崔巖巖 梁 倩 向 東 潘永貴 黃午陽 張偉敏 楊 宏

(海南大學食品科學與工程學院1，?？?570228)(江蘇省農科院農產品加工研究所2，南京 210014)(華中農業(yè)大學食品科學技術學院3，武漢 430070)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)系唇形科迷迭香屬植物，多年生小灌木，原產于地中海沿岸，在我國貴州、廣西、云南、海南、湖南等地大面積引種栽培成功[1]。依據GB 1886.172—2016，迷迭香提取物是以迷迭香的莖、葉為原料，經溶劑(水、甲醇、乙醇、丙酮和/或正己烷)提取或超臨界二氧化碳萃取、精制等工藝生產的食品添加劑[2]，作為第三代食用天然抗氧化劑，其主要活性成分為鼠尾草酚、迷迭香酚、迷迭香酸、鼠尾草酸等二萜酚類物質和黃酮等其他高活性成分，并具有高效、安全、廣譜、耐熱、脂溶性好和抗氧化活性強等諸多優(yōu)點，而且不會對油炸食品帶來不良的風味和影響，其在高溫下的高抗異構化活性得到證實(強于茶多酚和TBHQ)[2-7]。鼠尾草酸(Carnosic acid, CA)是迷迭香抗氧化劑中含量最高、活性最強的抗氧化成分，也是目前發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定性較好的天然脂溶性自由基清除劑，并作為一種食品添加劑越來越被人們所接受[8]。鼠尾草酸的抗氧化性很強，能夠清除單線態(tài)氧、羥自由基和脂質過氧化氫自由基阻斷自由基鏈式反應，有效阻止脂質過氧化反應[9-11]，提高油脂氧化穩(wěn)定性的效果遠遠好于合成類抗氧化劑(PG、BHT、BHA，VE和α-生育酚)[12-16]，其抗氧化能力指數(shù)是BHT和VE的3倍，沸點最高達506.4 ℃，不易揮發(fā)[5，9，17]。

國內外學者對于TBHQ在常溫、高溫條件下的抗氧化效果的研究結果表明，TBHQ在常溫及高溫條件下的抗氧化性能優(yōu)于其他合成抗氧化劑[18-20]。因此選擇TBHQ作為的參照物，評價抗氧化活性強弱。課題組前期通過密度泛函理論計算表明，CA比目前報道的主要不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸、亞麻酸和DHA)C-H 解離焓低，表明CA比不飽和脂肪酸雙鍵優(yōu)先競爭脫氫作為反應底物與氧氣結合，從而防止不飽和脂肪酸的氧化，說明它在油脂中是一種十分有效的抗氧化劑，并可以考慮作為TBHQ的替代物。但類似應用中CA對油脂熱氧化效果的抑制作用并不清楚，特別是基于油酸甲酯體系探討鼠尾草酸對熱氧化和熱致異構化產物抑制作用報道不多。

本研究采用國標法等測定添加鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程(180 ℃)中主要理化特性指標(游離脂肪酸、酸價、過氧化值、茴香胺值和總氧化值)隨加熱時間變化的影響。運用電子自旋共振儀(ESR)跟蹤檢測添加鼠尾草酸前后油酸甲酯熱加工過程中自由基含量的變化；在主要理化特性測定的基礎上，通過HPLC對添加鼠尾草酸前后油酸甲酯熱加工過程中主要醛類羰基化合物含量進行檢測，探討鼠尾草酸對油酸甲酯熱氧化反應抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

油酸甲酯、鼠尾草酸：純度99%；特丁基對苯二酚(TBHQ)：純度98%。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

754NPC紫外可見分光光度計，HP6890/5975C氣相色譜儀，Agilent1100高效液相色譜儀，JES FA200電子自旋共振儀。

1.3 方法

1.3.1 油酸甲酯熱處理實驗

參照楊美艷[21]的方法，分別將油酸甲酯、添加0.02% TBHQ和0.02% CA的油酸甲酯樣品(200 mL)。加入電炸爐中在180 ℃下連續(xù)加熱12 h。加熱過程中分別在0、4、8 h和12 h取20 mL樣品，冷卻至室溫，倒入棕色樣品瓶中置于-18 ℃下避光保存。

