周偉堅(jiān)，查麗燕，王 越，張振偉，文華樞，莫美華

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

紅汁乳菇（Lactarius hatsudake）屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌目（Agaricales）紅菇科（Russulaceae）乳菇屬（Lactarius），是一種松樹（Pinus）、柏樹（Platycladus orientalis)、杉樹（Taxodiaceae）等樹種的菌根菌，常于春末夏初和秋末冬初散生于馬尾松（Pinus massoniana Lamb.）林地上[1-2]。紅汁乳菇在我國分布廣泛，北至吉林、河北，南至福建、臺灣、廣東，西至廣西、云南、四川、貴州、西藏等地都有分布[3]。紅汁乳菇因其菌肉肥厚、香氣濃郁、口感甚佳、質(zhì)脆味美、營養(yǎng)豐富，是人們最喜歡的野生食用菌之一[4-6]。同時，紅汁乳菇具有很高的食（藥）用價值和經(jīng)濟(jì)價值，既有防癌抗癌的功效[7]，又可用作生態(tài)工程營林、橡膠生產(chǎn)的原材料，并能調(diào)節(jié)植物生長等[8]，所以紅汁乳菇在各地銷售市場上十分走俏。然而就像其他菌根菌一樣，紅汁乳菇目前尚不能人工栽培，在自然條件下產(chǎn)量較低，難以形成大批量生產(chǎn)，市場供應(yīng)依賴于野外采集，在湖南、廣西一帶市場價格可達(dá)120元/kg～180元/kg。由于大量采集，加之自然生態(tài)條件惡化，野生紅汁乳菇數(shù)量日益減少，價格增長，繼而導(dǎo)致人們掠奪式的采收。譚著明等[9]通過人工合成菌根，實(shí)現(xiàn)了紅汁乳菇的半人工栽培，可以提高紅汁乳菇的產(chǎn)量，但是仍需要依賴適宜的自然條件才能起到增產(chǎn)效果。因此，為合理開發(fā)紅汁乳菇的資源并滿足市場需求，必須研究其適宜生長的條件，優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基配方，為人工培養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

紅汁乳菇菌種由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院莫美華教授提供，菌種采自廣西桂林，分離保存。

1.1.2 試驗(yàn)藥品

酵母膏、蛋白胨，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、蔗糖、葡萄糖、硫酸銨，廣州化學(xué)試劑廠，分析純；石膏、石灰、玉米粉、棉籽殼、麩皮、豆粕粉，市售。

1.1.3 培養(yǎng)基的配方

完全培養(yǎng)基：蛋白胨2.0 g、酵母膏2.0 g，葡萄糖20 g、瓊脂20 g，磷酸氫二鉀1.00 g、硫酸鎂0.50 g、磷酸二氫鉀0.46 g，水1 000 mL，pH自然。

液體完全培養(yǎng)基：蛋白胨2.0 g、酵母膏2.0 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀1.00 g、硫酸鎂0.50 g、磷酸二氫鉀0.46 g，水1 000 mL，pH自然。

1.1.4 儀器與設(shè)備

手提式壓力蒸汽滅菌鍋YX-280，北京中西集團(tuán)；微波爐WG800SL23-K6，格蘭仕集團(tuán)；數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱101AS-3，東莞市吉之壟電子儀器廠；電磁爐MC-EP201，美的集團(tuán)；生化培養(yǎng)箱LRH-250-Ⅱ，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；電子天平PL602-S，上海滬沁儀器設(shè)備有限公司；超凈工作臺SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；搖床HZQ-QG，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 均勻設(shè)計(jì)法

發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化采用均勻設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行[10]。通過前人的試驗(yàn)以及查找資料[11-12]發(fā)現(xiàn)，石膏、石灰、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、玉米粉、蔗糖、棉籽殼、蛋白胨、麩皮、豆粕粉在珍稀食用菌的菌絲培養(yǎng)中起著重要作用，因此選擇這10種物質(zhì)作為參試因子，水平因素見表1。將各因素的水平值按所在列的編號分別對號填入，均勻設(shè)計(jì)表見表2。

