎng)基，于28 ℃活化12 h，取活化好的酵母以1%的體積分數(shù)接種至400 mL YPD 培養(yǎng)基，28 ℃搖床培養(yǎng) 24 h。 參照王敏等[16]、許維娜等[17]的方法收集酵母泥。 將酵母泥分散到為 0、50、100、200 mmol/L 的海藻糖溶液中，控制菌濃在107cfu/mL。 于不同的脅迫溫度下靜置儲存樣品，檢測指標前將樣品混勻。

1.5 實驗方法

1.5.1 酵母細胞活性測定方法 酵母細胞活性采用亞甲基紫染色法[15]。定時取樣，將樣品適當稀釋后與亞甲基紫染液等量混勻， 進行染色，15 min 后用血球計數(shù)板鏡檢計數(shù)。 通過顯微鏡觀察細胞，死細胞呈現(xiàn)紫色，活細胞為無色，記錄細胞總數(shù)和活細胞數(shù)。

細胞活性＝活細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%

1.5.2 基于ATP 含量的細胞活力測定方法[18]將收集的樣品菌濃調(diào)整至106cfu/mL， 將樣品用預冷無菌水洗滌3 次，5 000 r/min 離心3 min，去除上清液收集菌體，用無菌水將菌體重懸至原體積，取1 mL樣品加入至破壁管中里，并加入（750±10） mg 直徑為 0.5 mm 的玻璃珠， 振蕩破碎儀上振蕩1 min，共振蕩5 次， 每次振蕩結(jié)束后將樣品置于冰上30 s。振蕩結(jié)束后8 000 r/min 離心5 min 沉淀細胞碎片，取上清液。 破碎后的樣品保持在冰浴上。

使用BactTiter-GloTM Microbial Cell Vitality Assay 試劑盒檢測上清液中的ATP 含量， 參考試劑盒說明書。 取100 μL 上清液進行檢測，檢測條件為化學發(fā)光-發(fā)光光纖檢測，讀取化學發(fā)光值。 ATP 含量變化用相對含量表示，脅迫初始時的ATP 發(fā)光信號值記作100%。

1.5.3 酵母胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分數(shù)的測定 酵母胞內(nèi)海藻糖用0.5 mol/L TCA 溶液提取，取3 mL 菌懸液于 5 mL 離心管中，12 000 r/min 離心 5 min，移除上清液。 使用預冷蒸餾水將菌體洗滌3 次后，用3 mL預冷的0.5 mol/L TCA 溶液重懸菌液，混勻。 室溫放置 40 min 后 12 000 r/min 離心 5 min， 將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中。 使用2 mL 預冷的0.5 mol/L TCA 溶液重懸菌體沉淀，重復提取一次。 將兩次得到的上清液混合在一起即為海藻糖提取液，將提取液在冰浴上放置10 min。

海藻糖含量的測定采用蒽酮比色法[19]。 取1 mL海藻糖提取液放入25 mL 比色管， 加入4 mL 蒽酮溶液， 混勻。 沸水浴 10 min， 立即冷卻 10 min，在620 nm 檢測紫外吸光值。 空白樣品為1 mL TCA 溶液。

標準曲線的繪制： 吸取不同體積0.1 mg/mL 的海藻糖標準液， 用蒸餾水稀釋至不同質(zhì)量濃度，制成不同質(zhì)量濃度的海藻糖溶液。 用蒽酮比色法測定其吸光值，以吸光值為橫坐標，各標準溶液質(zhì)量濃度為縱坐標繪制標準曲線。 參照標準曲線計算樣品胞內(nèi)的海藻糖質(zhì)量分數(shù)。 樣品胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分數(shù)用mg/g 干質(zhì)量細胞表示。

1.5.4 細胞干質(zhì)量測定方法 細胞干質(zhì)量的測定見國標[20]。

1.5.5 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)通過Origin 9.0 繪制成圖，每個點表示平行樣品的均值及標準偏差。 通過SPSS 軟件進行 ANOVA 分析及 T 檢驗，p＜0.05 時認為差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱脅迫下外源海藻糖對酵母活力的影響

