徐靖達(dá)， 楊公利， 杜井峰， 徐 龍， 周燕紅△

（1湖北科技學(xué)院五官醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧437100；2深圳大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科，深圳大學(xué)臨床科學(xué)研究院腫瘤中心，廣東深圳518055）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全身惡性腫瘤的第6 位，死亡率位居第3 位，隨著人們飲食習(xí)慣的改變和環(huán)境污染程度加深，全世界HCC 發(fā)病率快速攀升，每年因肝癌死亡的患者高達(dá)80 萬人［1-2］。我國作為HCC 高發(fā)地區(qū)，每年因HCC 死亡患者約占全世界總數(shù)的35%，近幾年仍呈不斷上升的趨勢，嚴(yán)重危害人們的生命健康安全，以往臨床上治療HCC 主要采取手術(shù)切除為主，放療和化療為輔的手段［3-4］。隨著放療在臨床上的應(yīng)用，精確放療逐漸成為治療HCC 的重要手段，但放療會使機體產(chǎn)生耐受性，導(dǎo)致療效降低［5-6］。因此，尋找毒副作用小、增敏效果強的增敏藥物對提高放療效果意義重大。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡進(jìn)程中發(fā)揮作用，研究顯示，通過阻斷PI3K/AKT 通路的活化，可以增加食管癌細(xì)胞的放療敏感性［7］，提示PI3K/AKT 通路與腫瘤放療增敏有關(guān)。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素體內(nèi)代謝的主要產(chǎn)物，可通過干擾線粒體-表膜功能，發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用［8］。研究顯示，DHA 可通過PI3K/AKT 信號通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，起抗腫瘤的作用［9］。然而，DHA 能否通過調(diào)控 PI3K/AKT 信號通路以增強肝癌H22 細(xì)胞荷瘤小鼠放療效果尚未可知，因此本研究構(gòu)建肝癌H22 細(xì)胞荷瘤小鼠模型，觀察不同劑量DHA 聯(lián)合放療對荷瘤小鼠放療增效和腫瘤生長抑制的影響，并探討相關(guān)因子和PI3K/AKT信號通路蛋白的變化。

材料和方法

1 材料

1.1 試劑和儀器 DHA（貨號：81496-82-4）購自上海瀚鴻科技股份有限公司；特級胎牛血清（貨號：S9000）、RMPI-1640 培養(yǎng)液（貨號：31800）、白細(xì)胞介素 2（interleukin-2，IL-2）ELISA 試劑盒（貨號：SEKM-0008）和 IL-4 ELISA 試劑盒（貨號：SEKM-0005）均購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人AKT抗體（貨號：K10080-ZRF）和兔抗人p-AKT 抗體（貨號：K10770-IZK）均購自北京百奧萊博科技有限公司；羊抗兔II 抗（貨號：FNSA-0015）購自武漢菲恩生物科技有限公司；PrimeScript RT 試劑盒（貨號：RR037A）購自 TaKaRa。iBright FL1500 智能成像系統(tǒng)購自Thermo Fisher Scientific。

1.2 細(xì)胞株和動物 H22 腹水型HCC 細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫，常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素的 RMPI-1640 培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為飽和濕度、5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱，隔天換液，胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的H22 細(xì)胞用于實驗。SPF 級昆明小鼠購自四川大學(xué)實驗動物中心，許可證號為SCXK（川）2018-0002，體重18～22 g，6～8 周齡，雌雄各半，均常規(guī)適應(yīng)性培養(yǎng)一周后用于后續(xù)實驗。

