湯振興 陶湘林 魏穎娟 陽(yáng)永建謝 軍 向臺(tái)雙 唐漢軍，

(湖南大學(xué)研究生院隆平分院1，長(zhǎng)沙 410000)(湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所2，長(zhǎng)沙 410125)(懷化職業(yè)技術(shù)學(xué)院3，懷化 418000)

糧食作物的貯藏淀粉是半結(jié)晶的顆粒狀高分子化合物。數(shù)十年來(lái)的研究表明，天然淀粉顆粒包含四次元結(jié)構(gòu)[1-5]，即分子結(jié)構(gòu)、結(jié)晶結(jié)構(gòu)、納米小體(blocklets)、顆粒組織結(jié)構(gòu)。納米小體是構(gòu)筑天然淀粉顆粒組織的基本單元[5-8]。由于天然高分子納米材料具有可再生和易降解的特性，在許多領(lǐng)域均具有極好的應(yīng)用前景[9]，淀粉納米小體及其納米材料的制備技術(shù)受到越來(lái)越多的關(guān)注。常規(guī)方法是酸水解法和酶水解法[10-13]，但存在處理時(shí)間長(zhǎng)(5 d以上)和目標(biāo)產(chǎn)物得率低(小于10%)等問(wèn)題。

Sun等[14]采用1%次氯酸鈉氧化糯玉米淀粉后再進(jìn)行輕度超聲波處理，納米小體的總得率可達(dá)70%，但其結(jié)晶結(jié)構(gòu)完全被破壞。Kim等[15]將糯玉米淀粉在4 ℃硫酸水解6 d后的產(chǎn)物再進(jìn)行輕度超聲波處理，獲得高得率的結(jié)晶納米小體，但酸水解2 d和4 d獲得的納米小體其結(jié)晶結(jié)構(gòu)完全被破壞。Haaj等[16]在低溫下利用高功率超聲波處理1.5%普通玉米和糯玉米淀粉乳液，75 min后粒徑降解為 30～140 nm和30～250 nm的非結(jié)晶納米小體。Amini等[17]將15%的普通玉米淀粉，在40 ℃的3.16 mol/L硫酸溶液中超聲波處理45 min，最終獲得21.6%有結(jié)晶的納米小體。Kim等[18]和Park等[19]通過(guò)0.15N稀硫酸溶液處理糯玉米和普通玉米淀粉1 h，再在淀粉20%含水量條件下130 ℃熱處理8 h，然后配制成1%的乳液在23 000 r/min下攪拌1 h，最終得到80%的非結(jié)晶納米小體。已有方法的主要問(wèn)題是，納米小體結(jié)晶結(jié)構(gòu)破壞較輕的制備方法，一般得率較低；而得率較高、時(shí)間較短的制備方法，一般嚴(yán)重破壞納米小體的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。開發(fā)低水解、低損傷或無(wú)損傷、高產(chǎn)出的制備方法還需要做大量工作，同時(shí)為完全解析清楚納米小體與支鏈等分子的關(guān)系，及其在天然淀粉顆粒組織中的排列方式，也迫切需要納米小體的無(wú)損傷提取方法。

為了減少直鏈淀粉等成分的干擾，方便研究淀粉酸水解機(jī)理以及納米小體結(jié)構(gòu)與支鏈淀粉分子之間的關(guān)系，本研究選擇糯米淀粉作為實(shí)驗(yàn)材料，探索了凍結(jié)后再解凍(凍融)預(yù)處理對(duì)低溫酸水解的納米小體的產(chǎn)出率及其形態(tài)、粒度和結(jié)晶結(jié)構(gòu)等的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

糯米(糯2優(yōu)561，產(chǎn)地湖南汨羅，2017年)；濃硫酸、HCl、苯酚、NaOH、正戊醇、NaN3等試劑均為分析純。

1.2 儀器

PF-20R高速冷凍離心機(jī)，Sup-756紫外分光光度計(jì)，JB-10磁力攪拌器，sigma-300掃描電鏡，SCIENTZ-950E超聲波細(xì)胞破碎儀，101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，NanoBrook 90Plus Zeta動(dòng)態(tài)光散射納米粒度分析儀，D8 Advance粉末X射線衍射儀。