按1.4 所述方法培養(yǎng)啤酒酵母24 h 后收集酵母細胞， 將收集的酵母置于 0、50、100、200 mmol/L的海藻糖溶液中， 在37、40、45 ℃高溫環(huán)境下儲存4 d，酵母基于ATP 相對含量的活力變化見圖1。 由圖1 可知，隨著儲存時間的延長，酵母胞內(nèi)ATP 含量不斷下降。 在37 ℃下，外源海藻糖的添加減緩了酵母胞內(nèi)ATP 含量的下降速度。 37 ℃放置1 d 后，儲存環(huán)境中未添加海藻糖的酵母胞內(nèi)ATP 含量降低至起始時的5.66%， 此時，50 mmol/L 海藻糖溶液儲存的酵母胞內(nèi)ATP 含量降至起始時的36.91%。與未添加海藻糖的細胞相比，50 mmol/L 海藻糖溶液中酵母胞內(nèi)ATP 含量提高6.52 倍， 當海藻糖濃度升高至100 mmol/L 時，與儲存過程中未添加海藻糖的細胞相比， 海藻糖溶液儲存的酵母胞內(nèi)ATP含量提高了13.49 倍。 繼續(xù)增加海藻糖濃度至200 mmol/L 時，與不添加海藻糖的細胞相比，海藻糖溶液儲存的酵母的活力提高了14.93 倍。 在儲存1 d 時， 不同濃度海藻糖對酵母細胞活力的影響有顯著差別（p＜0.05）。在第 2 天以后，200 mmol/L 的海藻糖與100 mmol/L 的海藻糖對胞內(nèi)ATP 相對含量的影響沒有顯著性差別。 當脅迫溫度提高至40 ℃時，與不添加海藻糖相比，添加海藻糖在一段時間內(nèi)減緩胞內(nèi)ATP 含量的下降速度。在40 ℃保存1 d后，酵母胞內(nèi)ATP 含量降低至近乎為0，而50 mmol/L海藻糖溶液中，酵母胞內(nèi)ATP 含量保持在初始值的41.44%。與37 ℃相比，40 ℃時3 種濃度的海藻糖的作用差別變小，50、100、200 mmol/L 的海藻糖溶液對胞內(nèi)ATP 含量的影響相差不大。 在45 ℃熱脅迫下，酵母胞內(nèi)ATP 含量在1 d 之內(nèi)下降至0。而此時外源海藻糖的添加并未使酵母活力提升。 可以看出，添加海藻糖在一定程度上可以減緩酵母細胞活力的下降速度，但隨著熱脅迫程度的增強，不同濃度的海藻糖對酵母活力的作用差別逐漸減小，且添加海藻糖對酵母活力的提升具有一定限度。 ATP 對細胞生命活動的重要作用已經(jīng)被廣泛研究，檢測胞內(nèi)ATP 含量的變化對理解酵母活力變化十分重要[1，18，21]。胞內(nèi) ATP 含量的下降會導致細胞器功能損傷，從而進一步造成ATP 含量的下降，形成惡性循環(huán)，ATP 含量下降是調(diào)控細胞死亡的一個重要原因[22]。 由此推測，添加海藻糖對酵母胞內(nèi)ATP 含量下降速度的緩解將有助于阻止細胞活性快速下降。

2.2 熱脅迫下外源海藻糖對酵母活性的影響

細胞活性變化是酵母耐熱性能變化的直觀體現(xiàn)，熱脅迫下添加海藻糖對酵母細胞活性變化的影響，見圖2。 與細胞活力的變化類似，隨著熱脅迫下儲存時間的延長，酵母細胞活性逐漸下降，而添加海藻糖可以在一定程度上減緩活性下降速度。 如圖2（a）所示，在37 ℃下，不同濃度海藻糖對酵母活性有不同程度提升。儲存1 d 后，未添加海藻糖的酵母細胞活性降至 33%， 而在 50、100、200 mmol/L 的海藻糖溶液中， 酵母活性分別為64.85%、74.65%、86.4%。 與37 ℃相比，在40 ℃下，不同濃度海藻糖對酵母活性的作用差別減小，而當溫度升高至45 ℃時，未添加海藻糖的酵母細胞活性在1 d 內(nèi)即降為0，添加海藻糖后酵母細胞活性不再提升。 綜合以上結(jié)果，添加海藻糖可以提高酵母耐熱性，且在一定時間或溫度范圍內(nèi)對活性和活力的提升程度隨著海藻糖濃度的增高而提升，但外源海藻糖對酵母的保護作用具有一定限度的，超出這一限度后，海藻糖不再起到對酵母耐熱性的提升作用。

圖1 熱脅迫下外源海藻糖對G-03 活力的影響Fig. 1 Effect of exogenous trehalose on the vitality of G-03 under heat stress