2 方法

2.1 建造肝癌H22 細(xì)胞荷瘤小鼠模型 用預(yù)冷的生理鹽水調(diào)整H22 細(xì)胞密度為1.0×1010/L，用75%乙醇消毒待注射部位皮膚，用無菌注射器將細(xì)胞懸液以每只0.2 mL 的體積接種于小鼠右肢皮下。待小鼠瘤直徑約7 mm 時，剝離皮下腫瘤，繼續(xù)按照上述步驟在小鼠體內(nèi)傳代，以第3 代荷瘤小鼠作為模型進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 實驗動物分組及給藥方法 荷瘤小鼠模型構(gòu)建成功1 周后，根據(jù)小鼠腫瘤大小均勻分組，每組8只，分別為：（1）模型（model）組；（2）單放療（single radiotherapy）組；（3）5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU；25 mg/kg［10］）組；（4）DHA 低劑量（25 mg/kg）組；（5）DHA 中劑量（50 mg/kg）組；（6）DHA 高劑量（100 mg/kg）組［11］。DHA在超聲條件下用DMSO配制成母液，隨后用RMPI-1640 培養(yǎng)液稀釋至所需濃度（DMSO終體積＜0.1%）。陽性藥5-FU和DHA均在放療前30 min 腹腔注射，給藥體積為每只200 μL。模型組腹腔注射含有等體積分?jǐn)?shù)DMSO 的生理鹽水。每天1 次，治療21 d。放療方法：在各組小鼠清醒狀態(tài)下，以137Cs 作為照射源，照射劑量5 Gy，照射劑量率0.50 Gy/min。暴露小鼠腫瘤部位，其余部位均用鉛板遮擋。

2.3 觀察指標(biāo) 隔天測量各組荷瘤小鼠體重和瘤體積。觀察小鼠一般活動狀態(tài)和精神面貌。給藥結(jié)束后，取血并立刻脫頸處死各組荷瘤小鼠，剝離腫瘤，稱重并記錄，測定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度［脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA）刺激指數(shù)（stimulating index，SI）］和自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞活性（采用MTT法測定）。根據(jù)公式計算增敏系數(shù)（enhancement factor，EF）、腫瘤生長抑制率和腫瘤生長延緩時間。腫瘤生長抑制率（%）=（1-治療組平均瘤重/模型組平均瘤重）×100%；腫瘤生長延緩時間（tumor growth delay，TGD）=治療組TGT3-空白組TGT3（TGT3指腫瘤體積生長至放射治療前3 倍所需時間）；EF=給藥組TGD/單放療組TGD。當(dāng)EF＞1，說明藥物具有放療增效作用。

2.4 ELISA 法檢測各組小鼠血清因子 治療結(jié)束后，鼠尾抽取各組小鼠外周血，靜置30 min，離心取上清，按照ELISA試劑盒說明書測定IL-2和IL-4水平。

2.5 RT-qPCR 測定各組小鼠腫瘤組織中PI3K 和AKT mRNA 表達(dá)水平 從液氮中取出各組荷瘤小鼠腫瘤組織，提取組織總RNA，用PrimeScript RT 試劑盒合成cDNA，以其為模板，進(jìn)行PCR 擴增。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 3 min；變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，48 個循環(huán)。PI3K 的上游引物序列為5'-CTCCACGACCATCATCAG-3'，下游引物序列為 5'-TTCTTCACGGTTGCCTAC-3'；AKT 的上游引物序列為 5'-GTATGCTGGCAGAGTAGGAGAAC-3'，下游引物序列為5'-CAGGTAACATCAGAGACAGACACA-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-GATACAGTTCCCGTGTTGTTGAC-3'，下游引物序列為5'-CATAAAGACACATAACACCACACTC-3'。以 GAPDH 為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算PI3K和AKT的相對表達(dá)量。

2.6 Western blot 法測定各組小鼠腫瘤組織中PI3K、AKT 和p-AKT 的蛋白表達(dá)水平 從液氮中取出各組荷瘤小鼠腫瘤組織，置于含有蛋白酶抑制劑的研缽中，研磨均勻，根據(jù)BCA試劑盒說明書測定總蛋白含量，與20 μL 5×緩沖液混合，100℃預(yù)處理10 min，凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白，低壓80 V、30 min，高壓120 V、90 min，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后加入I 抗（1∶1 000 稀釋），4℃下孵育過夜，再加入II 抗（1∶1 000稀釋），室溫雜交1 h，顯色，測定條帶灰度值。蛋白相對含量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同劑量的DHA 對H22 細(xì)胞荷瘤小鼠的放療增效作用

與模型組相比，單放療組TGT3顯著升高（P＜0.05），與單放療組相比，低、中、高劑量DHA 組TGT3進(jìn)一步升高（P＜0.05），隨著DHA 劑量的升高而升高（P＜0.05），高劑量組TGT3與5-FU組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；各劑量DHA 組EF 隨著DHA 劑量的升高而升高（P＜0.05），高劑量組與5-FU 組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 DHA聯(lián)合放療對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響Table 1.Effect of DHA combined with radiotherapy on tumor growth in tumor-bearing mice（Mean±SD. n=8）

