朱麗飛 ， 王小元

（1. 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué) 食品安全國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122；3. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

關(guān)鍵字： 大腸桿菌；L-蘇氨酸；PTS 系統(tǒng)；galP；ptsH；ptsG

L-蘇氨酸是人體必需8 種氨基酸之一，廣泛應(yīng)用于食品添加劑、飼料添加劑、化妝品、醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖和保健品等多個(gè)領(lǐng)域，是一種非常重要的發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品[1-3]。 大腸桿菌（Escherichia coli）作為一種模式微生物，具有遺傳背景清晰、易改造、生長(zhǎng)迅速、對(duì)發(fā)酵條件要求低等優(yōu)點(diǎn)，最常用的是L-蘇氨酸生產(chǎn)菌株[4-7]。

磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）依賴的磷酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（PTS）是大腸桿菌中轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的最主要方式，通過(guò)PEP 提供磷酸，把葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)的同時(shí)使其磷酸化成葡萄糖-6-磷酸 （G-6-P）[8-9]，ptsH 基因編碼PTS 系統(tǒng)中磷酸組氨酸搬運(yùn)蛋白HPr，ptsG 基因編碼膜透性酶EIICBGlc。 葡萄糖還可以通過(guò)galP基因編碼的半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GalP 進(jìn)入胞內(nèi)[10]。 G-6-P 由己糖磷酸異構(gòu)酶PgI（pgi 基因編碼）催化生成6-磷酸果糖（F-6-P），再由磷酸果糖激酶PfkA（pfkA基因編碼）催化生成1，6-二磷酸果糖；由于這一步是糖酵解的關(guān)鍵限速步驟，pfkA 基因的表達(dá)水平一定程度上可以反映出糖酵解的強(qiáng)弱以及糖酵解中碳流到磷酸烯醇式丙酮酸的強(qiáng)弱[11-13]。 PEP 作為糖酵解的產(chǎn)物，由eno 基因編碼的烯醇化酶催化合成，PEP 可被pykA 基因編碼的丙酮酸激酶催化生成丙酮酸，丙酮酸脫氫生成乙酰輔酶A，再經(jīng)gltA 基因編碼的檸檬酸合酶催化生成檸檬酸，進(jìn)入檸檬酸循環(huán)生成草酰乙酸。 草酰乙酸經(jīng)aspC 基因編碼的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AspC 催化生成天冬氨酸[14]，再經(jīng)thrA 基因編碼的天冬氨酸激酶、thrB 基因編碼的高絲氨酸激酶、thrC 基因編碼的蘇氨酸合成酶等關(guān)鍵酶催化生成L-蘇氨酸，見(jiàn)圖1。

作為 PTS 系統(tǒng)的關(guān)鍵基因，ptsH 和 ptsG 的缺失或者突變會(huì)使PTS 系統(tǒng)不能正常轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，而只能利用GalP 系統(tǒng)等其他不消耗PEP 的方式轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖[8，15]。 作者在一株大腸桿菌L-蘇氨酸高產(chǎn)菌TWF001 中敲除了ptsH 和 ptsG 基因， 并且在 ptsH的敲除菌基因組上過(guò)表達(dá)galP 基因，發(fā)現(xiàn)改善葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有利于大腸桿菌L-蘇氨酸的合成。

