徐偉良 ， 李春冬 ， 郭 梁 *，3， 郭元晟 ，3， 朱建軍 ，郝苗苗 ， 錢(qián)俊平 ，3， 雅 梅 ，3

（1. 錫林郭勒職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000；2. 錫林郭勒生物工程研究院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000；3. 錫林郭勒食品檢驗(yàn)檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，內(nèi)蒙古 錫林浩特026000）

蒙古族傳統(tǒng)乳制品具有悠久的制作歷史，其種類(lèi)多樣，味道鮮美，擁有獨(dú)特的風(fēng)味口感，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪及多種維生素，是提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的良好食品，在蒙古族的傳統(tǒng)飲食結(jié)構(gòu)中具有重要地位[1-2]。 蒙古族傳統(tǒng)奶嚼口是將新鮮牛奶放置在陰涼避光處，使其自然低溫發(fā)酵，發(fā)酵后上浮的乳白色稠油狀物質(zhì)即為奶嚼口。 蒙古族傳統(tǒng)奶嚼口是一種高油脂類(lèi)乳制品，根據(jù)劉文麗對(duì)蒙古族傳統(tǒng)奶嚼口的理化性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分研究報(bào)道可知，其固形物平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)到91.25%；平均蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.82%； 平均總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為54.45 mg/g； 平均pH值為3.765。 然而目前對(duì)蒙古族傳統(tǒng)奶嚼口微生物多樣性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

作者對(duì)錫林郭勒盟地區(qū)采集的蒙古族奶嚼口樣品中乳酸菌、雙歧桿菌和大腸桿菌進(jìn)行活菌分離計(jì)數(shù)，通過(guò)脂肪和酸度的檢測(cè)指標(biāo)來(lái)分析其對(duì)奶嚼口樣品中菌群結(jié)構(gòu)變化的影響。 利用分子生物學(xué)方法對(duì)乳酸菌進(jìn)行鑒定，為潛在功能益生菌的開(kāi)發(fā)提供了豐富的菌種資源，并對(duì)其地方標(biāo)準(zhǔn)制定以及工業(yè)化產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源 試驗(yàn)所用14 份蒙古族傳統(tǒng)奶嚼口樣品均采于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟地區(qū)牧民家中，稀奶油樣品是將牧民家中蒙古族傳統(tǒng)奶嚼口發(fā)酵的前體原乳離心后所得。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌種的鑒定使用乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨培養(yǎng)基（LST）、煌綠乳糖膽鹽培養(yǎng)基（BGLB）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基（VRBA）。

1.1.3 主要試劑與儀器 Takara 快速提取試劑盒（Code No.9164）： 購(gòu)于大連寶生物工程公司；EasyTaq?PCR Super Mix（Lot#K20614）：購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司； 引物27F 和1495R：北京睿博生物科技有限公司合成；SW-J-2FD 凈化工作臺(tái)： 購(gòu)于蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；HWS-250BX 恒溫恒濕培養(yǎng)箱：購(gòu)于天津市泰斯特儀器有限公司；2720 Thermal Cycler PCR 擴(kuò)增儀： 購(gòu)于BIORAB 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 奶嚼口樣品采集 將在牧民家采集的傳統(tǒng)奶嚼口攪拌均勻，將其裝入無(wú)菌采樣袋中，并編號(hào)和記錄。 將所有樣品放入便攜低溫恒溫冰箱中暫時(shí)儲(chǔ)存，盡快將樣品送回實(shí)驗(yàn)室并進(jìn)行菌種分離和理化檢測(cè)。

1.2.2 樣品脂肪和酸度測(cè)定 脂肪的測(cè)定參照GB 5009.6-2016[4]；酸度的測(cè)定參照 GB 5009.239—2016[5]。

1.2.3 樣品中微生物活菌計(jì)數(shù) 乳酸菌計(jì)數(shù)參照GB 4789.35-2016[6]；大腸桿菌計(jì)數(shù)參照GB 4789.3—2016[7]；雙歧桿菌計(jì)數(shù)參照 GB 4789.34—2016[8]。

