王志仙，朱宏波，張普，馮春濤，藺惠良，劉玉，李樹靜，余文莉

（1.石家莊天泉良種奶牛有限公司，石家莊 050200；2.北京安伯胚胎生物技術(shù)有限公司，北京 100089；3.河北天和肉牛養(yǎng)殖有限公司，石家莊 050200）

在牛胚胎生產(chǎn)中，通過經(jīng)陰道超聲穿刺吸取卵泡中的卵細(xì)胞（Ovum Pick-Up：OPU）的技術(shù)，完全與體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)相關(guān)聯(lián)，已成為有競(jìng)爭(zhēng)力的、可替代超數(shù)排卵的一項(xiàng)技術(shù)（IVEP）[1]。據(jù)國(guó)際胚胎移植協(xié)會(huì)2016年的統(tǒng)計(jì)，2016年全球共生產(chǎn)OPU-IVP胚胎666 215枚，超過體內(nèi)胚胎632 638枚的生產(chǎn)數(shù)量，占2016年牛胚胎生產(chǎn)總量的51.29%，比2015年OPU胚胎生產(chǎn)提高了8.73%；鮮胚及凍胚移植總量達(dá)448 113枚，占2016年移植胚胎總量的46.45%。

隨著基因組選擇技術(shù)在牛上的迅速發(fā)展，人們?cè)絹碓接信d趣使用OPU-IVP技術(shù)來增加每個(gè)供體的胚胎數(shù)和后代數(shù)，從而增強(qiáng)下一代的選擇強(qiáng)度?；蚪M選擇將DNA標(biāo)記技術(shù)和基因組學(xué)整合到傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)體系中，使經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳進(jìn)展速度提高了一倍，縮短了世代間隔，提高了選擇準(zhǔn)確性[2]。

自O(shè)PU-IVP技術(shù)興起以來，如何優(yōu)化體外胚胎生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，提高OPU胚胎的生產(chǎn)效率，一直是眾多研究的重點(diǎn)。本研究的目的是通過對(duì)OPU來源的卵母細(xì)胞使用不同系列的培養(yǎng)液培養(yǎng)、不同精子處理方法、不同脫顆粒細(xì)胞方法，比較其體外受精卵裂率和體外培養(yǎng)桑囊率，以從胚胎生產(chǎn)效率和操作簡(jiǎn)便程度兩方面綜合考慮，確定適合的培養(yǎng)液系統(tǒng)和操作方法，為進(jìn)一步建立完善、高效的OPU胚胎生產(chǎn)體系提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器及設(shè)備

活體采卵操作系統(tǒng)（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；采卵針（MISAWA）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo 3131、Thermo 371，Thermo公司）；恒溫臺(tái)（HP-4530，HOTPLATE）；臺(tái)式離心機(jī)（L-550,湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；生物顯微鏡（OLYMPUS SZ-STS）；移液槍（Eppendorf）；35mm培養(yǎng)皿（FALCON公司）；15mL、50mL離心管（Corning公司）；0.22μm濾器（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 培養(yǎng)液系統(tǒng)

1.2.1 成品液

從美國(guó)MOFA公司購(gòu)買的OPU全流程溶液（表1）。

表1 美國(guó)MOFA公司OPU胚胎生產(chǎn)系列溶液

1.2.2 自配液系統(tǒng)