圖1 大腸桿菌中L-蘇氨酸合成代謝路程Fig. 1 Biosynthesis pathway of L-threonine in E. coli

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

本研究所有的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1， 所有的菌株都為大腸桿菌。 JM109 是用來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒制作感受態(tài)用，發(fā)酵菌株TWF001 是作者所在實(shí)驗(yàn)室篩到的一株 L-蘇氨酸高產(chǎn)菌， 保藏編號(hào)為 CCTCC no.M2017730[17]。 LB 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，NaCl 10，酵母粉5， 固體需要添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂。發(fā)酵種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，NaCl 10，酵母粉5，蔗糖 10，121 ℃滅菌 20 min。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖（30、40、50、60，根據(jù)需要添加），（NH4）2SO425，酵母粉 2，檸檬酸 2，KH2PO47.46，MgSO4·7H2O2，F(xiàn)eSO4·7H2O5，MnSO4·4H2O5，CaCO320；pH 6.8（NaOH 調(diào) pH），115 ℃滅菌 15 min。 酵母粉和蛋白胨：購(gòu)自O(shè)XIOD 公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自Sigma 公司；其他化學(xué)試劑：均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HPLC 級(jí)甲醇和乙腈： 購(gòu)自蘇州科盛公司；2×Taq PCR MasterMix：購(gòu)自南京博爾迪生物科技有限公司；QuickCut DpnI 酶、PrimerStar DNA 聚合酶：購(gòu)自 TaKaRa 公司；T4 DNA 連接酶、 反轉(zhuǎn)錄 cDNA 試劑盒： 購(gòu)自 Fermentas 公司；T4 多聚核苷酸激酶：購(gòu)自紐英倫生物技術(shù) （北京） 有限公司；ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix： 購(gòu)自諾唯贊生物；Simply P 總 RNA 提取試劑盒： 購(gòu)自 Bioflux 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒：購(gòu)自天根生物科技有限公司；SanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒： 均購(gòu)自生工生物工程股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本研究所有用來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒和突變菌的引物信息見(jiàn)表 1， 敲除突變菌株所用引物設(shè)計(jì)參照MG1655 基因組。 基因組和質(zhì)粒的提取根據(jù)基因組和質(zhì)粒提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行； 基因組片段用PrimerStar DNA 聚合酶 PCR 獲得， 片段回收用SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒，操作見(jiàn)說(shuō)明書(shū)；菌落驗(yàn)證用 2×Taq PCR MasterMix 進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證。

以 MG1655 基因組為模板， 以引物 ptsHf1/ptsHr1 擴(kuò)增出ptsH 基因上游片段ptsH-U， 以引物ptsHf2/ ptsHr2 擴(kuò)增出ptsH 基因上游片段ptsH-D，再通過(guò)重疊PCR 把上下游片段重疊到一起得到ptsH 的敲除片段 ptsH-UD。 以 pTargetF 為模板，以引物 sgRNA-ptsH-F/T-sgRNA-R 擴(kuò)增出構(gòu)建pTargetF-ptsH 的片段， 片段經(jīng)過(guò) DpnI 酶消化，T4 Pnk 激酶磷酸化，T4 DNA 連接酶連接后化轉(zhuǎn)到JM109 感受態(tài)中，構(gòu)建和擴(kuò)增質(zhì)粒，在含50 mg/L 壯觀霉素的LB 平板上生長(zhǎng)10 h 后， 用引物Y-ptsHF/T-sgRNA-R 篩選正確的轉(zhuǎn)化子， 得到敲除質(zhì)粒pTargetF-ptsH。 100 ng 敲除質(zhì)粒 pTargetF-ptsH 和500 ng 敲除片段 ptsH-UD 同時(shí)電轉(zhuǎn)入 80 uL 的TWF001/pCas 電轉(zhuǎn)感受態(tài)中，在 30 ℃、100 r/min 慢搖復(fù)蘇2 h，涂在含50 mg/L 壯觀霉素和卡那霉素的LB 平板，30 ℃培養(yǎng) 48 h 后用引物 ptsHf1/ ptsHr2 驗(yàn)證，得到正確敲除的轉(zhuǎn)化子，正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接含50 mg/L 卡那霉素和0.5 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的 LB 試管誘導(dǎo)培養(yǎng)去除pTargetF-ptsH質(zhì) 粒 ，42 ℃過(guò) 夜 培 養(yǎng) 去 除 pCas 質(zhì) 粒 ， 去 除pTargetF-ptsH 和pCas 質(zhì)粒后分別在含壯觀霉素和卡那霉素的LB 平板上進(jìn)行反篩， 確定是否去除質(zhì)粒成功，最后得到不含質(zhì)粒的正確敲除ptsH 基因的突變菌TWF001ΔptsH。

表1 本研究中所用到菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in the study

TWF001ΔptsG 的 構(gòu) 建 過(guò) 程 同 上 述TWF001ΔptsH 的構(gòu)建， 所用引物參照表 2 中的ptsGf1/ptsGr1、ptsGf1/ptsGr1、sgRNA -ptsG -F/T -sgRNA-R、Y-ptsG-F/T-sgRNA-R。

TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 的 構(gòu) 建 是 以MG1655 基因組為模板， 以引物galPf1/galPr1 擴(kuò)增出galP 基因上游片段galP-U，以引物galPf2/galPr2擴(kuò)增出galP 基因上游片段galP-D， 引物Trc-F/Trc-R 95 ℃變性、4 ℃退火形成trc 啟動(dòng)子片段，再通過(guò)重疊PCR 把上游、trc 啟動(dòng)子和下游片段重疊到一起得到galP 的敲入片段trc-galP。以pTargetF 為模板，以引物sgRNA-galP-F/T-sgRNA-R 擴(kuò)增出構(gòu)建pTargetF-galP 的片段， 片段經(jīng)過(guò) DpnI 酶消化，T4 Pnk 激酶磷酸化，T4 DNA 連接酶連接后化轉(zhuǎn)到JM109 感受態(tài)中，構(gòu)建和擴(kuò)增質(zhì)粒，在含50 mg/L 壯觀霉素的LB 平板上生長(zhǎng)10 h 后，用引物Y-galP -F/T-sgRNA-R 篩選正確的轉(zhuǎn)化子， 得到敲除質(zhì)粒pTargetF-galP。 100 ng 敲除質(zhì)粒 pTargetF-galP 和500 ng 敲除片段 trc-galP 同時(shí)電轉(zhuǎn)入 80 uL 的TWF001ΔptsH/pCas 電轉(zhuǎn)感受態(tài)中，在 30 ℃、100 r/min慢搖復(fù)蘇2 h，涂在含50 mg/L 壯觀霉素和卡那霉素的 LB 平板，30 ℃培養(yǎng) 48 h 后用引物 Trc-F/galPr2驗(yàn)證，得到正確敲入的轉(zhuǎn)化子，正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接含50 mg/L 卡那霉素和0.5 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的LB 試管誘導(dǎo)培養(yǎng)去除pTargetF-galP質(zhì) 粒 ，42 ℃ 過(guò) 夜 培 養(yǎng) 去 除 pCas 質(zhì) 粒 ， 去 除pTargetF-galP 和pCas 質(zhì)粒后分別在含壯觀霉素和卡那霉素的LB 平板上進(jìn)行反篩， 確定是否去除質(zhì)粒成功， 最后得到不含質(zhì)粒的正確敲入trc-galP 基因的突變菌 TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP。

表2 本研究構(gòu)建質(zhì)粒和菌株所用引物Table 2 Primers usedused to construct plasmids andstrains in this study

表3 本研究RT-PCR 所用引物Table 3 Primers used for RT-PCR in this study

1.3 發(fā)酵過(guò)程參數(shù)測(cè)定

1.3.1 生物量的測(cè)定 生長(zhǎng)在LB 培養(yǎng)基中的種子液的OD600的測(cè)定：取1 mL 菌液，再用去離子水稀釋相應(yīng)的倍數(shù)充分混勻， 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm 下的吸光度，再乘以相應(yīng)倍數(shù)得到最后值。

生長(zhǎng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌液的OD600的測(cè)定：取1 mL 菌液充分混勻，再用去1 mol/L 的稀鹽酸稀釋相應(yīng)的倍數(shù)， 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在波長(zhǎng)為600 nm 下的吸光度，再乘以相應(yīng)倍數(shù)得到最后值。

圖2 菌株構(gòu)建流程和質(zhì)粒圖Fig. 2 Construction process of mutant strains and the map of plasmids

1.3.2 葡萄糖質(zhì)量濃度的測(cè)定 發(fā)酵液取樣，發(fā)酵液樣品 12 000 r/min 離心， 取上清液 10 μL 用去離子稀釋100 倍，用SBA40 還原糖測(cè)定儀測(cè)定葡萄糖的質(zhì)量濃度。

1.3.3 氨基酸含量的測(cè)定

1） 樣品預(yù)處理 發(fā)酵液12 000 r/min 離心，取500 μL 上清液加入到 500 μL 的 10%的三氯乙酸溶液中，充分混勻，4 ℃靜置 4 h 以上。 12 000 r/min 離心15 min，用0.22 μm 的水相針式濾膜過(guò)濾上清液，上清液稀釋合適的倍數(shù)后用HPLC 測(cè)定氨基酸含量。