2 不同劑量的DHA 聯(lián)合放療對H22 細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用

與模型組相比，單放療組腫瘤體積和重量均顯著降低（P＜0.05），與單放療組相比，低、中、高劑量DHA 組腫瘤體積和重量進(jìn)一步降低（P＜0.05），且隨著DHA 劑量的升高而降低（P＜0.05），高劑量組與5-FU 組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與單放療組相比，各劑量DHA 組抑瘤率均顯著升高（P＜0.05），且隨著DHA 劑量的升高而升高（P＜0.05），高劑量組與5-FU 組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1、2和表2。

Figure 1.Representative images showing the size of the tumors from tumor-bearing mice in each group.A：model group； B： single radiotherapy group； C： 5-FU group；D：low-dose DHA group；E：middle-dose DHA group；F：high-dose DHA group.圖1 各組荷瘤小鼠腫瘤大小的代表性圖片

3 各組荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度和NK細(xì)胞活性

與模型組相比，單放療組荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度和NK細(xì)胞活性均顯著降低（P＜0.05）；與單放療組相比，低、中、高劑量DHA 組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度和NK 細(xì)胞活性均顯著升高（P＜0.05），且隨著DHA劑量的升高而升高（P＜0.05）；5-FU 組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度和NK細(xì)胞活性均低于DHA組，見表3。

4 各組小鼠血清IL-2和IL-4水平

與模型組相比，單放療組荷瘤小鼠血清IL-2 和IL-4 水平顯著降低（P＜0.05）；與單放療組相比，各劑量DHA 組荷瘤小鼠血清IL-2 和IL-4 水平顯著升高（P＜0.05），且隨著 DHA 劑量的升高而升高（P＜0.05）；5-FU 組小鼠血清 IL-2和IL-4 水平均低于DHA組，見表4。

Figure 2.Changes of tumor volume in tumor-bearing mice of each group.Mean±SD. n=8.*P＜0.01 vs model group；#P＜0.05 vs single radiotherapy group；△P＜0.05 vs low-dose DHA group；▲P＜0.05 vs middledose DHA group.圖2 各組荷瘤小鼠腫瘤體積的變化

表2 不同劑量的DHA 聯(lián)合放療對H22 細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用Table 2.Inhibitory effect of different doses of DHA combined with radiotherapy on tumor growth in H22 cell tumorbearing mice（Mean±SD. n=8）

表3 各組荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度和NK細(xì)胞活性Table 3.lymphocyte transformation degree and NK cell activity of tumor bearing mice in each group（Mean±SD.n=8）

表4 各組小鼠血清因子IL-2和IL-4水平Table 4.The levels of serum factors IL-2 and IL-4 in each group（ng/L.Mean±SD. n=8）

5 DHA 聯(lián)合放療對H22 細(xì)胞荷瘤小鼠PI3K 和AKT mRNA表達(dá)的影響

與模型組相比，單放療組PI3K 和AKT 的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與單放療組相比，低、中、高劑量DHA組PI3K和AKT的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步降低（P＜0.05），且隨著DHA 劑量的升高而降低（P＜0.05），見圖3。

6 DHA 聯(lián)合放療對H22 細(xì)胞荷瘤小鼠PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)的影響

與模型組相比，單放療組AKT 表達(dá)水平無顯著變化（P＞0.05），PI3K 表達(dá)水平和AKT 磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）；與單放療組相比，低、中、高劑量DHA 組PI3K 表達(dá)水平和AKT 磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）；隨著DHA 劑量的升高，PI3K 表達(dá)水平和AKT磷酸化水平隨之降低（P＜0.05），見圖4和表5。

討 論

青蒿素是一種抗腫瘤藥物，研究顯示，青蒿素是結(jié)直腸癌細(xì)胞株的輻射敏感劑，可以顯著增加放射線對結(jié)直腸癌Lovo 細(xì)胞的抑制作用，強化放射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［12］。DHA 是青蒿素的衍生物，能夠抑制或殺傷機體大部分腫瘤細(xì)胞，有效提高治療肺癌的療效［13］，研究顯示，DHA能明顯抑制肺癌細(xì)胞增殖，增加其放療敏感性［14］。本研究顯示，相比于模型組，單放療組和低、中、高劑量 DHA 組 TGT3、EF 和抑瘤率顯著升高，DHA 治療組較單放療組瘤重顯著降低，且呈濃度依賴性，提示DHA 具有放療增效的作用，放療聯(lián)合DHA 能夠更好地提高肝癌H22 細(xì)胞荷瘤小鼠對放療的敏感性，抑制腫瘤生長。但是，DHA通過哪種途徑以增強放療敏感性還有待進(jìn)一步研究。