由表1、表2可知，以資料中10種參試因子的常用量作為中點(diǎn)，每一因子設(shè)計(jì)出12個水平，選用U12（1210）均勻設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)。

1.2.2 培養(yǎng)基制備

分別把石膏、石灰、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、玉米粉、蔗糖、棉籽殼、酵母膏、麩皮、豆粕粉水煮20 min，濾布過濾，將濾液濃縮成各個水平所需濃度，配制培養(yǎng)基。每個水平配500 mL，平均分裝于5個三角瓶中，設(shè)5個重復(fù)，每瓶裝液量為100 mL。裝液后瓶口塞上棉塞，外包牛皮紙，用高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30 min，冷卻，待用。

取活化好的紅汁乳菇菌種，用經(jīng)滅菌的打孔器打成1.0 cm圓片，分別將若干片菌絲塊打碎并接入三角瓶中，塞好棉塞，置于25℃、170 r·min-1的搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為10 d。培養(yǎng)期間，定期對菌絲生長情況進(jìn)行觀察記錄。

1.2.3 菌絲體生物量的測定

培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液分別裝于100 mL的離心管中，除去多余培養(yǎng)液，加入50 mL～80 mL無菌蒸餾水，6 000 r·min-1離心10 min，除去多余水分；加入無菌蒸餾水洗滌6次，直至粘附在菌絲上的液體培養(yǎng)基被清洗干凈，用吸水紙吸干水分，待表面沒有游離水時，測量菌絲體濕重。再將菌絲體轉(zhuǎn)移到干凈平皿中，并在平皿中墊1層保鮮膜，以便獲取干燥菌絲，50℃真空干燥至恒重，電子天平準(zhǔn)確稱重，計(jì)算各處理平均值；以此結(jié)果作為各處理的目標(biāo)函數(shù)，經(jīng)DPS v8.01軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

1.2.4 對比驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將理論最優(yōu)配方與均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)中的直觀最優(yōu)配方進(jìn)行對比驗(yàn)證試驗(yàn)；另外，也將理論最優(yōu)配方、直觀最優(yōu)配方和完全培養(yǎng)基進(jìn)行了對比驗(yàn)證試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 以干重為目標(biāo)函數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析

以干重為目標(biāo)函數(shù)（y）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得結(jié)果見表3。

表3 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Uniform design test results

如表3所示，建立以干重（y，g·100-1mL-1）為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程為：

式中：x2為蔗糖水平（g·100-1mL-1）；x3為棉籽殼水平（g·100-1mL-1）；x4為蛋白胨水平（g·100-1mL-1）；x5為麩皮水平（g·100-1mL-1）；x7為石膏水平（g·100-1mL-1）；x8為石灰水平（g·100-1mL-1）；x9為磷酸二氫鉀水平（g·100-1mL-1）；x10為磷酸氫二鉀水平（g·100-1mL-1）。

對回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，最終得出相關(guān)系數(shù)R=0.999 9，F(xiàn)值=2 720.871 1，顯著水平P=0.000 4，剩余標(biāo)準(zhǔn)差SSE=0.004 0?；貧w方程顯著水平P=0.000 4＜0.010 0，即能達(dá)到0.01的極顯著水平，調(diào)整后Ra=0.999 8，說明方程的可信度較好。

2.1.2 回歸項(xiàng)的回歸系數(shù)的t檢驗(yàn)結(jié)果

各項(xiàng)試驗(yàn)因子回歸系數(shù)和t檢驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 各項(xiàng)回歸項(xiàng)的回歸系數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Test results of regression coefficient of each regression term