2） 高效液相色譜 采用鄰苯二甲醛柱前衍生法[18]。 儀器采用 Agilent 1200 超高效液相色譜儀，色譜柱為 Thermo ODS -2HYPERSIL C18 column（250 mm×4.0 mm，USA）。 流動(dòng)相（水相）：3.01 g 無(wú)水乙酸鈉溶解于超純水中，200 μL 三乙胺，5 mL 四氫呋喃，超純水定容到1 L，乙酸調(diào)至pH 7.2。 洗脫相（有機(jī)相）：3.01 g 無(wú)水乙酸鈉溶解于200 mL 超純水中，用5%醋酸調(diào)至pH 7.2，再加400 mL 的HPLC級(jí)甲醇和400 mL 的HPLC 級(jí)乙腈。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析

相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)StepOnePlus 實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x（美國(guó)Applied Biosystems 公司）檢測(cè)，所用引物見(jiàn)表2。發(fā)酵對(duì)數(shù)中期的發(fā)酵液，低速短暫離心取上清液去除發(fā)酵液中的CaCO3，12 000 r/min 離心收集菌體，RNA 的提取步驟、cDNA 的反轉(zhuǎn)錄合成以及RT-qPCR 的詳細(xì)步驟及參數(shù)分別按照Bioflux RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)、Fermentas 公司反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒和諾唯贊生物ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix 說(shuō)明書(shū)，數(shù)據(jù)的分析參照文獻(xiàn)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 突 變 菌 TWF001ΔptsH、TWF001ΔptsG 和TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 的構(gòu)建驗(yàn)證

3 株突變菌構(gòu)建的電泳驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖3。 對(duì)照菌 TWF001 用引物 ptsHf1/ptsHr2 進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證，擴(kuò)增出1 500 bp 左右大小的條帶， 如1 泳道所示，大小正確；突變菌TWF001ΔptsH 用引物ptsHf1/ptsHr2擴(kuò)增出了1 200 bp 左右大小的條帶， 如2 泳道所示，大小正確，電泳結(jié)果顯示敲除了正確大小的條帶，ptsH 基因敲除成功。

圖 3 TWF001ΔptsH、TWF001ΔptsG 和 TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 構(gòu)建驗(yàn)證Fig. 3 Verification of TWF001ΔptsH，TWF001ΔptsG and TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP by PCR

突變菌 TWF001ΔptsG 用引物 ptsGf1/ptsGr2 PCR 驗(yàn)證，擴(kuò)增出1 500 bp 左右大小的條帶，如3泳道所示， 大小正確； 而對(duì)照菌TWF001 用引物ptsGf1/ptsGr22 擴(kuò)增出的片段大小為 3 000 bp 左右，如4 泳道所示，大小正確。 電泳結(jié)果顯示敲除了正確大小的條帶，ptsG 基因敲除成功。

對(duì)照菌TWF001 經(jīng)過(guò)基因組測(cè)序顯示沒(méi)有完整的galP 基因， 只存在galP 起始十幾個(gè)堿基的片段，且沒(méi)有其它同源性較高的序列。 要插入的片段包括一段galP 位置上的上游同源片段、trc 啟動(dòng)子和galP 基因，大小為2 048 bp，突變菌TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 用引物 galPf1/galPr2 PCR 驗(yàn)證，擴(kuò)增出2 000 bp 左右大小的條帶， 如 5 泳道所示， 大小正確； 而 TWF001ΔptsH 基因組上沒(méi)有引物 galPr2 結(jié)合位點(diǎn)， 所以擴(kuò)增不出條帶， 如6 泳道所示。TWF001 基因結(jié)構(gòu)特殊，galP 基因本身有1 395 bp，在基因組上插入trc 啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)galP 基因片段的難度較大。 PCR 驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，提取基因組，高保真酶擴(kuò)增插入片段，對(duì)片段進(jìn)行測(cè)序檢驗(yàn)，完全正確插入片段并且沒(méi)有突變的就是最終正確突變株。

2.2 TWF001ΔptsH 在不同葡萄糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中的搖瓶發(fā)酵結(jié)果分析

為了進(jìn)一步提高TWF001 的L-蘇氨酸含量，在TWF001 中 敲 除 ptsH 基 因 ， 得 到 突 變 株TWF001ΔptsH。突變株在葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L[6]的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定生長(zhǎng)OD600、葡萄糖質(zhì)量濃度和L-蘇氨酸的產(chǎn)量。 為了探究L-蘇氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率能否隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高進(jìn)一步提升，又分別在含40、50、60 g/L 葡萄糖質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