1.3 方法

1.3.1 淀粉提取

采用堿-醇法提取[20]。稱取糯米100 g于燒杯中，加入400 mL水在4 ℃下浸泡24 h后，用打漿機(jī)打成均勻米漿，過(guò)120目篩，離心收集粗淀粉(10 000×g，5 min)。濕米粉加入0.1%NaOH溶液400 mL，攪勻成懸浮液，在4 ℃下300 r/min攪拌2 h以上，離心收集濕淀粉(10 000×g；5 min)，該堿洗處理重復(fù)1次。然后濕淀粉用400 mL水均勻懸浮，用0.1 mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至7左右。加入正戊醇100 mL，在4 ℃下300 r/min攪拌5 h以上，4 ℃下靜置12 h以上，小心吸去醇液層，再加入正戊醇100 mL，在4 ℃下300 r/min攪拌5h后靜置，該醇洗處理直至醇液層透明為止。過(guò)400目篩后，離心收集濕淀粉(10 000×g；5 min)，加95%乙醇500 mL攪拌30 min后，用G4砂芯漏斗抽濾，95%乙醇100 mL洗3次，100 mL無(wú)水乙醇洗1次，100 mL乙醚洗2次。最后40 ℃烘箱中除去吸附的乙醚，放干燥器中備用。

1.3.2 凍融預(yù)處理

加5倍離子水的淀粉在室溫下浸泡2 h，離心收集濕淀粉(3 000×g，5 min)，放入-5 ℃下緩慢冷凍2 h后以上，40 ℃水浴中解凍30 min，重復(fù)該冷凍-解凍處理1～3次。用G4砂芯漏斗抽濾，5倍95%乙醇洗3次，適量無(wú)水乙醇洗1次，乙醚洗2次。最后40 ℃烘箱中除去吸附的乙醚，作為凍融處理淀粉樣品。

1.3.3 低溫硫酸水解

參考Kim等[15]的方法。稱取2.5 g淀粉樣品(W)，用3.16 mol/L硫酸溶液調(diào)制成15%的淀粉懸浮液，在4 ℃條件下，以120 r/min的速度攪拌水解1～6 d，每天的樣品做2個(gè)平行。

1.3.4 水解產(chǎn)物的收集處理

將每天的樣品取出，分別加水稀釋10倍后離心(4 ℃，3 000×g，10 min)，沉淀用適量的水?dāng)噭?，再離心，直至上清液達(dá)到中性，加入沉淀5倍體積的95%乙醇，按照上述淀粉收集和干燥的方法處理，作為水解淀粉殘?jiān)?。離心的所有上清液收集一起定容，作為上清1，其總糖采用苯酚-硫酸法測(cè)定，根據(jù)定容體積計(jì)算出總糖質(zhì)量(m1)。

取100 mL上清液1加入95%乙醇400 mL，靜置2 h后離心(4 ℃，10 000×g，5 min)，沉淀加入適量水分散后加入5倍95%乙醇，攪拌5 min，離心(4 ℃，10 000×g，5 min)，反復(fù)操作至上清液為中性，然后再依次用適量95%乙醇洗3次，無(wú)水乙醇洗1次，乙醚洗1次，40 ℃烘箱中除去多余的乙醚，作為納米小體樣品。離心的所有上清液收集一起定容，作為上清液2，上清液2的總糖采用苯酚-硫酸法測(cè)定，根據(jù)定容體積計(jì)算出總糖質(zhì)量(m2)。

納米小體得率=(m1-m2)/m×100%

1.3.5 SEM觀察

淀粉和水解殘?jiān)挠^察樣品，均勻吹附于樣品臺(tái)的導(dǎo)電膠上，在10 mA的電流下噴金120 s，進(jìn)行觀察。

納米小體觀察樣品制作，將25mg納米小體樣品配制成0.1%的懸浮液，在冰浴中超聲波處理10 min(100 W，20 kHz，輸出功率50%)，吸取200 μL滴到干凈的蓋玻片上，在室溫或40 ℃烘箱中風(fēng)干后，再滴加200 μL風(fēng)干(重復(fù)3～4次操作)。小心取部分蓋玻片貼到樣品臺(tái)的導(dǎo)電膠上，在10 mA的電流下噴金120 s，進(jìn)行觀察。

1.3.6 粒度分布分析

將20 mg納米小體樣品配制成0.2%的懸浮液，在冰浴中超聲波處理(100 W，20 kHz，輸出功率50%)至透明狀態(tài)，倒入石英比色皿內(nèi)，觀察無(wú)氣泡和沉淀，放入納米粒度分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 結(jié)晶分析