1.3.2 理化指標測定

參照姬彥羽[2]的方法進行測定。

1.3.3 脂肪酸組成測定

參照姬彥羽[22]的方法進行測定。

1.3.4 自由基變化測定

參照姬彥羽[22]的方法進行測定。

1.3.5 揮發(fā)性醛類羰基化合物測定

參考張鈺斌[23]的方法進行測定。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)值以均值±標準偏差形式表示。采用Excel 2007、Origin 8.0及GraphPad Prism 5.0軟件對數(shù)據進行分析及作圖處理。采用SPSS 12.0軟件進行顯著差異性分析，圖表中不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中理化指標變化的影響

2.1.1 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中游離脂肪酸與酸價的影響

酸價是評價油脂中游離脂肪酸含量的重要指標。鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中FFA與AV的影響測定結果見圖1。由圖1可知，未經加熱處理的油酸甲酯的FFA和AV差異不顯著(P>0.05)，而從第4小時開始產生顯著性差異(P<0.05)。油酸甲酯的FFA和AV在整個加熱過程中呈上升趨勢，添加CA和TBHQ對油酸甲酯熱處理過程中的FFA和AV的產生具有顯著抑制作用(P<0.05)，而CA和TBHQ的作用效果差異不顯著(P>0.05)。此外還可以看出，添加CA對加熱后油酸甲酯酸值的升高有較好的抑制作用，實驗結果與于文秀等[24]關于不同抗氧化劑對調和油煎炸性能影響研究基本類似。這可能是因為隨著加熱時間的延長，油酸甲酯的水解反應逐步增強，產生的FFA逐漸增高，進而導致AV升高。

圖1 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中游離脂肪酸(FFA)與酸價(AV)變化的影響

2.1.2 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中過氧化值的影響

過氧化值(POV)是衡量油脂熱氧化過程初期產

物——過氧化物含量多少的關鍵指標。鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中過氧化值的影響測定結果見圖2。由圖2可以看出，未經加熱處理的油酸甲酯的POV差異不顯著(P>0.05)，同樣是在第4小時開始產生顯著性差異(P<0.05)。但油酸甲酯的POV在整個加熱過程中呈先上升后下降的趨勢，POV在第8小時達到最高。添加CA和TBHQ對油酸甲酯熱處理過程中的POV具有顯著抑制作用(P<0.05)，而CA和TBHQ的作用效果在8 h以內差異不顯著(P>0.05)，但在12 h則出現(xiàn)了顯著性差異(P<0.05)。這可能是CA通過降低過氧化物分解速率從而導致POV下降更為緩慢，即抑制過氧化物快速進入下一階段氧化反應，進而延緩了油脂的鏈式反應。研究認為由于氫過氧化物只是油脂熱氧化反應中的一個過程產物，氫過氧化物在加熱初期會因為熱氧化反應而大量產生從而導致POV急速升高，而氫過氧化物很不穩(wěn)定，又會隨著溫度升高或者加熱時間的延長發(fā)生熱分解反應而造成POV快速降低，實際上是油脂熱氧化過程中氫過氧化物生成速率和分解速率的綜合結果[6，22，25，26]。

圖2 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中過氧化值的影響

2.1.3 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中p-茴香胺值(PAV)的影響

由于氫過氧化物在油脂熱氧化反應中后期會發(fā)生熱分解反應形成醛(己醛和2-己烯醛等)、酮等小分子物質。因而隨著反應的持續(xù)進行，POV已不能反映油脂氧化的程度。而作為反映油脂熱氧化反應后期氧化程度的茴香胺值則可以作為直接反映油脂中醛類物質含量的主要指標之一。鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中PAV的影響見圖3。由圖3可知，鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中PAV的影響同樣是在第4小時開始產生顯著性差異(P<0.05)。但是PAV隨著加熱時間的延長一直呈上升趨勢，CA和TBHQ的作用效果差異不顯著(P>0.05)。這可能與本實驗設計的加熱時間過短有關，由于油酸甲酯相對比較穩(wěn)定，而醛類物質又是熱氧化反應后期產物。

