于志成 劉步青 許 宙 陳茂龍 焦 葉崔 波 鄒飛雪 藏慶佳 程云輝,

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院1,長沙 410114)(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)食品科學(xué)與工程學(xué)院；生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室2, 濟南 250353)(煙臺雙塔食品股份有限公司3,煙臺 265404)

醬油發(fā)酵后經(jīng)壓榨或抽油產(chǎn)生的剩余殘渣即為醬油渣[1]。據(jù)中國調(diào)味品協(xié)會統(tǒng)計，2017 年我國醬油生產(chǎn)總量已達(dá)860萬 t[2]，按照每生產(chǎn)1 t醬油產(chǎn)生0.67 t醬油渣計算[3]，醬油渣年產(chǎn)量可達(dá)580萬 t。醬油渣中含有粗蛋白、碳水化合物和粗脂肪等營養(yǎng)成分[4,5]，不失為一種廉價的生物資源，特別是其中的大豆分離蛋白營養(yǎng)價值高、氨基酸含量豐富，被譽為“植物肉”[6]。目前醬油渣再利用的主要途徑是生產(chǎn)飼料[7]，但存在含鹽量較高、適口性較差及不易貯存等缺點[8]，在一定程度上限制了醬油渣的應(yīng)用價值。利用合適的水解酶從醬油渣蛋白中制備免疫活性肽，可使醬油渣資源得到更高值化利用[9]。

免疫活性肽是指對機體免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用的一類生物活性肽，其免疫調(diào)節(jié)作用包括免疫促進(jìn)和免疫抑制[10,11]。免疫活性肽雖本身不具有免疫原性，但能通過被腸道吸收或在腸道與受體結(jié)合而發(fā)揮免疫作用[12]。近年來，人們對食源性蛋白中免疫活性肽的研究日益增多，食物蛋白來源包括牛奶、魚類、貝類、大米、大豆等[13]。國內(nèi)外制備活性肽的方法主要有酶解法[14]、化學(xué)合成法[15]、基因重組法[16]及微生物發(fā)酵[17]等，其中使用商業(yè)蛋白酶進(jìn)行體外水解是最常用的方法，肽鍵的裂解能夠釋放具有免疫調(diào)節(jié)活性的肽段。由于酶的不同切割特異性，選擇合適的蛋白水解酶成為關(guān)鍵技術(shù)因素。評價蛋白水解產(chǎn)物免疫調(diào)節(jié)作用的常用研究方法包括細(xì)胞實驗和動物喂養(yǎng)實驗[13]。由于巨噬細(xì)胞是體液免疫的重要防線，所以巨噬細(xì)胞增殖能力的強弱與體液免疫能力有著重要關(guān)系[18]，采用MTT法檢測巨噬細(xì)胞活性已被較廣泛運用于評價生物活性肽的免疫調(diào)節(jié)作用。同時，由一氧化氮合酶催化L-精氨酸產(chǎn)生的NO，能作為一種重要的細(xì)胞分泌物在炎癥和休克等生理過程中擔(dān)任信號分子的作用，通?？捎肗O的釋放量來衡量巨噬細(xì)胞中的炎癥作用[19]。

因此，本研究以小鼠巨噬細(xì)胞增殖實驗的SI值和脂多糖炎癥模型細(xì)胞內(nèi)NO釋放量作為免疫活性肽的篩選指標(biāo)，擬利用Acalase、Papain、Pepsin、Trypsin與Protamex 5種蛋白酶對醬油渣蛋白進(jìn)行酶解，進(jìn)而對5種酶解物的免疫活性、多肽含量、可溶性氮回收率和相對分子質(zhì)量進(jìn)行分析，篩選出最佳的醬油渣免疫活性肽水解用酶，為醬油渣資源高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油渣、小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)、石油醚、Folin酚、L-酪氨酸；Acalase、Papain、Pepsin、Trypsin及Protamex；D201-C大孔吸附樹脂。

1.2 儀器與設(shè)備

FE28 pH計，JJ-T電動攪拌器，TDL-5-A離心機，SHZ-D循環(huán)水式真空泵，EV 311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，F(xiàn)D-1真空冷凍干燥機，HH CP-01二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，MLS-3750滅菌鍋，SW-OJ-1FD超凈工作臺， 96孔培養(yǎng)板；血球計數(shù)板，DNM-9602酶標(biāo)分析儀。

1.3 方法

1.3.1 醬油渣蛋白粉的制備方法[20]

1 kg脫脂醬渣粉溶于10 L蒸餾水中，用2 mol/L氫氧化鈉調(diào)溶液pH至10→攪拌2 h→離心(3 500r/min,30 min)→取上清→用2 mol/L鹽酸滴定至pH 4.0→離心(3 500 r/min,10 min)→水洗3次(3 500 r/min,10 min)→取沉淀→冷凍干燥。