出發(fā)對(duì)照菌TWF001 和突變菌 TWF001ΔptsH在含 30、40、50、60 g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中的搖瓶發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖 4（a）可知，TWF001ΔptsH 在各個(gè)葡萄糖質(zhì)量濃度中的生長(zhǎng)都要比TWF001 慢，生長(zhǎng)受到明顯的抑制。 當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L 時(shí)，TWF001的最大OD600為15.59，當(dāng)葡萄質(zhì)量濃度繼續(xù)升高到40、50 g/L 時(shí)，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，TWF001的生長(zhǎng)越好，60 g/L 的葡萄糖就開(kāi)始抑制菌體的生長(zhǎng)。 TWF001ΔptsH 在 30 g/L 葡萄糖中的最大 OD600為12.03，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度升高到40、50、60 g/L時(shí)，雖然OD600變大了，但是發(fā)酵前期18 h 內(nèi)，菌體生長(zhǎng)非常緩慢，不利于發(fā)酵合成L-蘇氨酸。

如圖 4（b）所示，TWF001 在 30 g/L 葡萄糖質(zhì)量濃度發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵24 h 耗盡葡萄糖；隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高， 發(fā)酵36 h 最多能耗掉50 g/L 的葡萄糖。TWF001ΔptsH 在30 g/L 葡萄糖質(zhì)量濃度發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵30 h 耗盡葡萄糖，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，耗糖明顯被抑制，發(fā)酵36 h 最多能耗掉40 g/L的糖， 并且當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度等于或者高于40 g/L時(shí)，發(fā)酵前18 小時(shí)幾乎不消耗葡萄糖，葡萄糖攝取被嚴(yán)重抑制，各個(gè)質(zhì)量濃度中的耗糖速度都比對(duì)照菌慢。

圖4 TWF001 和TWF001ΔptsH 在葡萄糖質(zhì)量濃度為 30、40、50、60 g/L 的培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵Fig. 4 Flask fermentation of TWF001 and TWF001ΔptsH in medium with 30，40，50，60 g/L glucose

如圖 4（c）所示，TWF001 在 30 g/L 葡萄糖質(zhì)量濃度發(fā)酵時(shí)L-蘇氨酸產(chǎn)量為12.97 g/L， 糖酸轉(zhuǎn)化率為0.43 g/g； 隨著葡萄糖質(zhì)量濃度升高到40 g/L時(shí)，L-蘇氨酸產(chǎn)量為18.41 g/L， 此時(shí)達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率0.46 g/g；隨著葡萄糖質(zhì)量濃度升高到50 g/L 時(shí)，L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大的22.56 g/L，轉(zhuǎn)化率下降到0.45 g/g；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為60 g/L 時(shí)，蘇氨酸產(chǎn)量反而下降。TWF001ΔptsH 在30 g/L 葡萄糖發(fā)酵時(shí)L-蘇氨酸產(chǎn)量為17.90 g/L， 比對(duì)照 TWF001 提高38.01%，這時(shí)的轉(zhuǎn)化率為0.60 g/g；葡萄糖質(zhì)量濃度升高到 40 g/L 時(shí)，L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大的22.16 g/L，但是轉(zhuǎn)化率下降到0.58 g/g，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度升高到50、60 g/L 時(shí)， 蘇氨酸產(chǎn)量反而下降，并且比對(duì)照菌要低。

ptsH 基因的敲除在30、40 g/L 葡萄糖質(zhì)量濃度時(shí)能明顯地提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量以及糖酸轉(zhuǎn)化率，但是生長(zhǎng)和糖耗受到抑制，并且40 g/L 的葡萄糖就開(kāi)始明顯抑制生長(zhǎng)和糖耗，降低轉(zhuǎn)化率，只適合在30 g/L 的葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵。

2.3 TWF001ΔptsG 在不同葡萄糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中的搖瓶發(fā)酵結(jié)果分析

為了進(jìn)一步提高TWF001 的L-蘇氨酸含量，在TWF001 中 敲 除 ptsG 基 因 ， 得 到 突 變 株TWF001ΔptsG。 突變株在 30 g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定生長(zhǎng)OD600、葡萄糖質(zhì)量濃度和L-蘇氨酸的產(chǎn)量。 為了探究L-蘇氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率能否隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高進(jìn)一步提升，又分別在含40、50、60 g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

出發(fā)對(duì)照菌 TWF001 和突變菌TWF001ΔptsG在含 30、40、50、60 g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中的搖瓶發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖5。