1.2.4 樣品中菌種的鑒定

1） 菌種DNA 提取 傳統(tǒng)奶嚼口的基因組總DNA 的提取采用Takara 快速提取試劑盒。取30 μL裂解液于滅菌的Eppendorf（EP）管中，滅菌槍頭過(guò)火后，冷卻后的槍頭挑取單菌落，置于EP 管液面以下，使菌落完全接觸溶液并充分?jǐn)嚢琛?將EP 管置于金屬浴上，80 ℃熱變性 15 min，8 000 r/min 離心 5 min，將上清液吸出，轉(zhuǎn)移至新EP 管中，所得菌液總DNA 作為后續(xù)PCR 反應(yīng)的模板。

2） 菌種PCR 擴(kuò)增及序列鑒定 乳酸菌選用27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1495R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′） 用于擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系： 模板 DNA 1 μL、 引物 27F 和引物1495R 各 1 μL、EasyTaq PCR Super Mix 10 μL、ddH2O 7 μL。

反應(yīng)設(shè)定程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min、58 ℃退火 1 min、72 ℃延伸 2 min，共 30 循環(huán)；72 ℃末端延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2 g/dL 的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格的擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京睿博生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)拼接后在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 （national center for biotechnology information，NCBI）進(jìn)行 BLAST 同源比對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 奶嚼口的微生物活菌計(jì)數(shù)

采集于錫林郭勒盟地區(qū)的蒙古族傳統(tǒng)奶嚼口樣品中乳酸菌、雙歧桿菌和大腸桿菌活菌計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。

乳制品的活菌數(shù)可以指示出樣品的新鮮程度，并且高濃度的乳酸菌和雙歧桿菌是發(fā)揮傳統(tǒng)奶嚼口功效和篩選益生菌的必要條件。 從表1 可知，錫林郭勒盟地區(qū)14 份奶嚼口樣品中乳酸菌活菌數(shù)在（7.91~8.69） lg（CFU/mL）之間，雙歧桿菌活菌數(shù)在（4.09~6.64） lg（CFU/mL）之間，由于 14 份奶嚼口樣品均采自錫林郭勒盟地區(qū)，牧區(qū)氣候和地理環(huán)境相差不大， 因此測(cè)得14 份樣品間乳酸菌活菌數(shù)和雙歧桿菌活菌數(shù)相差不大。 其中所測(cè)樣品的乳酸菌數(shù)與陳紅霞等從鄂爾多斯地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中測(cè)得的乳酸菌數(shù)（6.26~9.99） lg（CFU/mL）[9]和德亮亮等從包頭和巴彥淖爾地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中測(cè)得的乳酸菌數(shù)（6.74~9.16） lg（CFU/mL）[10]以及 Watanabe 等人從蒙古國(guó)地區(qū)以奶牛、牦牛、母馬、山羊等為乳源的傳統(tǒng)乳制品中測(cè)得的乳酸菌數(shù)（3.41~9.03） lg（CFU/mL）[11]相比，均在平均水平范圍。 所測(cè)雙歧桿菌活菌數(shù)與Delcenserie 等人在羊奶酪中分離的雙歧桿菌活菌數(shù)（1.6~5） lg（CFU/g）[12]相比，高于上述數(shù)據(jù)。 因此可知，所測(cè)奶嚼口樣品的新鮮程度較好，并含有豐富的乳酸菌和雙歧桿菌， 有利于后續(xù)菌種的分離鑒定研究。

表1 傳統(tǒng)奶嚼口樣品中菌落計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 Colony counts of traditional Jiaokou samples