本試驗(yàn)所用TCM 199購(gòu)自Gibco、胎牛血清購(gòu)自賽默飛，其他試劑均購(gòu)自Sigma。采卵液：0.22mg/mL丙酮酸鈉，3.58mg/mL Hepes-鈉，0.1mol/mL TCM199（10X），0.1461mg/mL L-谷氨酰胺，0.168mg/mL NaHCO3，0.01mg/mL肝素，0.060mg/mL青霉素，0.130mg/mL鏈霉素。卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液：以TCM199(1x)為基液，加入10%FBS，0.01IU/mL FSH，0.01IU/mL LH，1μg/mL 雌二醇，50μg/mL肝素，100ng/mL IGF，50ng/mL EGF，雙抗各100IU/mL。洗精液：以BO液為基液，加入10mmol/L咖啡因。受精液：以BO液為基液，加入20mg/mL BSA，20μg/mL肝素，雙抗各100IU/mL。胚胎體外培養(yǎng)液：以mCR1aa為基液，加入6mg/mL BSA，20μL/mL EAA(50X)，10μL/mL Non-EAA(100X)，1.5mg/mL谷氨酰胺。

1.3 活體采卵

用石家莊天泉良種奶牛有限公司飼養(yǎng)的空懷或妊娠3個(gè)月以內(nèi)的泌乳牛，在非超排情況下或經(jīng)CIDR-FSH程序處理后40h，用深圳邁瑞B(yǎng)超儀（DP-50Vet）和B超探頭（65C15EA）安裝17G×600mm長(zhǎng)針（MISAWA，日本）或18G短針（DI-0207-10，WTA，巴西），通過陰道穿刺采集OPU卵子。

1.4 體外培養(yǎng)

1.4.1 卵子體外成熟培養(yǎng)

取35mm培養(yǎng)皿，用完全成熟液做20μL的液滴，做6滴，覆蓋3.5mL礦物油；之后，在每個(gè)20μL液滴中再加入30μL完全成熟液，做成50μL培養(yǎng)液滴。將培養(yǎng)盤放入38.5℃、5% CO2培養(yǎng)箱平衡3～5h。將用洗卵液洗好的COCs放入微滴中于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24h。

1.4.2 精子處理方法

精子梯度離心法： 配制90% PS和45% PS的精液梯度離心液，進(jìn)行梯度離心。第一次離心：700g、15min，去除上清液，留下一團(tuán)約100μL的沉淀物，加900μL平衡好的受精液，將其混勻；第二次離心：300g、5min，去除上清液，留下一團(tuán)約50μL的沉淀物。

精子非梯度離心法：在15mL離心管中加6mL洗精液及解凍后精子，進(jìn)行兩次離心：600g、6min。兩次離心之間吸出上清液并補(bǔ)加相同體積洗精液，兩次離心后輕輕吸出全部上清液，留下一團(tuán)約50μL的沉淀物。

上述兩種方法都要使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行精子計(jì)數(shù)。調(diào)節(jié)離心后精子濃度。

1.4.3 體外受精培養(yǎng)

成品液體外受精培養(yǎng)：取35mm培養(yǎng)皿，用完全受精液做50μL的液滴，做6滴，覆蓋3.5mL礦物油；之后，在每個(gè)50μL液滴中再加入48μL完全受精液，做成98μL培養(yǎng)液滴。將培養(yǎng)盤放入38.5℃、5% CO2培養(yǎng)箱平衡3～5h。把用受精液洗好的成熟卵子放入微滴中，加2μL的精子懸液到每個(gè)受精滴中，使精子最終濃度為1×106/mL。將受精盤放回CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～22h。

自配液體外受精培養(yǎng)：取35mm培養(yǎng)皿，用完全發(fā)育培養(yǎng)液做50μL的液滴，做6滴，覆蓋3.5mL礦物油，將培養(yǎng)盤放入38.5℃、5% CO2培養(yǎng)箱中平衡3～5h。把用受精液洗好的成熟卵子放入微滴中，加50μL的精子懸液到每個(gè)受精滴中，使精子最終濃度為1×106/mL。將受精盤放回CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～16h。

1.4.4 脫顆粒方法

機(jī)械洗滌法：準(zhǔn)備4個(gè)35mm培養(yǎng)皿，其中均充入2/3平衡好的剝卵液，分別標(biāo)注0、1、2、3；將假定的受精卵放入35mm培養(yǎng)皿中，用100μL移液槍輕輕吹打，直至卵丘細(xì)胞剝脫，然后依次在1、2、3號(hào)培養(yǎng)皿中洗卵。