圖3 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中p-茴香胺值的影響

2.1.4 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中總氧化值(TOTOX)的影響

TOTOX值因同時包含了一級氧化產物-氫過氧化物和二級氧化產物-不飽和醛類物質指標而常常被用于評估脂類氧化變質程度[27]。鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中TOTOX的測定結果見圖4。由圖4可知，未經加熱處理的油酸甲酯的TOTOX差異不顯著(P>0.05)，同樣是在第4小時差異顯著性(P<0.05)。但油酸甲酯的TOTOX在整個加熱過程中呈先上升后下降的趨勢，POV在第8小時達到最高。添加CA和TBHQ對油酸甲酯熱處理過程中的TOTOX具有顯著抑制作用(P<0.05)，而CA和TBHQ的作用效果在8 h以內差異不顯著(P>0.05)，但在12 h則出現(xiàn)了顯著性差異(P<0.05)，表明CA和TBHQ能夠顯著提高油酸甲酯的熱氧化穩(wěn)定性。

圖4 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中總氧化值的影響

2.2 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中醛類物質組成變化的影響

醛類羰基化合物是油脂在熱氧化過程中形成的二級氧化產物的主要成分之一[28]。油脂中醛類及其相關產物的種類及含量與油脂本身特點密切相關，尤其與脂肪酸組成關系密切[29]。油酸在發(fā)生氧化分解反應時，容易在雙鍵上的碳原子處(即C9、C10及因電子重排后的C8、C11)生成氫過氧鍵，從而生成油酸8-、9-、10-和11-COOH經β-均裂裂解后會產生辛烷、庚烷、1-辛醇、庚醇、辛酸、庚酸、1-癸烯、1-壬烯、辛醛、壬醛、癸醛、2-十一烯醛和2-癸烯醛等小分子物質[28-31]。其中主要醛類氧化產物為庚醛、辛醛、壬醛、癸烯醛及十一烯醛。因此主要對來源油酸的辛醛、壬醛、癸醛、反-2-癸烯醛、反-2-十一碳烯醛物質進行分析測定。

2.2.1 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中醛類羰基化合物總量變化的影響

加入抗氧化劑CA和TBHQ對油酸甲酯180 ℃加熱不同時間下5種揮發(fā)性醛類羰基化合物總量的影響結果見圖5。由圖5可知，油酸甲酯加熱過程中醛類羰基化合物總量隨加熱時間的增加而呈逐漸升高趨勢。這可能由于醛類物質是中后期氧化產物，而本實驗設計加熱處理條件溫度不是很高、時間不是很長、且油酸甲酯本身相對比較穩(wěn)定，所以醛類羰基化合物總量隨著加熱時間延長呈上升趨勢。加入抗氧化劑CA和TBHQ對醛類羰基化合物總量抑制效果明顯(P<0.05)，其中TBHQ對醛類物質抑制效果略好于CA(P<0.05)。

圖5 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中醛類羰基化合物總量的影響

2.2.2 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中辛醛變化的影響

加入抗氧化劑CA和TBHQ對油酸甲酯加熱過程中辛醛影響結果見圖6。由圖6可知，油酸甲酯和加入抗氧化劑的油酸甲酯中辛醛含量隨加熱時間的延長呈先增加后下降的趨勢，加熱至8 h最高，油酸甲酯(CK)、加入CA油酸甲酯(CA)和加入TBHQ油酸甲酯(TBHQ)中的辛醛含量分別為917.93、366.46、141.24 μg/g。隨后逐漸下降，這可能與辛醛的沸點(171 ℃)較低有關，在加熱后期，辛醛可能發(fā)生了揮發(fā)或者分解導致含量減少。加入抗氧化劑CA和TBHQ對辛醛羰基化合物形成抑制效果明顯(P<0.05)，其中TBHQ對辛醛抑制效果要略好于CA(P<0.05)。

圖6 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中辛醛的影響

2.2.3 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中壬醛變化的影響

加入抗氧化劑CA和TBHQ對油酸甲酯加熱過程中壬醛影響結果見圖7，由圖7可知，油酸甲酯和加入抗氧化劑的油酸甲酯中壬醛隨加熱時間的延長呈先增加后下降的趨勢，加熱至8 h最高，油酸甲酯(CK)、加入CA油酸甲酯(CA)和加入TBHQ油酸甲酯(TBHQ)中的壬醛含量分別為1 336.95、828.32、254.10 μg/g，隨后逐漸下降，這可能與壬醛的沸點(191 ℃)較低有關，在加熱后期，壬醛可能發(fā)生了揮發(fā)或者分解導致含量減少。加入抗氧化劑CA和TBHQ對壬醛羰基化合物總量抑制效果明顯(P<0.05)，其中TBHQ對壬醛抑制效果要略好于CA(P<0.05)。