如圖 5（a）所示，TWF001ΔptsG 在各個(gè)葡萄糖質(zhì)量濃度中的生長(zhǎng)比TWF001 要慢一些，但生長(zhǎng)沒(méi)有受到太大的抑制。 當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L 時(shí)，TWF001ΔptsG 的最大 OD600為 11.61，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度繼續(xù)升高到40、50 g/L 時(shí)， 隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，菌體生長(zhǎng)的越好，60 g/L 的葡萄糖在發(fā)酵前18 小時(shí)抑制菌體的生長(zhǎng)。

如圖 5（b）所示，TWF001ΔptsG 在 30 g/L 葡萄糖發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵24 h 耗盡葡萄糖，與對(duì)照TWF001一致； 并且在40、50 g/L 的葡萄糖中的耗糖速度與對(duì)照菌十分接近，沒(méi)有明顯被抑制，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度升高到60 g/L 時(shí)，突變菌的葡萄糖攝取才表現(xiàn)出明顯被抑制。

圖5 TWF001 和TWF001ΔptsG 在葡萄糖質(zhì)量濃度為30、40、50、60 g/L 的培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵Fig. 5 Flask fermentation of TWF001 and TWF001ΔptsG in medium with 30，40，50，60 g/L glucose

如圖 5（c）所示，TWF001ΔptsG 在 30 g/L 葡萄糖發(fā)酵時(shí) L-蘇氨酸產(chǎn)量為 17.59 g/L， 比對(duì)照TWF001 提高了35.62%，這時(shí)的轉(zhuǎn)化率為0.59 g/g；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度升高到40 g/L 時(shí)，L-蘇氨酸產(chǎn)量為25.23 g/L，比對(duì)照TWF001 提高37.05%，為這個(gè)菌的最高幅度，此時(shí)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大0.63 g/g；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度升高到50 g/L 時(shí)，L-蘇氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大的28.39 g/L，只比對(duì)照提高了25.84%，轉(zhuǎn)化率也下降為0.57 g/g， 當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度升高到60 g/L 時(shí)，蘇氨酸產(chǎn)量反而下降。

ptsG 基因的敲除既能能明顯提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，40 g/L 葡萄糖時(shí)達(dá)到最大的轉(zhuǎn)化率和L-蘇氨酸產(chǎn)量提升幅度，是最適宜的葡萄糖質(zhì)量濃度。

2.4 TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在不同葡萄糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中的搖瓶發(fā)酵結(jié)果分析

上述發(fā)酵結(jié)果顯示，在30 g/L 葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，TWF001ΔptsH 的L-蘇氨酸產(chǎn)量為17.90 g/L，TWF001ΔptsG 的 L-蘇氨酸產(chǎn)量為 17.59 g/L。為了進(jìn)一步提高L-蘇氨酸產(chǎn)量， 在TWF001ΔptsH的基因組上用trc 啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)galP 基因， 得到突變株 TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP。 對(duì)突變株在 30 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，為了探究L-蘇氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率能否隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高進(jìn)一步提升，又分別在含40、50、60 g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

出發(fā)對(duì)照菌TWF001 和突變菌TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在含 30、40、50、60 g/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中的搖瓶發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖6。

《太原縣志》中記載，明清時(shí)期風(fēng)峪溝內(nèi)水患嚴(yán)重，明洪武、嘉靖年間、清乾隆元年、十七年、三十三年、四十年均爆發(fā)過(guò)大規(guī)模的洪災(zāi)，對(duì)人畜、建筑、交通要道有較大的損害。在清乾隆四十一年完成對(duì)沙堰的修建之后，“工竣，而城北等村可永免山水沖突之患矣”[11]。從現(xiàn)存周家莊古村建筑建造手法及建筑材料可以看出，村中建筑呈現(xiàn)由高向低，由東向西發(fā)展的趨勢(shì)，就是村民為防止水患危害，而采用的布局形式（圖2）。

如圖 6（a）所示，TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在30、50、60 g/L 葡萄糖中的生長(zhǎng)比 TWF001 要慢一些，但生長(zhǎng)沒(méi)有受到太大的抑制。 當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為 30 g/L 時(shí)，TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 的最大OD600為12.32；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度繼續(xù)升高到40 g/L時(shí)，生長(zhǎng)達(dá)到最好，并且比對(duì)照TWF001 略好。 升高到 50 g/L 時(shí)， 最大 OD600開(kāi)始下降， 當(dāng)繼續(xù)升高到60 g/L 時(shí)，生長(zhǎng)開(kāi)始受到較明顯的抑制。