2.3 添加海藻糖對酵母胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分數(shù)的影響

37 ℃是酵母耐熱性研究中廣泛使用的溫度[12-13，23]，為加深對熱脅迫下外源海藻糖對啤酒酵母保護作用的理解，以37 ℃為例，探究添加海藻糖對啤酒酵母耐熱性提升的機理。 由圖 2（a）可知，37 ℃脅迫下1 d 后，酵母活性下降至33%，2 d 后活性基本為0。細胞完全喪失活性不利于探究外源海藻糖對酵母的保護作用及機理， 因此選取了處理1 d 的酵母細胞進行研究。 添加海藻糖對酵母胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分數(shù)的影響見圖3。 不添加海藻糖在37 ℃下1 d 時，酵母胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分數(shù)從初始的28.58 mg/g 下降至2.58 mg/g，而此時添加海藻糖的酵母胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分數(shù)為11.89 mg/g。與不添加海藻糖相比，添加海藻糖使酵母胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分數(shù)顯著提升（p＜0.05）。 從中推斷，熱脅迫下外源海藻糖對酵母的保護作用可能是由于增加了胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分數(shù)引起的。

圖2 熱脅迫下外源海藻糖對G-03 活性的影響Fig. 2 Effect of exogenous trehalose on the viability of G-03 under heat stress

圖3 37 ℃下添加海藻糖對酵母胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分數(shù)的影響Fig. 3 Effect of exogenous trehalose on intracellular trehalose contents at 37 ℃

2.4 37 ℃下轉(zhuǎn)錄組差異表達基因分析

為進一步了解外源海藻糖對啤酒酵母耐熱性的提升作用機理， 采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對37 ℃下不添加海藻糖的酵母細胞與添加50 mmol/L 海藻糖的酵母細胞進行比較，探究熱脅迫下酵母細胞轉(zhuǎn)錄水平變化情況，選擇差異倍數(shù)|log2（fold change）|>1和顯著水平q value<0.05 的差異基因進行分析。 與不添加海藻糖的菌株相比，儲存環(huán)境中添加海藻糖的菌株中有3 302 個基因相對穩(wěn)定， 有2 505 個基因的調(diào)控模式發(fā)生變化，占基因總數(shù)的46%。 其中，有1 285 個基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，1 220 個基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。 由此可見，向儲存環(huán)境中添加海藻糖后，啤酒酵母在儲存過程中基因轉(zhuǎn)錄水平的變化規(guī)模較大。

2.5 37 ℃差異表達基因GO 功能分析

將差異基因根據(jù)不同的功能進行GO 功能注釋及分類。 GO 功能分為 3 大類： 細胞組分（cellular component）、生物過程（biological process）及分子功能（molecular function）。 分類及統(tǒng)計結(jié)果見圖 4。 在細胞組分包含的15 個亞分類中， 差異表達基因主要與細胞 （cell）、 細胞成分 （cell part）、 細胞器（organell）、細胞器成分（organelle part）有關(guān)，這 4 類功能占該大類的比例分別為95.67%、91.44%、81.65% 、52.55% 。 其 次 是 大 分 子 復 合 體（macromolecule complex）和膜（membrane），分別占比38.29%和37.52%。 在生物過程上的24 個亞分類中， 以細胞過程 （cellular process） 和代謝過程（metabolic process） 居多， 占該類別的比例分別為90.28%和77.8%， 其次是細胞組分組織和合成（cellular component organization or biogenesis） 及生物調(diào)控（biological regulation），分別占比 44.24%和34.14%。 在分子功能的11 個亞分類中，差異表達基因 主 要 與 結(jié) 合 （binding）、 催 化 活 性 （catalytic activity）有關(guān)，分別占該類別的64.45%和55.97%，其次是與結(jié)構(gòu)分子活性（structural molecule activity）和轉(zhuǎn)運活性（transporter activity），分別占比9.62%和9.45%。 在這些功能分類條目中，差異基因數(shù)目排名前三的功能分別為細胞、細胞成分、細胞過程3 個類別。