大腸桿菌作為乳制品的衛(wèi)生指標(biāo)菌，可以間接顯示乳制品的衛(wèi)生狀況，大腸桿菌總數(shù)超標(biāo)會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重的危害。 由表1 可以看出，測(cè)得樣品中大腸桿菌活菌平均數(shù)為2.63 lg（CFU/mL），個(gè)別樣品中大腸桿菌總數(shù)較高。 大腸桿菌的出現(xiàn)可能和牲畜馴養(yǎng)環(huán)境、原料的采集、傳統(tǒng)奶嚼口的加工條件、氣候等因素有關(guān)。 自然發(fā)酵的傳統(tǒng)奶嚼口保存了其中所含有益微生物，但是也含有對(duì)人體健康有潛在威脅性的微生物，因此需要對(duì)傳統(tǒng)奶嚼口的微生物組成和乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究。

2.2 奶嚼口樣品酸度與菌群之間的關(guān)系

從圖 1 可看出， 乳酸菌在酸度 80.6~307 °T 區(qū)間活菌數(shù)穩(wěn)定，強(qiáng)酸條件對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響，說(shuō)明乳酸菌對(duì)強(qiáng)酸環(huán)境有耐受性，這與劉亞?wèn)|等人研究結(jié)果相類(lèi)似[13]。 雙歧桿菌在酸度80.6~134 °T 區(qū)間時(shí)趨于穩(wěn)定，說(shuō)明酸度在小于 134 °T 時(shí)對(duì)雙歧桿菌活菌數(shù)幾乎沒(méi)有影響，這與孟祥晨等對(duì)雙歧桿菌生理功能特性的研究結(jié)果相類(lèi)似[14]。 大腸桿菌活菌數(shù)隨著酸度的升高而減少， 直至酸度到134 °T 時(shí)大腸桿菌已經(jīng)減少至零，說(shuō)明大腸桿菌可能對(duì)高酸度環(huán)境耐受性差， 這與Malgorzata 等人對(duì)雙歧桿菌發(fā)酵乳活性的研究相類(lèi)似[15]。

圖1 奶嚼口樣品中酸度和微生物活菌數(shù)之間的關(guān)系Fig. 1 Relationship between the acidity and the number of viable microorganisms in traditional Jiaokou

2.3 稀奶油中微生物活菌計(jì)數(shù)

蒙古族傳統(tǒng)奶嚼口是生牛乳自然發(fā)酵后乳脂上浮的產(chǎn)物，通過(guò)表1 可知其平均脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)35.3%。 蒙古族傳統(tǒng)奶嚼口作為一種高油脂類(lèi)乳制品，類(lèi)似于商用生產(chǎn)中通過(guò)離心的方法將原牛乳中的乳脂分離出來(lái)制成的稀奶油產(chǎn)品[16-17]。 稀奶油是原牛乳未經(jīng)發(fā)酵而制成的乳脂產(chǎn)品，相當(dāng)于蒙古族傳統(tǒng)奶嚼口發(fā)酵的前體，因此，作者也對(duì)稀奶油中微生物菌群組成進(jìn)行研究，以期發(fā)掘稀奶油與蒙古族傳統(tǒng)奶嚼口微生物菌群之間的相互關(guān)系以及對(duì)奶嚼口產(chǎn)品發(fā)酵的影響，并為奶嚼口商用產(chǎn)品的研發(fā)提供有益借鑒。

從表2 可以看出，稀奶油樣品隨著靜置發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌數(shù)從5.63 lg（CFU/mL）增長(zhǎng)至8.04 lg（CFU/mL）；雙歧桿菌數(shù)從 3.08 lg（CFU/mL）增長(zhǎng)至 5.45 lg（CFU/mL）；大腸桿菌數(shù)從 4.74 lg（CFU/mL）增長(zhǎng)至6.68 lg（CFU/mL）。 稀奶油樣品中乳酸菌、雙歧桿菌和大腸桿菌活菌數(shù)均呈上升趨勢(shì)，并且菌群數(shù)量與奶嚼口樣品中的菌群數(shù)量相近，從而可推測(cè)稀奶油樣品和奶嚼口樣品中含有相似的菌群結(jié)構(gòu)。同時(shí)隨著靜置發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，稀奶油樣品的酸度逐漸上升，脂肪含量呈下降趨勢(shì)，這說(shuō)明乳酸菌、雙歧桿菌和大腸桿菌在稀奶油中大量繁殖并對(duì)稀奶油進(jìn)行發(fā)酵。

