楊 婧， 趙耀偉， 高 紅， 趙麗莉

（1黑龍江中醫(yī)藥大學，2哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150000）

CCN 由富半胱氨酸蛋白61（cysteine-rich protein 61，CYR61）、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）和腎母細胞瘤過表達蛋白（nephroblastoma overexpressed protein，NOV）的首字母縮寫而來。CCN 家族是一類具有半胱氨酸富集特性的基質細胞蛋白（matricellular proteins），包括CCN1～6 等家族成員（其中CCN1 即CYR61，CCN2 即CTGF，CCN3 即NOV），具有廣泛的生物學功能。它們通過與細胞表面的各種整合素直接結合或與多種細胞生長因子相互作用來調控各種因子的生物活性，還可通過信號途徑相互作用來改變細胞生長因子的具體作用［1］，從而參與細胞的生長、黏附和遷移過程。CCN 蛋白在肥胖癥和非酒精性脂肪肝及其并發(fā)癥中的炎癥調控、創(chuàng)傷修復、纖維性疾病等方面均發(fā)揮重要作用。

1 CCN蛋白與脂肪細胞活化的調控

肥胖本身也是一種慢性炎癥狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者血漿中的炎癥細胞因子濃度升高，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）。脂肪組織不僅是能量儲存器官，同時也是重要的內分泌組織，可分泌多種脂肪細胞因子來調節(jié)機體的能量平衡，并在肥胖相關的炎癥和代謝紊亂方面發(fā)揮重要作用。脂肪細胞因子由脂肪細胞或脂肪組織巨噬細胞所產生，包括瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素和內脂素，同時也包括促炎細胞因子和抗炎細胞因子，例如TNF-α、IL-6、IL-1β 和單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP1）等［2］。由于人們身體儲存多余熱量轉化為脂肪并通過產熱來消耗熱量的能力不同，因此在脂肪組織不易產熱和不易將能量儲存在皮下脂肪中的人群中，他們就更易出現(xiàn)低度系統(tǒng)性炎癥［3］。

體外模擬脂肪生成是一個多步驟的過程，首先逐步確定間充質干細胞，然后將其定型為脂肪細胞譜系，并最終分化為成熟的脂肪細胞，其中脂肪細胞分化（fat cell differentiation，F(xiàn)CD）增強了脂肪細胞特性，包括脂質存儲和胰島素敏感性。CCN2 可抑制NIH3T3-L1 細胞的脂肪細胞分化和分離自小鼠附睪脂肪墊的脂肪細胞中的FCD，而CCN2對FCD的作用依賴于轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）及其下游通路的信號傳導。其中TGF-β1是脂肪形成的關鍵負調節(jié)劑，通過其細胞經典信號傳導因子SMAD 起作用。在動物和人類肥胖癥中均觀察到 TGF-β1 的 mRNA 水平升高。TGF-β1 的下游介體之一是CCN2，它可能通過自分泌和旁分泌細胞回路起作用，以調節(jié)組織（例如骨和軟骨）中的細胞增殖、生長及分化［4］。

迄今為止，對于CCN 蛋白在脂肪細胞中作用機制的研究是有限的。Tan 等［5］發(fā)現(xiàn) CCN2 對體外培養(yǎng)的小鼠NIH3T3L1 細胞和原代培養(yǎng)的小鼠脂肪細胞具有抑制作用。Song 等［4］證明這是通過 TGF-β 途徑依賴機制發(fā)生的，并涉及FCD 中的關鍵早期轉錄因子——CCAAT/增強子結合蛋白（CCAAT/enhancerbinding protein，CEBP），特別是 CEBP-β和CEBP-δ。Tan 等［6］在高脂肪飲食環(huán)境中誘導肥胖的研究表明，肥胖小鼠脂肪組織中CCN2的mRNA 上調，而在不易增重的小鼠中的上調幅度較低。Pellegrinelli 等［7］在人體研究中發(fā)現(xiàn)，CCN2 表達與來自肥胖個體的白色脂肪組織中近脂肪細胞纖維化的量呈正相關，這表明CCN2 的高表達可能會損害脂肪細胞功能。而Si 等［8］和 Battula 等［9］的研究表明，CCN2 通過細胞機制（包括Wnt 信號傳導）抑制間充質干細胞向脂肪細胞譜系的分化，而優(yōu)先向成骨細胞譜系分化。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明脂肪組織中的CCN2可能不同程度地影響間充質干細胞向脂肪細胞的分化，抑制初始和終末脂肪細胞的分化，并且還導致肥胖和脂質代謝功能障礙［3］。

如前所述，CCN 蛋白與脂肪細胞分化密切相關：一方面CCN2的表達與脂肪細胞的生長分化呈正相關，最終影響脂肪細胞功能；另一方面脂肪CCN2表達高低與小鼠肥胖程度密切相關。這可能為肥胖及其相關并發(fā)癥的研究提供了新思路及新靶點。已知CCN2參與脂肪細胞分化，需要進一步研究高脂肪和高熱量喂養(yǎng)的條件下，CCN2基因敲除小鼠和CCN2 高表達小鼠在熱量消耗方面的差異，觀察CCN2是否會影響脂肪組織的褐變，從而通過產熱影響能量消耗。