平衡樣品含水量至恒定10%，采用粉末X 射線衍射分析儀測(cè)定。測(cè)試條為：Cu K輻射，管壓40 kV，管流30 mA，掃描速度5(°)/min，掃描范圍2 U：5°～40°，通過(guò)MDI Jade 6.0軟件計(jì)算結(jié)晶度。

1.3.8 納米小體穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

稱取納米小體樣品20 mg于透明玻璃瓶中，加入20 mL蒸餾水作為分散劑(含0.02% NaN3)，配制成0.1% (m/V)的納米小體懸浮液，在冰浴中超聲波處理(300 W,20 kHz,輸出功率50%)至透明狀態(tài)后，在室溫下靜置觀察，每隔一段時(shí)間拍照紀(jì)錄狀態(tài)。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel2010和SPSS7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米小體得率和酸水解率

在4 ℃下硫酸水解至6 d的納米小體得率如圖1所示。原淀粉和凍融預(yù)處理淀粉均隨水解時(shí)間延長(zhǎng)呈直線上升的趨勢(shì)。凍融預(yù)處理3次、1次與無(wú)預(yù)處理淀粉之間有顯著差異，水解6 d后，納米小體得率分別達(dá)到20.9%、9.8%、6.7%，凍融預(yù)處理3次的得率是其他處理的約2～3倍，也遠(yuǎn)高于LeCorre等[13]報(bào)道的40 ℃酸水解和酶水解糯玉米淀粉時(shí)納米小體的得率。

另外，凍融預(yù)處理3次、1次與無(wú)預(yù)處理淀粉6 d后的加水分解率分別為1.4%、1.5%和1.8%(圖2)，整體上均顯示了較低的水解度，數(shù)值遠(yuǎn)低于40 ℃酸水解[15]和酶水解[12]，也比同為4 ℃下酸水解糯玉米淀粉的加水分解率低[15]。預(yù)處理3次與1次之間沒(méi)有顯著差異，但與無(wú)預(yù)處理之間有顯著差異。

這些結(jié)果表明，凍融預(yù)處理改變了淀粉的原有組織結(jié)構(gòu)，可提高酸水解時(shí)納米小體從淀粉顆粒組織中游離出來(lái)的速度，且預(yù)處理次數(shù)越多效果越顯著，同時(shí)有可能減少了納米小體游離時(shí)的損傷程度，在低溫環(huán)境下，一定程度避免了納米小體游離出來(lái)后被水解。

注：NFT：未凍融處理；FT1：凍融處理1次；FT3：凍融處理3次。圖1 酸水解淀粉的納米小體得率變化

圖2 淀粉酸水解6 d的加水分解率

2.2 淀粉的SEM觀察

原淀粉和酸水解后的淀粉殘?jiān)男螒B(tài)如圖3所示。原淀粉酸水解6 d后還能觀察到?jīng)]有水解痕跡的淀粉顆粒，但凍融預(yù)處理淀粉殘?jiān)袔缀蹩床坏酵暾牡矸垲w粒，凍融預(yù)處理3次的淀粉殘?jiān)阮A(yù)處理1次的碎片化程度更高。進(jìn)一步說(shuō)明凍融預(yù)處理對(duì)原淀粉顆粒組織的松散效果明顯，有利于納米小體的游離，與得率趨勢(shì)結(jié)果相符。

通過(guò)SEM觀察，3個(gè)處理的納米小體均為10～100 nm粒徑的球狀顆粒，不同處理之間整體上顆粒的形態(tài)和大小沒(méi)有明顯的差異，與之前的報(bào)告類似[7,15]。但觀察樣品制作技術(shù)不成熟，集結(jié)在一起的現(xiàn)象比較多，需要改進(jìn)。