由表4可知，方程中各回歸項(xiàng)的顯著水平均小于0.01，這說明方程中引入的各項(xiàng)對菌絲體干重均有很大影響，全部達(dá)到極顯著水平。

2.1.3 觀察值和擬合值

回歸方程的觀測值與擬合值見表5。

表5 樣本的觀察值、擬合值和擬合誤差Tab.5 Observation value,fitting value and fitting error of samples

由表5可知，觀測值與擬合值很相近，最大擬合誤差絕對值為0.003 0，進(jìn)一步說明了回歸方程的準(zhǔn)確性。通過數(shù)學(xué)模擬分析，找出一個理論最優(yōu)的紅汁乳菇菌絲培養(yǎng)基配方（1 L）為：玉米10.91 g、蔗糖3.65 g、棉籽殼 41.24g、蛋白胨0.01 g、麩皮26.22 g、豆粕粉4.35 g、石膏1.25 g、石灰0.13 g。

2.2 優(yōu)化配方驗(yàn)證試驗(yàn)

由上述的均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果表3可以看出干重較大的直觀最優(yōu)配方是配方12，將理論最優(yōu)配方、直觀最優(yōu)配方12與完全培養(yǎng)基進(jìn)行對比驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)方案如表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)方案Tab.6 Verification test scheme

如表6所示，培養(yǎng)基均加水1 000 mL，pH自然。接種量統(tǒng)一為1片直徑為1.0 cm的紅汁乳菇菌絲塊，發(fā)酵周期10 d，重復(fù)3次，比較不同培養(yǎng)基配方對紅汁乳菇菌絲生物量的影響。完全培養(yǎng)基配方為：蛋白胨2 g、酵母膏2 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，磷酸氫二鉀1.00 g、硫酸鎂0.50 g、磷酸二氫鉀0.46 g。

2.3 優(yōu)化配方驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

對比驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表7。

如表7所示，分別得出理論最優(yōu)配方組、直觀最優(yōu)配方12組和完全培養(yǎng)基組的干重、濕重。利用Duncan新復(fù)極差檢驗(yàn)可看出理論最優(yōu)配方平均濕重和干重均顯著高于配方12和完全培養(yǎng)基的濕重和干重（P＜0.05），這說明所篩選的最優(yōu)配方更適合紅汁乳菇菌絲生長。

表7 優(yōu)化配方驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Validation test results of optimized formula

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果紅汁乳菇液體培養(yǎng)情況見圖1、圖2。

由圖1可知，利用優(yōu)化配方發(fā)酵的菌球大、數(shù)量多、產(chǎn)量高，且形成了紅色小菇蕾；配方12發(fā)酵的菌球數(shù)量較少，也有少量紅色菇蕾形成；完全培養(yǎng)基發(fā)酵的菌球較小，顏色較白，未形成紅色小菇蕾。由圖2可知，利用該優(yōu)化配方發(fā)酵紅汁乳菇菌絲還出現(xiàn)了小菇蕾，這對尚不能實(shí)現(xiàn)人工栽培的菌根菌紅汁乳菇的進(jìn)一步馴化栽培具有一定指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論與討論

通過均勻設(shè)計(jì)法篩選出最佳紅汁乳菇液體培養(yǎng)基優(yōu)化配方，即1 L培養(yǎng)基中各成分用量為：玉米10.91 g、蔗糖3.65 g、棉籽殼 41.24 g、蛋白胨0.01 g、麩皮26.22 g、豆粕粉4.35 g、石膏1.25 g、石灰0.13 g。利用該優(yōu)化配方配制的培養(yǎng)基，在25℃、170 r·min-1下發(fā)酵紅汁乳菇菌絲10 d可得菌絲平均干重 17.89 g·L-1，平均濕重 83.12 g·L-1，顯著高于完全培養(yǎng)基和直觀優(yōu)化配方12。這一結(jié)果遠(yuǎn)高于前人的研究[13-17]。在發(fā)酵液中出現(xiàn)了小菇蕾，這對于菌根菌紅汁乳菇的馴化栽培具有一定指導(dǎo)意義。