1.3.2 醬油渣蛋白酶解物制備方法[20]

5種蛋白酶的酶解條件見表1。5%醬渣蛋白懸浮液→50 ℃恒溫溶解30 min→調(diào)至各酶最適溫度→調(diào)至各酶最適pH→加酶酶解3 h(6 000 U/g)→滅酶(15 min，90 ℃)→離心取上清→真空濃縮→大孔吸附樹脂脫鹽→冷凍干燥。

表1 5種蛋白酶的酶解條件

1.4 分析方法

1.4.1 基本成分分析方法

水分含量的測定參考GB/T 5009.3—2016中的直接干燥法；蛋白含量的測定參考GB/T 5009.5—2010中的凱氏定氮法；脂肪含量的測定參考GB/T 5009.6—2016中的索氏提取法；總糖含量的測定用苯酚硫酸法[21]；鹽分的測定參考GB 5009.44—2016中的電位滴定法。

1.4.2 蛋白酶活力的測定方法

參考GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》。

1.4.3 多肽含量的測定方法

參考GB/T 22492—2008《大豆肽粉》[22]。

1.4.4 相對分子量測定方法

相對分子量采用液相色譜[23]法測定：

1)色譜條件：色譜柱為TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm。流動相使用水/乙腈/三氟乙酸，90/10/0.1；經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后再經(jīng)超聲進(jìn)行脫氣。洗脫流速0.5 mL/min，檢測波長220 nm，柱溫30 ℃，上樣量10 μL。

2)樣品的制備：用流動相將樣品配成濃度為1 mg/mL的樣液，超聲混勻，用微孔濾膜過濾后待測。

3)分子量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品：甘氨酸-酪氨酸(MW239.2)；纈氨酸-酪氨酸-纈氨酸(MW379.5)；蛋氨酸腦啡肽(MW573.23)；亮氨酸腦啡肽(MW555.63-569.65)；血管緊張素Ⅱ(MW1 269)；細(xì)胞色素C(MW12 900)。

1.4.5 小鼠巨噬細(xì)胞增殖實驗方法

MTT法測定小鼠巨噬細(xì)胞的增殖活性。用移液槍取對數(shù)期的小鼠巨噬細(xì)胞，細(xì)胞濃度7×105個/mL、每孔100 μL接種于96孔板中，在5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫孵育4 h后，以6復(fù)孔為一組，每孔加入醬油渣蛋白酶解物20 μL(6.25 μg/mL)，空白對照組加無菌水20 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中恒溫孵育20 h；在終止孵育前4 h加入20 μL MTT(5 mg/L)；棄去每孔中的液體，向每孔中加入150 μL二甲基亞砜，避光條件下?lián)u床中輕振10 min[24]，490 nm下酶標(biāo)儀測吸光度(OD值)，SI值計算公式：

1.4.6 酶解物對脂多糖炎癥模型細(xì)胞內(nèi)NO釋放的影響

當(dāng)培養(yǎng)皿中的小鼠巨噬細(xì)胞生長至對數(shù)期時，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基上清，用移液槍吸取2 mL培養(yǎng)基將細(xì)胞輕輕吹下，12 000轉(zhuǎn)離心收集細(xì)胞，96孔培養(yǎng)板中接種3×104個/孔的細(xì)胞，每孔200 μL細(xì)胞液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，以6復(fù)孔為一組，分為陰性對照組、LPS炎癥模型組、陽性對照組和醬油渣蛋白酶解物預(yù)處理組[25]：

1) 陰性對照組：加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基；

2) 炎癥模型組：加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h，再加入用DMEM培養(yǎng)基稀釋的LPS溶液20 μL，培養(yǎng)24 h；

3) 陽性對照組：加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h，再加入用無菌水稀釋的IgG 20 μL，培養(yǎng)24 h；

4) 樣品預(yù)處理組：加入無菌水溶解的樣品溶液，使樣品的終濃度為6.25 μg/mL，培養(yǎng)12 h，加入用DΜEM培養(yǎng)基稀釋的LPS溶液，培養(yǎng)24 h。

收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，于4 ℃、12 000 轉(zhuǎn)低溫離心5 min以去除細(xì)胞雜質(zhì)等。根據(jù)GRIESS法測定上清液中NO含量。NO抑制率公式：