2 CCN蛋白與非酒精性脂肪肝癥狀的發(fā)生機制

2.1 CCN 蛋白調控非酒精性脂肪肝的纖維化 非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指非過度飲酒及其它明確損肝因素所致的、以肝細胞內大量脂肪沉積為主要特征的疾病。Williams 等［10］在 NAFLD 的常見代謝情況下進行研究，發(fā)現(xiàn)作為其誘因之一的糖尿病，在人類和小鼠模型會誘發(fā)更嚴重的NALFD 纖維化形式，稱為非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）。Rachfal 等［11］的研究表明，在纖維化肝臟中，CCN2 的mRNA 和蛋白由成纖維細胞、肌成纖維細胞、肝星狀細胞、內皮細胞和膽管上皮細胞產生。Lo等［12］發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)的糖尿病小鼠模型的肝細胞中CCN2 的mRNA 和蛋白表達水平顯著升高，而 Twigg［3］使用中和性多克隆抗CCN2 抗體阻斷CCN2 蛋白，可部分預防糖尿病 NASH 模型中的纖維化。Paradis 等［13］的研究表明，CCN2表達在人類NASH 纖維化肝臟和血液中升高。Tong等［14］發(fā)現(xiàn)，在肝細胞過表達人CCN2的轉基因小鼠中加劇致病刺激，如四氯化碳和膽管結扎，導致肝纖維化風險增加。Chen等［15］的研究表明，外泌體中的關鍵微小RNA 可能會調節(jié)促纖維化活化的肝星狀細胞中CCN2的表達，這表明對于纖維化運用此方法可能是未來治療的趨勢。Kim 等［16］認為采用系統(tǒng)性CCN1治療，有助于預防在高脂肪喂養(yǎng)的NAFLD小鼠模型中的纖維化。

CCN 蛋白作為代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的關鍵靶點，迄今為止尚未將CCN 與NAFLD 相結合的研究，因此在今后的疾病研究中應該對這一空白加以彌補，為CCN蛋白研究擴展新領域。

2.2 CCN 蛋白調控非酒精性脂肪肝的炎癥反應非酒精性脂肪肝并發(fā)的炎癥大多是由營養(yǎng)和能量過剩所致，是參與代謝的組織細胞的一種免疫應答。NASH 作為較為嚴重的一種NAFLD 病理類型，發(fā)展成為肝纖維化、肝硬化等的風險性較大?！岸嘀仄叫写驌簟睂W說認為NASH 是多種機制共同作用的結果，較為準確地解釋了NASH 的發(fā)病機制，包括內質網應激（endoplasmic retieulum stress，ERS）、細胞凋亡、自噬、相關脂肪因子紊亂和腸道菌群因素等在內的多種因素參與了其發(fā)病過程［17］。在這一過程中，參與代謝的組織（脂肪、肝臟、肌肉等）中TNF-α、IL-6等炎癥因子的水平升高［18］。Haukeland 等［19］對 22 例NAFLD 患者和25 例NASH 患者的血清與同年齡、同性別的健康人血清進行對比分析，發(fā)現(xiàn)兩組患者血清中炎癥因子IL-6、TNF-α等的水平與對照組相比顯著升高。

CCN1 通過激活巨噬細胞中NF-κB，上調炎癥因子和趨化因子的表達，通過其細胞表面受體整合素αMβ2和syndecan-4誘導巨噬細胞中經典激活的M1型應答的基因表達變化，導致促炎細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達升高，IFNγ 和趨化因子（包括MIP-1α、MCP-3、Gro1、Gro2和IP-10）亦升高。這些因素可募集并激活更多的炎癥細胞，包括多形核中性粒細胞、單核/巨噬細胞和T淋巴細胞。同時，抗炎效應子如 TGF-β1和IL-10Rβ 的表達減弱，導致炎癥反應的進一步擴大［20］。Mo 等［21-22］認為CCN1是胚胎發(fā)生過程中心血管發(fā)育的一個必需基因，而Lau［23］發(fā)現(xiàn)，成年期CCN1 的表達與炎癥密切相關。在炎癥細胞遷移和浸潤過程中，炎癥刺激激活內皮細胞，并表達黏附分子和細胞因子，而這些正是炎癥細胞在炎癥反應中的補體。CCN1和CCN2同樣在免疫細胞補體激活過程中起到重要作用［24］。Jun 等［25］和 Kubota 等［26］分別研究發(fā)現(xiàn)，CCN1 和CCN 家族的其他成員在組織損傷、慢性疾病和相關病理過程中的表達升高，包括動物模型和人類患者中的纖維化和癌癥。