渦流器震動(dòng)法：把預(yù)溫到38.5℃的BoviPRO 體外培養(yǎng)洗液點(diǎn)滴到培養(yǎng)皿里；將合子依次在 BoviPRO 體外培養(yǎng)洗液滴中轉(zhuǎn)移洗滌之后放入40μL的體外培養(yǎng)洗液的1.5mL的離心瓶中；把離心瓶置渦流器上渦流2min；往離心瓶中加入500L體外培養(yǎng)洗液沖洗瓶壁，保證合子得到全部收復(fù)。

1.4.5 體外發(fā)育培養(yǎng)

將用完全發(fā)育培養(yǎng)液洗好的假定受精卵放入微滴培養(yǎng)盤，在38.5℃，5% O2、5% CO2、90% N2三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，在第3天時(shí)快速統(tǒng)計(jì)卵裂率，第7天統(tǒng)計(jì)桑囊率。以上各步驟的微滴培養(yǎng)中，每滴里卵子或受精卵不超過10枚。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，百分?jǐn)?shù)比較時(shí)經(jīng)反正旋轉(zhuǎn)化后采用方差分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。每頭牛為一個(gè)重復(fù)處理，培養(yǎng)COCs數(shù)小于5枚的在統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中剔除。

2 結(jié)果與討論

2.1 美國(guó)進(jìn)口OPU成品液與自配溶液的OPU胚胎生產(chǎn)效率比較

表2 美國(guó)進(jìn)口OPU成品液與自配溶液的OPU胚胎生產(chǎn)效率比較

本試驗(yàn)成品液組從活體采卵到OPU胚胎體外培養(yǎng)全過程全部使用美國(guó)MOFA公司OPU胚胎生產(chǎn)系列溶液，自配液組在OPU胚胎生產(chǎn)各環(huán)節(jié)中所用的溶液全部用Sigma制劑自行配制。兩組IVC培養(yǎng)均在38.5℃，5% O2、5% CO2、90% N2三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行。如表2所示，成品培養(yǎng)液與自配液的卵裂率和桑囊率之間無顯著差異（P＞0.05）。雖然在實(shí)際操作中采用成品液能簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，提高穩(wěn)定性，但自配液可以大大降低生產(chǎn)成本。同時(shí)，基于建立自主研發(fā)培養(yǎng)體系的目標(biāo)，很有必要進(jìn)一步對(duì)自配液的成分進(jìn)行篩選優(yōu)化。

2.2 不同精子處理方法的OPU胚胎生產(chǎn)效率比較

表3 不同精子離心方法的OPU胚胎生產(chǎn)效率比較

本試驗(yàn)兩組全部采用自配溶液，在38.5℃，5% O2、5% CO2、90% N2三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行。如表3所示，兩種精子處理方法獲得的精子懸液對(duì)OPU卵子的受精能力無顯著差異（P＞0.05）。梯度離心法是規(guī)范的操作方法，離心效果穩(wěn)定。在實(shí)際操作中非梯度離心法更簡(jiǎn)便易行，成本較低，但需要操作快速、準(zhǔn)確，以免活精子與死精子再度發(fā)生混合。

2.3 不同脫顆粒細(xì)胞方法的OPU胚胎生產(chǎn)效率比較

表4 不同脫顆粒細(xì)胞方法的OPU胚胎生產(chǎn)效率比較

本試驗(yàn)兩組全部采用成品液，在38.5℃，5% O2、5% CO2、90% N2三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行。如表4所示，兩種脫顆粒細(xì)胞方法的合子回收率、卵裂率、桑囊率均無顯著差異（P＞0.05）。渦流器震動(dòng)法相對(duì)更快、更容易脫凈顆粒細(xì)胞，但需要掌握適合的震動(dòng)力度和時(shí)間、液體容量等參數(shù)，否則容易損傷和丟失卵子。機(jī)械法操作比較簡(jiǎn)單，但有時(shí)顆粒細(xì)胞不易吹打干凈，需要稍長(zhǎng)時(shí)間。試驗(yàn)顯示，在技術(shù)嫻熟的情況下，兩種方法都可獲得較好的效果。當(dāng)卵子達(dá)15枚以上時(shí)選擇渦流器震動(dòng)法脫顆粒細(xì)胞效率更高。