注：NFT：未凍融處理的納米小體聚集體；FT1：凍融處理1次的納米小體聚集體；FT3：凍融處理3次的納米小體聚集體。圖4 酸水解6 d的納米小體聚集體SEM觀察

2.3 納米小體的粒度分布

圖5表示了酸水解6 d后獲得的納米小體粒度分布圖譜。從基于體積的分布圖，3個(gè)處理樣品均可看到?jīng)]有完全分散的集結(jié)顆粒顯示的小峰，也有可能是混入的淀粉顆粒碎片的峰，NFT位于870～1 300 nm，F(xiàn)T1在65～90 nm和365～505 nm兩處，F(xiàn)T3位于1 050～1 600 nm。但從基于數(shù)量的分布圖看，這些顆粒的頻率百分比幾乎為零。NFT納米小體粒徑的峰值為19.5 nm，分布范圍17～23 nm。FT1納米小體粒徑的峰值為21.0 nm，分布范圍20～26 nm。FT3納米小體粒徑的峰值為26.9 nm，分布范圍23～35 nm。說(shuō)明酸水解的作用位置主要是非結(jié)晶領(lǐng)域[11,12]，即支鏈分子的簇狀結(jié)構(gòu)不能參與結(jié)晶的分支點(diǎn)領(lǐng)域和簇狀結(jié)構(gòu)之間鏈接作用的長(zhǎng)鏈(≥B2)[1,11]。從FT3納米小體產(chǎn)物的尺寸來(lái)看，單個(gè)納米小體至少由2～4個(gè)簇狀結(jié)構(gòu)組成[5]，比FT1和NFT的納米小體更好地保持了原淀粉顆粒組織中納米小體的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果表明凍融預(yù)處理可減少酸對(duì)納米小體結(jié)構(gòu)的傷害。

注：NFT：未凍融處理的納米小體；FT1：凍融處理1次的納米小體；FT3：凍融處理3次的納米小體。圖5 酸水解6 d的納米小體粒度分布

2.4 粉末X射線衍射分析

從原淀粉的粉末X射線衍射圖譜可知(圖6)，糯米淀粉是典型的A型結(jié)晶結(jié)構(gòu)[11,12]，相對(duì)結(jié)晶度為42.01%。從FT3酸水解6 d后納米小體的主要峰型判斷，依然維持了A型結(jié)晶結(jié)構(gòu)，但相對(duì)于原淀粉的峰強(qiáng)度有所減小，相對(duì)結(jié)晶度有所增加，達(dá)到45.03%，這是由于非結(jié)晶領(lǐng)域被水解的緣故。結(jié)合SEM和粒度分布測(cè)量結(jié)果分析，采用乙醇沉降收集的納米小體樣品，可能包含可被乙醇沉降的水解產(chǎn)物糊精組分。為獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果，納米小體的收集方法有待進(jìn)一步改良。

注：FT3：凍融處理3次酸水解6 d的納米小體聚集體。圖6 淀粉的X射線衍射圖譜

2.5 淀粉乳液的穩(wěn)定性

為進(jìn)一步觀察納米小體的納米材料特性，將原淀粉和酸水解6 d的納米小體聚集體樣品配制成0.1%水乳液(含0.02%NaN3)，比較了在室溫下的穩(wěn)定性。剛配制的納米小體乳液均為透明液體，納米粒子(1～100 nm)乳液的丁達(dá)爾效應(yīng)很明顯[22]。第3天時(shí)，原淀粉完全沉淀，而納米小體樣品則由透明狀液體變成渾濁狀態(tài)，但這種狀態(tài)90 d后依然維持不變，且同樣呈現(xiàn)了丁達(dá)爾效應(yīng)，展現(xiàn)了納米材料的高穩(wěn)定性。從白光柱亮度和清晰度的狀態(tài)，F(xiàn)T3納米乳液比NFT的更好，比文獻(xiàn)報(bào)道穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)時(shí)間更長(zhǎng)[22,23]，充分展現(xiàn)了作為納米材料優(yōu)良特性之一的乳液高穩(wěn)定性。3 d后出現(xiàn)的渾濁現(xiàn)象，可能是由于納米小體不夠純凈，混雜的糊精慢慢凝聚的緣故，但由于整體濃度較低，水分子的分散力與顆粒間的凝聚力之間趨于平衡狀態(tài)，所以維持了較長(zhǎng)的乳液穩(wěn)定。