圖7 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中壬醛的影響

2.2.4 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中癸醛變化的影響

加入抗氧化劑CA和TBHQ對油酸甲酯加熱過程中癸醛影響結果見圖8。由圖8可知，油酸甲酯和加入抗氧化劑的油酸甲酯中癸醛隨加熱時間的延長呈先增加后下降的趨勢，加熱至8 h最高，油酸甲酯(CK)、加入CA油酸甲酯(CA)和加入TBHQ油酸甲酯(TBHQ)中的癸醛含量分別為697.76、393.87、290.04 μg/g。隨后逐漸下降，這可能與癸醛的沸點(156 ℃)較低有關，在加熱后期，癸醛可能發(fā)生了揮發(fā)或者分解導致含量減少。加入抗氧化劑CA和TBHQ對癸醛羰基化合物總量抑制效果明顯(P<0.05)，其中TBHQ對癸醛抑制效果要略好于CA(P<0.05)。

圖8 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中癸醛的影響

2.2.5 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中反-2-癸烯醛變化的影響

加入抗氧化劑CA和TBHQ對油酸甲酯加熱過程中反-2-癸烯醛影響結果見圖9。由圖9可知，油酸甲酯(CK)與加入CA的油酸甲酯(CA)中反-2-癸烯醛隨加熱時間的延長呈增加趨勢，且加入CA的油酸甲酯中反-2-癸烯醛的增加趨勢要高于油酸甲酯，當加入TBHQ油酸甲酯(TBHQ)中反-2-癸烯醛隨加熱時間延長呈先上升后下降趨勢情況，并對反-2-癸烯醛抑制效果顯著(P<0.05)。由此可得出，加入CA對油酸甲酯中反-2-癸烯醛的不僅不能抑制其形成反而有促進作用，但具體原因有待于進一步分析，說明TBHQ對反-2-癸烯醛抑制效果要好于CA(P<0.05)。

圖9 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中反-2-癸烯醛的影響

2.3.6 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中反-2-十一碳烯醛變化的影響

加入抗氧化劑CA和TBHQ對油酸甲酯加熱過程中反-2-十一碳烯醛影響結果見圖10。由圖10可知，油酸甲酯和加入抗氧化劑的油酸甲酯中反-2-十一碳烯醛隨加熱時間的延長呈逐漸增加趨勢，這可能與反-2-十一碳烯醛的沸點(229 ℃)較高，在高溫下比較穩(wěn)定有關。加入CA和TBHQ在8 h以前對油酸甲酯中反-2-十一碳烯醛的形成抑制效果并不明顯(P>0.05)，而在12 h時具有顯著性差異(P<0.05)，CA效果好于TBHQ，由此說明，抗氧化劑在低溫或者加熱初期抑制作用并不顯著，且CA對油酸甲酯中反-2-十一碳烯醛的抑制效果要強于TBHQ(P<0.05)。

圖10 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中反-2-十一碳烯醛的影響

加入抗氧化劑對油酸甲酯加熱過程中的氧化產物—醛類羰基化合物具有良好的抑制效果，且TBHQ的作用效果總體上要優(yōu)于CA。但兩種不同抗氧化劑對不同醛類羰基化合物的抑制作用效果表現(xiàn)并不相同，TBHQ對油酸甲酯在加熱過程中辛醛、壬醛、癸醛和反-2-癸烯醛氧化產物抑制效果比CA強，但對反-2-十一碳烯醛的抑制效果則要比CA弱。值得一提的是，CA在油酸甲酯體系對反-2-癸烯醛形成有一定的促進作用，而具體原因并不清楚。

2.3 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中自由基含量變化的影響

熱氧化反應屬于自由基鏈式反應，表征起反應機理最有說服力的方法之一是電子順磁共振光譜儀(electron paramagnetic resonance, EPR)，又稱電子旋轉共振(electron spin resonance, ESR)，它是研究油脂熱氧化過程中自由基存在最直接和最有效的方法[32-34]。不同自由基形成的 ESR 譜圖不同，ESR的信號強度(峰高值)可表示樣品在共振條件下所吸收的總能量，且自由基含量(數(shù)目)與信號強度(峰高值)成正比。因而，根據不同自由基形成的 ESR 譜圖不同和信號強度(峰高值)能夠實現(xiàn)對自由基的定性和定量分析[35，36]。