NO抑制率=

1.5 可溶性氮回收率的測定方法

采用福林酚法測定上清液蛋白質(zhì)含量[26]：使用0.05 mol/L (pH8.0) NaHPO4-NaH2PO4緩沖液將上清液稀釋一定倍數(shù)至測定范圍，取2.5 mL稀釋樣品于10 mL玻璃試管，加入2.5 mL堿性銅試劑，振蕩混勻，室溫放置10 min，再加入0.25 mLFolin-酚試劑，立即振蕩混勻，室溫放置30 min后于500 nm下測定吸光度。配制0～0.5 mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算上清液蛋白質(zhì)含量。

上清液蛋白質(zhì)量(g)=上清液蛋白含量×上清液體積

醬油渣蛋白質(zhì)量(g)=醬油渣蛋白含量×醬油渣質(zhì)量

醬油渣蛋白可溶性氮回收率=

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗均設(shè)置3次平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。實驗數(shù)據(jù)采用excel進(jìn)行分析，每組間差異用Student’s t-test平均值的成對二樣本進(jìn)行分析，P<0.01表示有極顯著性差異，P<0.05表示有顯著性差異，P>0.05表示沒有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 醬油渣和醬油渣蛋白基本成分分析

對醬油渣原料干基及所提取的醬油渣蛋白的主要成分進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。脫脂后提取的醬油渣蛋白脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)降為1.23%；鹽分和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降為0.91%和2.42%；而總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從10.31%提高至37.52%，張興茂[20]通過Sevag試劑法來驗證糖蛋白，推測醬油渣蛋白中含有大量的糖蛋白，據(jù)此可認(rèn)為醬油渣蛋白中總糖含量的提高與提取過程中糖蛋白的富集有關(guān)。

表2 原料醬油渣(干基)及醬油渣蛋白的主要化學(xué)成分

2.2 不同蛋白酶酶解物可溶性氮回收率的比較

2.2.1 蛋白酶選擇及酶活測定

目前蛋白酶主要來源于動物、植物和微生物，Pepsin和Trypsin是動物來源的蛋白酶，Pepsin的酶切位點是Phe和Leu等疏水性氨基酸，Trypsin的酶切位點為賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)等堿性氨基酸[27]；Papain是一種植物來源的蛋白酶，其酶切位點是Arg、Lys、Phe，其中Arg和Lys是堿性氨基酸，而Phe是疏水性氨基酸[27]；Protamex和Acalase是微生物來源的蛋白酶，復(fù)合蛋白酶兼具內(nèi)、外切酶的活性，能較徹底地酶解蛋白質(zhì)，Acalase的酶切位點是Ala、Leu、Val等疏水性氨基酸，酶切位點廣泛，水解效果好[28]。本研究擬在同等酶活下考察5種酶的酶解產(chǎn)物在免疫活性、分子量分布及可溶性氮回收率方面的差異，因此參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》測定了所選定5種蛋白酶的酶活，結(jié)果如表4所示。由表3可知，Acalase酶活最高，可達(dá)276 229.6 U/g。

表3 實驗所用5種蛋白酶的酶活

2.2.2 不同蛋白酶酶解物可溶性氮回收率的分析

注：*與對照組相比，P<0.05；**與對照組相比，P<0.01。圖1 5種蛋白酶酶解物可溶性氮回收率的比較

本研究比較了5 種醬油渣蛋白酶酶解物的可溶性氮回收率，結(jié)果如圖1所示。5種蛋白酶酶解物中Protamex酶解物可溶性氮回收率最低，與Protamex酶解物(對照組)可溶性氮回收率相比，Papain酶解物差異不顯著，Pepsin酶解物差異顯著(P<0.05)，Acalase和Trypsin酶解物差異極顯著(P<0.01)，且Acalase酶解物可溶性氮回收率最高為89.43%。在工業(yè)化生產(chǎn)中，提高酶解物的可溶性氮回收率，具有降低生產(chǎn)成本、提高原料利用效率等優(yōu)點。

2.3 醬油渣蛋白不同蛋白酶酶解物的多肽含量分析

對醬油渣蛋白不同蛋白酶酶解物的多肽含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。5種蛋白酶酶解物中多肽含量最高的是堿性蛋白酶酶解物，占比51.47%；而在可溶性氮回收率的測定結(jié)果中堿性蛋白酶酶解物的可溶性氮回收率也最高，二者結(jié)果一致。

表4 5種蛋白酶酶解物的多肽含量

2.4 不同蛋白酶酶解物的性質(zhì)研究

2.4.1 不同蛋白酶酶解物免疫活性研究

分別以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 MTT增殖實驗SI值和脂多糖(LPS)炎癥模型細(xì)胞內(nèi)NO釋放量作為考察指標(biāo)，考察了不同蛋白酶酶解物的免疫活性，結(jié)果如圖2和圖3所示。

注：*與對照相比，P<0.05；**與對照相比，P<0.01。圖2 5種蛋白酶解物對RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響