表2 稀奶油樣品菌落數(shù)與理化指標(biāo)Table 2 Colony counts and physicochemical profiles of cream samples

2.4 奶嚼口樣品中菌種鑒定結(jié)果

將傳統(tǒng)奶嚼口通過(guò)微生物培養(yǎng)方法，分別接到不同培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，按照菌落的顏色、大小、邊緣是否整齊、表面是否光滑等特征挑選，在14 份樣品中共挑選出55 株菌株。 將挑取的菌株進(jìn)行DNA 提取和PCR 擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序分析。 測(cè)序后的基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果見(jiàn)圖2。 分離的55 株菌株分屬于 5 個(gè)屬： 腸球菌屬 （Enterococcus faecalis 34.55%、Enterococcus faecium 1.82%）， 乳桿菌屬（Lactobacillus plantarum 25.45% 、Lactobacillus paracasei 9.09%、Lactobacillus helveticus 1.82%），乳球菌屬 （Lactococcus lactis 16.36%）， 雙歧桿菌屬（Bifidobacterium crudilactis 5.45% 、Bifidobacterium psychraerophilum 3.64%） 及鏈球菌屬（Streptococcus thermophilus 1.82%）。

圖2 奶嚼口菌種序列鑒定結(jié)果Fig. 2 Sequencing results of strains in traditional Jiaokou

腸球菌屬是人和動(dòng)物腸道的正常菌群，通常被當(dāng)做益生菌， 有著良好的生物安全性和益生特性。Nuenopalop 等在人的糞便中分離出的E. faecalis 具有良好胃酶和低pH 耐受性，并且對(duì)萬(wàn)古霉素、利福平、四環(huán)素和紅霉素敏感，對(duì)四環(huán)素氯霉素和卡那霉素具有耐藥性[18]。 Haghshenas 等人在150 種傳統(tǒng)乳制品中分離出的E. faecium 不僅對(duì)低pH 環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力，還能在腸道壁上粘附增值并且還能有效的排斥病原菌的定植，從而達(dá)到抑制病原菌的效果[19]。 晏濤研究發(fā)現(xiàn)，E. faecium HDRsEf1 可以幫助維持和增強(qiáng)腸道的屏障功能， 減輕感染ETEC 的小鼠腸道炎癥以及小鼠體重降低和腹瀉癥狀[20]。

乳桿菌屬是由一類(lèi)遺傳和生理特性多樣的桿狀乳酸菌構(gòu)成，到目前為止乳桿菌屬是乳酸菌中最大的一個(gè)屬。 基于發(fā)酵的最終產(chǎn)物，這個(gè)屬的種可以被劃分為3 組，即同型乳酸發(fā)酵的乳桿菌、兼性異型乳酸發(fā)酵的乳桿菌和專(zhuān)性異型乳酸發(fā)酵的乳桿菌。 郭怡麟選取經(jīng)過(guò)益生評(píng)價(jià)的L. plantarum ZDY2013 對(duì)Helicobacter pylori 進(jìn)行拮抗抑制試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其選取的 L. plantarum 可以有效拮抗Helicobacter pylori SS1 粘附在人胃腺癌細(xì)胞上[21]。張丹丹等人對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的一株L. plantarum 進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，此株L. helveticus 具有一定的耐酸及耐膽鹽能力，并且對(duì)Caco-2 細(xì)胞具有較強(qiáng)的黏附能力[22]。