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中不同的培養(yǎng)液、不同的精子處理方法以及不同的脫顆粒細(xì)胞方法進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明，進(jìn)口成品培養(yǎng)液的桑囊率高于自配溶液（36.78% vs 24.10%），但差異不顯著，不同的精子離心方法和扒卵方法也沒有顯著差異。在實(shí)際操作中采用成品液能簡(jiǎn)化操作，提高穩(wěn)定性和效率。自配液不僅可以大大降低生產(chǎn)成本，而且可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境對(duì)自配液的成分進(jìn)行篩選優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)建立自主研發(fā)培養(yǎng)體系的目標(biāo)。

牛的精子離心大多采用兩次離心法[3]。因?yàn)閮鼍蝓r精中含有許多可能阻礙受精的物質(zhì)，如保護(hù)劑、精清、稀釋液、死精及一定量的細(xì)菌等，對(duì)精子進(jìn)行洗滌有助于篩選出高活力的精子及減少細(xì)菌污染的可能性。采用90%和45% Percoll 兩種濃度形成梯度，可有效地去除精液中的白細(xì)胞、生精細(xì)胞、死精子、畸形精子等成分，能提取到高活力精子，明顯提高精子前向運(yùn)動(dòng)率[4]。但也有研究報(bào)道，離心對(duì)精子DNA 完整性的改變并不是單向的，甚至有部分參數(shù)比處理前更差[5]，離心過程容易對(duì)精子產(chǎn)生損傷，離心時(shí)間越長(zhǎng)精子活力越低[6]，離心過程中額外產(chǎn)生的氧化活性物質(zhì)，包括超氧陰離子、過氧化氫、氫氧基、過氧羥自由基等可引起DNA的損傷[7]。本試驗(yàn)采用不同的方法對(duì)精子進(jìn)行處理，結(jié)果表明沒有顯著差異。梯度離心法是規(guī)范的操作方法，離心效果穩(wěn)定。非梯度離心操作更加簡(jiǎn)單，選擇適當(dāng)?shù)碾x心力不僅能富集精子提高精子活力，還能得到更多DNA完整的精子，保證良好的受精效果。

卵子受精前顆粒細(xì)胞通過自分泌和旁分泌影響牛體外受精效果，在體外受精前，成熟卵母細(xì)胞部分脫除卵丘細(xì)胞組，體外受精胚胎卵裂率顯著高于不脫除卵丘細(xì)胞組[8]。據(jù)報(bào)道，體外受精后不同顆粒細(xì)胞脫除方法對(duì)胚胎發(fā)育也有一定影響，采用振蕩法脫除顆粒細(xì)胞的卵裂率和囊胚率均高于機(jī)械法[9]。采取人工機(jī)械吹打脫除卵丘細(xì)胞，操作耗時(shí)長(zhǎng)且效率較低，卵母細(xì)胞過長(zhǎng)時(shí)處于外界環(huán)境容易造成卵母細(xì)胞死亡或影響后期發(fā)育。本試驗(yàn)中兩種方法的卵裂率和桑囊率差異均不顯著。而且采用振蕩法脫顆粒需要將胚胎放入離心管中利用渦流器震動(dòng)脫除顆粒細(xì)胞，存在胚胎丟失風(fēng)險(xiǎn)。但在技術(shù)嫻熟的情況下，兩種方法都可獲得較好的效果。