對富集結(jié)果進行進一步分類，通過有向無環(huán)圖展示差異基因GO 富集分析結(jié)果。圖中，分支代表包含關(guān)系， 從上至下所定義的功能范圍越來越小，方框代表的是每個分類富集程度排名前5 的GO Term，顏色越深（紅）表示富集程度越高。 在細胞組分的分類中，富集程度排名前5 的條目分別為核糖體 前 體 （preribosome）、 胞 質(zhì) 核 糖 體 （cytosolic ribosome）、 核 仁 （nucleolus）、90S 核 糖 體 （90S preribosome）、 胞質(zhì)大核糖體單元 （cytosolic large ribosomal subunit）。 在細胞過程的 GO 功能分類下面，富集程度排名前5 的條目分別為核糖體生物合成 （ribosome biogenesis）、rRNA 加 工 （rRNA processing）、 核 蛋 白 復 合 物 生 物 合 成（ribonucleoprotein complex biogenesis）、 質(zhì) 膜 翻 譯（cytoplasmic translation）、rRNA 代 謝 過 程（rRNAmetabolic process）。 在分子功能分類下面，富集程度排名前5 的條目分別為核糖體的結(jié)構(gòu)組分（structural constituent of ribosome）、 核仁小 RNA 結(jié)合（snoRNA binding）、rRNA 結(jié)合 r（RNA binding）、氧化還原酶活性， 作用在醛或供體氧化基團（oxidoreductase activity，acting on the aldehyde or oxo group of donors）、氧化還原酶活性，作為受體作用 在 醛 、 供 體 、NAD 或 NADP 的 氧 化 基 團（oxidoreductase activity，acting on the aldehyde or oxo group of donors，NAD or NADP as acceptor）。 從中可以得出， 在GO 功能分類中， 富集程度最高的GO 條目主要與核糖體合成及相關(guān)功能有關(guān)。 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，這兩條途徑上的大部分差異基因發(fā)生上調(diào)。

2.6 37 ℃差異表達基因KEGG 通路分析

圖4 差異基因GO 功能分類統(tǒng)計圖Fig. 4 GO terms clustering analysis

為了解差異基因的生物學功能，對注釋的后差異表達基因進行KEGG 通路富集分析。 有1 846 個差異基因被富集在301 條通路中，富集結(jié)果見圖5。其中， 富集程度最顯著的前10 個通路依次為核糖體 （Ribosome）、 真 核 生 物 核 糖 體 的 生 物 合 成（Ribosome biogenesis in eukaryotes）、糖酵解/糖異生（Glycolysis/ Gluconeogenesis）、 碳 代 謝 （Carbon metabolism）、 氨基酸的生物合成 （Biosynthesis of amino acids）、脂肪酸降解（Fatty acid degradation）、丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解 （Valine，leucine and isoleucine degradation）、HIF-1 信 號 通 路 （HIF-1 signaling pathway）、組氨酸代謝（Histidine metabolism）。 其中，最顯著的兩條通路均與核糖體相關(guān)。 有研究指出，海藻糖對酵母的保護作用是由于海藻糖參與了諸多代謝途徑，而并不僅僅是因為胞內(nèi)海藻糖水平的上升[24]。結(jié)合本研究推測，外源海藻糖對啤酒酵母耐熱性的增強可能是外源海藻糖的添加使酵母胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分數(shù)上升，上升的胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分數(shù)促進了諸多代謝途徑，主要是參與核糖體合成的相關(guān)代謝途徑，使核糖體功能得到增強，進而實現(xiàn)對啤酒酵母活力及活性的提升。

圖5 差異基因Pathway 富集結(jié)果Fig. 5 KEGG Pathway analysis

X 軸代表富集因子值，Y 軸代表通路名稱。顏色代表qvalue（顏色越白值越大，越藍值越小），值越小代表富集結(jié)果越顯著。 點的大小代表DEG 數(shù)目（點越大代表數(shù)目越大， 越小代表數(shù)目越少）。 Rich Factor 指的是富集因子值， 是注釋上某一通路的前景值（差異基因個數(shù)）與注釋上某一通路的背景值（所有基因個數(shù)）之商，數(shù)據(jù)越大，說明富集結(jié)果越明顯。

3 結(jié) 語

外源海藻糖可以提高酵母耐熱性，這種保護作用具有一定限度，隨著溫度的升高和脅迫時間的增加，不同濃度的外源海藻糖對酵母活力和活性影響的差異減小。 外源海藻糖的添加導致酵母胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分數(shù)上升并影響多條代謝途徑，主要促進了核糖體的合成及功能相關(guān)途徑。 推測外源海藻糖對啤酒酵母耐熱性增強的作用機理是外源海藻糖導致酵母胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分數(shù)上升，促進核糖體相關(guān)代謝，增強核糖體的合成和功能，進而提高啤酒酵母細胞的活力和活性。 在后續(xù)工作中，希望通過分析37 ℃下核糖體組分和功能的變化，進一步探究熱脅迫下外源海藻糖對啤酒酵母的保護作用機理。