如圖 6（b）所示，TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在30 g/L 的葡萄糖中的耗糖速度與對(duì)照菌幾乎一致，發(fā)酵18 h 耗盡30 g/L 的葡萄糖， 當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度高于40 g/L 時(shí)，耗糖受到一定抑制，且質(zhì)量濃度越高抑制越明顯，發(fā)酵36 h，最多能耗盡40 g/L 的葡萄糖。

圖 6 TWF001 和 TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在葡萄糖質(zhì)量濃度為30、40、50、60 g/L 的培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵情況Fig. 6 Flask fermentation of TWF001 and TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP in medium with 30，40，50，60 g/L glucose

如圖 6（c）所示，TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在30 g/L 葡萄糖發(fā)酵時(shí)L-蘇氨酸產(chǎn)量為17.66 g/L，比對(duì)照TWF001 提高了36.16%， 這時(shí)的轉(zhuǎn)化率為0.60 g/g；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度升高到40 g/L 時(shí)，L-蘇氨酸產(chǎn)量為 26.16 g/L， 比對(duì)照 TWF001 提高了42.10%，為3 株突變菌的最高幅度，此時(shí)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大的0.65 g/g，也是所有菌中最高的；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度升高到50、60 g/L 時(shí)，L-蘇氨酸產(chǎn)量分別下降到到21.43、20.16 g/L。

ptsH 基因的敲除能提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率， 但是ptsH 的生長(zhǎng)和糖耗受到明顯的抑制，在敲除ptsH 突變菌的基礎(chǔ)上用trc 啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)galP 基因，不僅能改善生長(zhǎng)和葡萄糖攝取[20]，還能進(jìn)一步提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。

2.5 基因ptsH 和ptsG 的敲除以及galP 的過(guò)表達(dá)對(duì)L-蘇氨酸合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響

為了探究造成這3 株突變菌L-蘇氨酸產(chǎn)量差異的原因，對(duì)大腸桿菌中影響L-蘇氨酸合成的相關(guān)基因 thrA、thrB、thrC、pfkA、eno、pykA、gltA、gdhA 和aspC 進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。 如圖7 所示，TWF001ΔptsH 中 thrA、thrB 和 thrC 的表達(dá)都有所提高，thrC 上升的最明顯， 這可能是蘇氨酸產(chǎn)量增加的主要原因之一；eno 基因明顯提高有利于合成更多的PEP[21]，pykA 基因的上調(diào)雖然不利于積累PEP，但有利于糖酵解的順利進(jìn)行合成丙酮酸，pfkA和gltA 基因是糖酵解和TCA 循環(huán)的關(guān)鍵限速步驟，它們的下調(diào)比較不利于生長(zhǎng)[5]，這可能是TWF001ΔptsH 生長(zhǎng)和糖耗受到抑制的原因之一。TWF001ΔptsG 中 thrA 基因明顯上調(diào)， 使得蘇氨酸合成加強(qiáng)，pfkA 和eno 基因上調(diào)的比較明顯， 這表示糖酵解的碳流和流向PEP 的碳流的提高，這有利于糖酵解和合成更多的PEP[11-13]，更多的PEP 供應(yīng)于蘇氨酸的合成，pykA 基因的上調(diào)也使得生長(zhǎng)更好，gdhA 基因的上調(diào)有利于合成更多谷氨酸， 而胞內(nèi)氮源絕大部分來(lái)自谷氨酸[21]，有利于L-蘇氨酸的合成，apsC 基因的上調(diào)有利于合成天冬氨酸， 天冬氨酸是重要的蘇氨酸前體物質(zhì)。 在TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 中，thrA、thrB、thrC、gdhA 和 aspC 這些基因都有明顯的上調(diào)，這些基因的上調(diào)都直接有利于L-蘇氨酸的合成， 這些可能是TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 的L-蘇氨酸產(chǎn)量的提升幅度和糖酸轉(zhuǎn)化率最高的原因；eno 基因也明顯上調(diào)有助于PEP的合成，但是pfkA 和gltA 基因上調(diào)較弱，不利于糖酵解和TCA 循環(huán)。