由圖2可知，除Acalase酶解物外，其他4種蛋白酶酶解物在濃度6.25 μg/mL時對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7皆具有顯著增殖作用(P<0.05)，但Trypsin和Protamex酶解物增殖作用高于陽性對照IgG，Pepsin和Papain酶解物增殖作用低于陽性對照IgG。Acalase酶解物在6.25 μg/mL時對RAW264.7細(xì)胞的增殖作用存在極顯著差異(P<0.01)，其SI值最高為1.09且比陽性對照IgG的增殖效果好。

注：##：與陰性對照組比有極顯著差異P<0.01；*：與炎癥模型組比有顯著差異P<0.05；**：與炎癥模型組比有極顯著差異P<0.01。圖3 5種蛋白酶解物對LPS內(nèi)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NO釋放量的影響

由圖3可知，在6.25 μg/mL的濃度下，不同酶解物對NO的抑制效果有顯著差異，這可能跟其酶切位點及特異性不同相關(guān)。與炎癥模型組相比，Pepsin酶解物、Trypsin酶解物和Protamex酶解物對細(xì)胞內(nèi)NO釋放量都存在一定抑制作用，但抑制率相對較低；Papain酶解物對細(xì)胞內(nèi)NO釋放量存在顯著(P<0.05)抑制作用，抑制率為7.81%；Acalase酶解物對細(xì)胞內(nèi)NO釋放量存在極顯著(P<0.01)抑制作用，抑制率為10.80%，Acalase酶解物對細(xì)胞內(nèi)NO釋放量的抑制作用最強。

MTT增殖實驗和脂多糖(LPS)炎癥模型實驗表明堿性蛋白酶酶解物對RAW264.7細(xì)胞增殖效果及細(xì)胞內(nèi)NO釋放抑制作用皆為最強。這可能跟Acalase 的酶切位點有關(guān)，有研究表明，多肽的免疫活性可能與其所含疏水性氨基酸的比例相關(guān)[29]。Acalase的酶切位點為Ala、Leu、Val，采用該酶水解食源性蛋白可能獲得更多富含疏水性氨基酸的酶解物。Lee等[30]采用堿性蛋白酶酶解短頸蛤蛋白，得到的肽序列Gln-Cys-Gln-Gln-Ala-Val-Gln-Ser-Ala-Val能在LPS刺激的RAW 264.7巨噬細(xì)胞中顯示出NO抑制活性，其中含有疏水性氨基酸。He等[31]從波紋巴非蛤肉蛋白堿性蛋白酶解物中得到的免疫活性肽Pro-His-Thr-Cys，Val-Gly-Try-Thr，Glu-Phe，Leu-Phe等能夠顯著增強小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力，其中疏水性氨基酸比例較高。

2.4.2 不同蛋白酶酶解物分子量分布的分析

采用液相色譜對不同蛋白酶酶解物的分子量分布進(jìn)行測定，結(jié)果如表5所示。5種蛋白酶酶解物的分子量分布范圍主要在2 000 u以下，免疫活性較好的Acalase和Papain酶解物中2 000 u以下的組分分別占98.21%、97.74%，其中分子量在180 u以下的比例分別為5.92%和6.13%，因此可推斷酶解物中游離氨基酸的含量較低；分子量分布在3 000 u以上的比例分別僅為0.11%和0.12%，說明酶解物中的大分子量肽段很少。肽的免疫活性與其分子量大小密切相關(guān)，大量研究結(jié)果表明小分子量肽段的免疫活性較好[13]。據(jù)此可推測5種蛋白酶酶解物中分子量范圍為180～1 000 u的肽段可能具有較強的免疫活性。Acalase酶解物和Papain酶解物中180～1 000 u的肽段比例較高，分別為81.33%和78.03%，這可能也是兩種酶解物具有較強免疫活性的原因之一。

表5 5種蛋白酶酶解物的分子量分布

3 結(jié)論

通過考察5種醬油渣蛋白酶酶解物對小鼠巨噬細(xì)胞增殖指數(shù)SI值、脂多糖(LPS)炎癥模型中細(xì)胞內(nèi)NO釋放量的抑制作用、相對分子量分布、多肽含量及可溶性氮回收率，本研究認(rèn)為Acalase是制備醬油渣免疫活性肽的最佳水解酶，其SI值、NO釋放量抑制率、分子量180～1 000 u的組分占比、多肽含量及可溶性氮回收率分別為1.09、10.80%、81.33%、51.47% 和89.43%。其酶解物不僅免疫活性較好，而且多肽含量和可溶性氮回收率較高，工業(yè)推廣方面應(yīng)用前景廣闊。