3 討論

本研究的糯米淀粉為實(shí)驗(yàn)材料，探索了凍融預(yù)處理對(duì)低溫酸水解的納米小體的產(chǎn)出率及其形態(tài)、粒度和結(jié)晶結(jié)構(gòu)等的影響。在4 ℃下硫酸水解至6 d后，整體上均顯示了非常低的加水分解度(1.4%～1.8%)，數(shù)值遠(yuǎn)低于40 ℃酸水解[15]和酶水解[12]，也比同為4 ℃下酸水解糯玉米淀粉的加水分解率低[15]。但獲得了遠(yuǎn)高于40 ℃酸水解和酶水解糯玉米淀粉時(shí)納米小體的得率[13]。凍融預(yù)處理3次的納米小體得率最高，達(dá)到20.9%，比凍融預(yù)處理1次和無(wú)預(yù)處理高2～3倍。通過(guò)對(duì)各處理的酸水解淀粉殘?jiān)^察，無(wú)預(yù)處理原淀粉酸水解6 d后還能觀察到?jīng)]有水解痕跡的淀粉顆粒，但凍融預(yù)處理淀粉殘?jiān)袔缀蹩床坏酵暾牡矸垲w粒，凍融預(yù)處理3次的比預(yù)處理1次的碎片化程度更高。說(shuō)明凍融預(yù)處理對(duì)原淀粉顆粒組織的松散作用明顯，處理次數(shù)多效果更好，產(chǎn)出率較高。

酸水解6 d后獲得的納米小體均為球狀顆粒，與前人研究類似[7,15]。粒度分布分析顯示，無(wú)預(yù)處理的納米小體粒徑峰值為19.5 nm，分布范圍17～23 nm；凍融預(yù)處理1次的納米小體粒徑峰值為21.0 nm，分布范圍20～26 nm；凍融預(yù)處理3次的納米小體粒徑峰值為26.9 nm，分布范圍23～35 nm。從納米小體產(chǎn)物的尺寸來(lái)看，單個(gè)納米小體至少包含2～4個(gè)簇狀結(jié)構(gòu)[1,5]，凍融預(yù)處理3次的比預(yù)處理1次和無(wú)預(yù)處理的納米小體更好地保持了原淀粉顆粒組織中納米小體的結(jié)構(gòu)。雖然酸水解6 d后的粉末X射線衍射分析依然維持了糯米淀粉的A型結(jié)晶圖譜[11,12]，但對(duì)比原淀粉的峰強(qiáng)度減小和相對(duì)結(jié)晶度的增加，凍融預(yù)處理3次的納米小體結(jié)構(gòu)一定程度被水解損傷。不過(guò)充分展現(xiàn)了作為納米材料優(yōu)良特性之一的乳液高穩(wěn)定性[22,23]，0.1%的納米小體水乳液(含0.02%NaN3)90 d后依然穩(wěn)定。但采用乙醇沉降收集納米小體樣品，也許樣品中包含有被乙醇沉降的水解產(chǎn)物糊精組分，在今后的研究中特別是普通淀粉材料，不能忽視直鏈淀粉和糊精組分的干擾，納米小體產(chǎn)物的收集方法有待進(jìn)一步改良。

這些結(jié)果分析說(shuō)明，酸水解最先的作用位置主要是淀粉非結(jié)晶領(lǐng)域[11,12]，即支鏈分子的簇狀結(jié)構(gòu)不能參與結(jié)晶的分支點(diǎn)領(lǐng)域和簇狀結(jié)構(gòu)之間鏈接作用的長(zhǎng)鏈(≥B2)[1,11]。凍融預(yù)處理可有效改變淀粉的原有組織結(jié)構(gòu)，使納米小體從淀粉顆粒組織中游離出來(lái)變得更容易，從而損傷程度更小，游離出來(lái)后抵抗酸水解的能力更強(qiáng)。但即便是在低溫環(huán)境下被長(zhǎng)時(shí)間酸處理，也會(huì)對(duì)結(jié)晶領(lǐng)域產(chǎn)生一定的傷害。因此，如果凍融預(yù)處理更充分些，并及時(shí)將納米小體從反應(yīng)系統(tǒng)中分離出來(lái)，可能會(huì)獲得更好的結(jié)果。

4 結(jié)論

凍融預(yù)處理可有效松散淀粉顆粒組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)酸水解時(shí)納米小體的游離速度，顯著提高單位時(shí)間內(nèi)的納米小體產(chǎn)出率；完善預(yù)處理方法，應(yīng)是一條保留原結(jié)晶特性的納米小體的制備技術(shù)途徑；對(duì)于為分析天然淀粉納米小體與支鏈淀粉等分子之間的關(guān)系，以及完全破解天然淀粉顆粒結(jié)構(gòu)的研究時(shí)實(shí)驗(yàn)樣品的準(zhǔn)備有一定參考意義。