Figure 3.The mRNA expression levels of PI3K and AKT in tumor tissues from H22 cell tumor-bearing mice in different groups.Mean±SD. n=8.*P＜0.01 vs model group；#P＜0.05 vs single radiotherapy group；△P＜0.05 vs low-dose DHA group；▲P＜0.05 vs middledose DHA group.圖3 不同組H22 細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤中PI3K 和AKT 的mRNA表達(dá)水平

Figure 4.The protein levels of PI3K，AKT and p-AKT in tumor tissues from H22 cell tumor-bearing mice in different groups.A：model group；B：single radiotherapy group；C：5-FU group；D：low-dose DHA group；E：middle-dose DHA group；F：high-dose DHA group.圖4 不同組H22 細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤中PI3K、AKT 和p-AKT的蛋白水平

表5 不同組H22細(xì)胞荷瘤小鼠腫瘤中PI3K、AKT和p-AKT的蛋白水平Table 5.The protein levels of PI3K，AKT and p-AKT in tumor tissues from H22 cell tumor-bearing mice in different groups（Mean±SD. n=8）

隨著病程的發(fā)展和惡化，肝癌患者常伴有免疫功能下降或障礙，特別在接受化療和放療的患者表現(xiàn)更嚴(yán)重，影響放療療效，使患者生存質(zhì)量下降［15］。淋巴細(xì)胞增殖程度可反映機體免疫功能，可由淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度體現(xiàn)，IL-2 作為T 細(xì)胞亞群生長因子可由 CD4+和 CD8+細(xì)胞分泌，可活化 B 細(xì)胞增殖［16-17］。IL-4水平是衡量疫苗免疫的重要指標(biāo)，可誘導(dǎo)Th0細(xì)胞分化為 Th2 細(xì)胞［18］。此外，NK 細(xì)胞高活性可釋放顆粒酶B、IFN-γ、穿孔素等細(xì)胞因子，以殺傷腫瘤細(xì)胞［19］。本研究顯示，與模型組相比，單放療組荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度、NK 細(xì)胞活性及IL-2 和IL-4 水平顯著降低，說明放療降低機體免疫功能；DHA 治療組較單放療組荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度、NK 細(xì)胞活性及IL-2 水平和IL-4 水平顯著升高，而5-FU 組均低于DHA 組，說明放療聯(lián)合DHA 能夠提高荷瘤小鼠免疫能力，以增強放療效果。

PI3K/AKT 信號通路不僅參與調(diào)控腫瘤增殖和凋亡的過程，也與腫瘤細(xì)胞放化治療的敏感性密切相關(guān)。張明等［20］研究顯示，通過抑制PI3K/Akt 信號通路激活，可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而提高結(jié)腸癌細(xì)胞的放射敏感性。本研究顯示，與模型組相比，單獨放療組中PI3K 和AKT 的mRNA 及PI3K 和p-AKT 的蛋白表達(dá)水平顯著降低，說明PI3K/AKT 信號通路與放療治療有關(guān)。張雷等［21］研究顯示，DHA 可能通過激活線粒體凋亡途徑并抑制PI3K/AKT 信號通路活性，以增強Rajj 細(xì)胞對放射的敏感性。本研究顯示，DHA 治療組較單放療組 PI3K和AKT 的 mRNA 及 PI3K和p-AKT 的蛋白表達(dá)水平顯著降低，呈劑量依賴性，高劑量組與5-FU組相當(dāng)，說明隨著DHA 劑量升高，PI3K/AKT 信號通路活性抑制程度越高，提示DHA 可能通過抑制PI3K/AKT信號通路活性，以增強放療療效。

綜上所述，DHA 可能通過抑制PI3K/AKT 信號通路活性，提高荷瘤小鼠免疫能力，從而增強放療效果。