TWF001、TWF001ΔptsH 和 TWF001ΔptsG 中沒(méi)有g(shù)alP 基因，3 株菌中g(shù)alP 的相對(duì)表達(dá)量相同，都為 1；TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 中 galP 的相對(duì)表達(dá)量上升到16.2，提升幅度較大，表明插入基因組上的galP 基因得到表達(dá)。

圖7 L-蘇氨酸合成相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析Fig. 7 RT -qPCR analysis of genes involved in L -threonien synthesis

3 結(jié) 語(yǔ)

在一株高產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌中分別單獨(dú)敲除ptsH 和ptsG 基因，并在ptsH 敲除菌的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)galP 基因，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，都能較大幅度提高L-蘇氨酸產(chǎn)量和提高糖酸轉(zhuǎn)化率，且菌株不攜帶任何表達(dá)質(zhì)粒，有利于工業(yè)發(fā)酵。

ptsG 編碼PTS 系統(tǒng)中特異識(shí)別結(jié)合葡萄糖的膜結(jié)合蛋白EIICBGlc，ptsH 編碼PTS 中磷酸組氨酸搬運(yùn)蛋白HPr，是轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸基團(tuán)過(guò)程的一種蛋白質(zhì)，但是它為PTS 系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)其他物質(zhì)所共用。 敲除這兩個(gè)基因都能使PTS 系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖受阻，從而通過(guò)其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)如GalP 和MglABC 轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，能使用于PTS 系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖消耗的PEP 積累而用于代謝合成如L-蘇氨酸；RT-qPCR 也顯示這兩個(gè)基因的敲除能增加L-蘇氨酸合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)蘇氨酸的合成。

對(duì) TWF001、TWF001ΔptsH 和 TWF001ΔptsG進(jìn)行搖瓶發(fā)酵， 此時(shí)葡萄糖質(zhì)量濃度為30 g/L，TWF001ΔptsH 的生長(zhǎng)和糖耗沒(méi)有受到非常明顯抑制， 此時(shí)它的L-蘇氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率是最高的， 為了進(jìn)一步提高TWF001ΔptsH 的生長(zhǎng)糖耗和L-蘇氨酸產(chǎn)量，在基因組上用trc 過(guò)表達(dá)galP 基因。GalP 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的葡萄糖只需要消耗一分子ATP，積累的PEP 可大部分用于合成代謝，而且能改善葡萄糖的攝取速度。 繼續(xù)提升培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度，并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，研究結(jié)果顯示TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP 在40 g/L 的葡萄糖質(zhì)量濃度時(shí)達(dá)到最大的L-蘇氨酸產(chǎn)量26.16 g/L，提高幅度為42.11%，轉(zhuǎn)化率能達(dá)到0.65 g/g。 先敲除PTS 系統(tǒng)中與轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖相關(guān)的編碼基因，使細(xì)菌不能以PTS 系統(tǒng)為主要的轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的途徑，從而減少用于轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖所需要的PEP，這樣來(lái)自糖酵解的PEP 可大部分用于合成代謝， 再過(guò)表達(dá)GalP 這樣不需要消耗其他重要中間代謝物的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，這樣在不嚴(yán)重影響生長(zhǎng)和糖耗的同時(shí)能大幅度提高L-蘇氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。

之前有文獻(xiàn)報(bào)道敲除ptsG 或者ptsH 基因可以用來(lái)生產(chǎn)其他物質(zhì)[22-24]，本試驗(yàn)在一株高產(chǎn)L-蘇氨酸中只敲除ptsH、ptsG 以及過(guò)表達(dá)galP 就能較大幅度的提升產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，效果是十分明顯的，這在工業(yè)應(yīng)用上是比較有利的，但還可以進(jìn)一步繼續(xù)改造，使得生長(zhǎng)和糖耗進(jìn)一步提升。

因?yàn)楸境霭l(fā)菌基因組結(jié)構(gòu)較MG1655 復(fù)雜，生長(zhǎng)緩慢、單菌落非常小，構(gòu)建較困難，可以繼續(xù)在本研究的基礎(chǔ)上，在突變菌TWF001ΔptsG 中用trc 過(guò)表達(dá) galP 基因， 以及在 TWF001ΔptsH，Ptrc：：PgalP中過(guò)表達(dá)glk 基因，探究生長(zhǎng)和L-蘇氨酸產(chǎn)量情況并進(jìn)行其他能提高蘇氨酸產(chǎn)量的代謝改造。