添加抗氧化劑CA和TBHQ油酸甲酯的ESR圖譜測定結果見圖11，添加抗氧化劑的ESR譜圖的峰型非常相似，均為裂分的三重峰(即六重峰)，這可能與采用PBN捕獲的不同自由基加合物的譜圖通常十分相似，且譜圖多為自由基的混雜，難于區(qū)分和鑒別分子結構特征。綜合譜圖的g值為 2.001 8，接近于自由電子的g值2.003 0，符合自由基的基本特性，其超精細耦合分裂常數(shù)為αN=14.7 G，αH=20.7 G，屬于多種碳中心自由基混雜的結果[20，22，37]。油酸甲酯(CK)與添加CA和TBHQ油酸甲酯的信號強度隨加熱時間的延長呈上升趨勢，其中加入CA的油酸甲酯的信號強度隨加熱時間變化較小，TBHQ次之，油酸甲酯最大。說明油酸甲酯的自由基的含量隨加熱時間延長呈增加趨勢，加入CA和TBHQ對油酸甲酯自由基含量的產生有顯著抑制效果，其中CA效果優(yōu)于TBHQ。

圖11 鼠尾草酸對油酸甲酯熱加工過程中自由基變化規(guī)律的影響

3 討論

鼠尾草酸對FFA、AV和自由基的抑制作用效果略好于TBHQ，其原因可能是在熱誘導脂質氧化過程中，油脂發(fā)生熱水解反應形成游離脂肪酸、甘油一酯和甘油二酯等熱水解反應產物，不飽和脂肪酸在O2和高溫作用下，順式雙鍵易脫氫形成自由基而發(fā)生自由基鏈式反應，生成脂肪酸ROOH，而ROOH不穩(wěn)定易發(fā)生β均裂反應，產生大量醛、酮、酸、醇等小分子(相對于原不飽和脂肪酸)熱氧化降解反應產物等?？梢钥闯?，游離脂肪酸與自由基的形成均發(fā)生在油脂氧化的起始階段，由此可以推斷出，在油脂熱氧化反應起始階段，CA抗氧化作用效果要略好于TBHQ，在傳播反應與終止反應作用效果則稍差，鼠尾草酸對FFA、AV和自由基的抑制作用效果略好可能與兩者的作用階段不同有關。由此可以得出，除了常規(guī)理化指標之外，醛類羰基化合物和自由基含量可以作為衡量不飽和脂肪酸加熱過程中品質變化的重要指標，加入抗氧化劑可以提高油酸甲酯的熱氧化穩(wěn)定性。且鼠尾草酸可以考慮作為TBHQ的替代物。這可能與鼠尾草酸與TBHQ的結構類似，均為二酚類的抗氧化劑、且都有兩個活性羥基，因而鼠尾草酸具有很強的抗氧化活性，可與TBHQ媲美。

4 結論

本研究的油酸甲酯樣品主要理化指標(FFA、AV和PAV)在加熱過程中隨加熱時間延長均呈逐步增加趨勢，而POV和TOTOX在整個加熱過程中呈先上升后下降的趨勢。加入抗氧化劑能夠顯著降低油酸甲酯樣品中的FFA、AV、POV、PAV和TOTOX值(P<0.05)，其中CA對油酸甲酯FFA、AV的抑制作用效果略好于TBHQ，而在其他理化指標方面則稍遜于TBHQ。

加入抗氧化劑對油酸甲酯加熱過程中的氧化產物—醛類羰基化合物具有良好的抑制效果。CA和TBHQ對不同醛類羰基化合物的抑制作用效果表現(xiàn)并不相同，TBHQ對油酸甲酯在加熱過程中辛醛、壬醛、癸醛和反-2-癸烯醛氧化產物抑制效果比CA強，但對反-2-十一碳烯醛的抑制效果則要比CA弱?？傮w而言，TBHQ的作用效果總體上要優(yōu)于CA。

本研究是油酸甲酯樣品中自由基含量隨加熱時間延長均呈持續(xù)升高趨勢，其中未加入抗氧化劑油酸甲酯升高趨勢要顯著高于加入抗氧化劑的油酸甲酯，而CA比TBHQ對油酸甲酯中自由基含量的抑制效果更為明顯。