乳球菌屬是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性菌，部分菌種可從乳制品、植物產(chǎn)品等分出，其模式種為乳酸乳球菌。乳酸乳球菌是發(fā)酵工業(yè)中常用的的發(fā)酵劑之一，特別是在發(fā)酵乳制品中。 徐海燕等人在中國(guó)的內(nèi)蒙古牧區(qū)、西部少數(shù)民族地區(qū)和蒙古國(guó)發(fā)酵乳中分離出了204 株L. lactis[23]。 張燕在酸馬奶中分離L. lactis代謝產(chǎn)物對(duì)小鼠盲腸微生物以及營(yíng)養(yǎng)代謝的影響，發(fā)現(xiàn)L. lactis 可減少小鼠盲腸中的大腸桿菌數(shù)量，增加 Lactobacillus 和 Bifidobacterium 數(shù)量[24]。

鏈球菌屬?gòu)V泛分布于自然界， 從水、 乳、塵埃、人和動(dòng)物糞便皆可檢出。 常見(jiàn)的對(duì)人體有益的鏈球菌為嗜熱鏈球菌，是制作酸奶的必需菌種。 華鶴良等人對(duì)乳品廠保藏的乳酸菌樣品進(jìn)行分子鑒定，最終分離出了一株綜合發(fā)酵性能良好的S. thermophilus[25]。 Sun 等人在青海省傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳制品中分離出嗜熱鏈球菌，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行試驗(yàn)， 最終成功篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵特性的S.thermophilus ND03[26]。王玥研究發(fā)現(xiàn)，S. thermophilus有緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激作用[27]。

雙歧桿菌屬的細(xì)菌是人和動(dòng)物腸道菌群的重要組成成員之一， 廣泛存在于人和動(dòng)物的消化道、口腔等生境中。 一些雙歧桿菌的菌株可以作為益生菌用在食品、醫(yī)藥和飼料方面。 Bunesova 等人對(duì)羊奶酪中雙歧桿菌進(jìn)行分離鑒定， 第一次證明了B. crudilactis 存在于綿羊奶酪中[28]。 Hsieh 等人對(duì)開(kāi)菲爾粒中微生物進(jìn)行分離鑒定，其中分離出了B. psychraerophilum[3]。

3 結(jié) 語(yǔ)

作者對(duì)錫林郭勒盟地區(qū)采集的14 份蒙古族傳統(tǒng)奶嚼口樣品進(jìn)行了微生物組成分析，其中乳酸菌活菌數(shù)在（7.91~8.69） lg（CFU/mL），雙歧桿菌活菌數(shù)在（4.09~6.64） lg（CFU/mL），大腸桿菌活菌數(shù)在（0~5.45） lg（CFU/mL）。 對(duì)奶嚼口樣品進(jìn)行菌種鑒定分析表明，奶嚼口樣品中菌種分屬于5 個(gè)屬，其中優(yōu)勢(shì)菌株為糞腸球菌 （Enterococcus faecalis 34.55%）、 植物乳桿菌 （Lactobacillus plantarum 25.45%）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis 16.36%）。

奶嚼口樣品的酸度和微生物活菌數(shù)之間的關(guān)系研究表明，乳酸菌對(duì)高酸度環(huán)境耐受性強(qiáng)，當(dāng)酸度條件達(dá)307 °T 任對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響；雙歧桿菌在酸度80.6~134 °T 區(qū)間時(shí)趨于穩(wěn)定；大腸桿菌活菌數(shù)隨著酸度的升高而減少，直至酸度到134 °T 時(shí)大腸桿菌已減少至零，說(shuō)明大腸桿菌可能對(duì)高酸度環(huán)境耐受性較差。 通過(guò)對(duì)稀奶油樣品中乳酸菌、雙歧桿菌和大腸桿菌分析表明，其菌群數(shù)量與奶嚼口樣品中的菌群數(shù)量相近，從而可推測(cè)稀奶油樣品和奶嚼口樣品中含有相似的菌群結(jié)構(gòu)。 上述研究表明，蒙古族傳統(tǒng)奶嚼口具有豐富的益生菌資源，在微生物資源開(kāi)發(fā)和商業(yè)化生產(chǎn)方面具有巨大潛力。