現(xiàn)有研究多針對于CCN 蛋白與風濕等炎癥反應，但對于代謝性炎癥的研究較少，隨著非酒精性脂肪肝患病率的逐年升高，CCN 與非酒精性脂肪肝炎癥反應的關系或成為未來研究方向之一。

3 CCN 蛋白與非酒精性脂肪肝及其并發(fā)癥損傷的修復

3.1 CCN 蛋白調節(jié)膽管細胞分化修復損傷 肝臟是高度可再生器官，CCN1 在肝膽損傷修復的增殖和成熟階段起著關鍵作用。肝細胞和膽管細胞是肝臟的兩種不同上皮細胞類型，它們對損傷的反應不同。在肝臟中，CCN1 在二乙基亞硝胺誘導的肝癌中抑制肝細胞代償性增殖，從而抑制腫瘤的發(fā)生；然而，當膽汁淤積損傷膽管細胞，CCN1 誘導膽管細胞增殖和膽管再生。

在膽汁淤積性損傷中，增殖期的主要修復反應是膽管反應，包括膽管細胞增生、膽管擴張、肝祖細胞向膽管細胞的分化等。Kim 等［27］發(fā)現(xiàn)，CCN1對于因膽管結扎（bile duct ligation，BDL）或3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氫可力?。?，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydrocollidine，DDC）飲食造成的損傷后膽管再生至關重要，后者是模擬人膽汁淤積性肝病的實驗模型。Ccn1D125A/D125A小鼠在BDL 之后的幾天內死亡，而野生型小鼠在相同實驗中存活下來。Ccn1D125A/D125A小鼠快速死亡是由于未發(fā)生膽管反應，膽汁酸不能排入膽囊和腸道，而外漏入肝實質，造成大面積肝壞死。此外，研究發(fā)現(xiàn)CCN1通過整合素αVβ5在膽管細胞中的參與而發(fā)揮作用，從而激活NF-κB 介導的JAG1 表達和膽管細胞增生所需的JAG1/NOTCH 信號。Kim等［27］和 Boulter 等［28］發(fā)現(xiàn)，CCN1 還激活肝星狀細胞中JAG1 的表達，通過JAG1/NOTCH 信號通路與肝祖細胞相互作用，誘導肝祖細胞向膽管細胞分化，促進膽管再生。其機制可能與肝星狀細胞激活后分泌的JAG1 調節(jié)下游靶基因SOX9和Hes1在肝祖細胞中表達有關，SOX9和Hes1 作為 JAG1/NOTCH 信號通路下游重要的信號分子，在胚胎膽管的形成發(fā)展中起重要作用［29］，最終調控肝祖細胞向膽管細胞分化，促進膽管細胞增生，修復膽管損傷。

這些研究結果表明，CCN1 通過激活αVβ5介導的 NF-κB和JAG1/NOTCH 信號通路而發(fā)揮作用，因此它對于膽管損傷再生中的膽管反應是必不可少的。

3.2 CCN 蛋白對肝細胞纖維化的雙向調控 肝纖維化是多種慢性肝損傷導致的病理性修復反應，其特征在于肝臟內肌成纖維細胞大量增生和其帶來的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）蛋白過度沉積。近年來，人們開始探索CCN 蛋白在調控肝纖維化中的作用機制，尤其是它們在肝星狀細胞激活中的作用。肝星狀細胞位于肝竇內皮細胞和肝細胞之間的竇間隙Disse 腔中，在正常肝臟內處于靜息狀態(tài)，作為肝纖維化的原發(fā)效應細胞，活化的肝星狀細胞分化為成纖維細胞，產生大量的ECM［30］。CCN1～5在肝星狀細胞活化過程中的表達均呈現(xiàn)上調的趨勢，其中CCN2 可顯著增強肝星狀細胞的激活表型，這是肝星狀細胞表型轉化的中心通路；CCN4 具有促進纖維化的調控作用；CCN1 則可表現(xiàn)出抑制纖維化作用；而 CCN3和CCN5 一起，可減輕 CCN2 和CCN4的促進纖維化作用［31］。

CCN1 加速成熟階段的基質重塑，并限制纖維化，當肝臟遭受慢性損傷或由于肝毒素（如四氯化碳）中毒或膽汁淤積引起的損傷時，成纖維細胞被激活，產生 ECM，從而修復損傷組織。Kim 等［16］發(fā)現(xiàn)，在四氯化碳中毒和膽汁淤積2 種損傷模型中，CCN1通過誘導成纖維細胞衰老來抑制和限制纖維化，從而導致抗纖維化的衰老相關分泌表型（senescenceassociated secretory phenotype，SASP）蛋白的表達。Kim 等［16］和 Borkham-Kamphorst 等［32］發(fā)現(xiàn)，肝細胞特異性缺失CCN1的小鼠患有加重的纖維化，并伴有成纖維細胞衰老缺陷，肝細胞中CCN1的過表達加速成纖維細胞衰老從而減少肝纖維化。

此外，研究發(fā)現(xiàn)施用純化的CCN1蛋白會加速預先建立的纖維化的消退。通過觸發(fā)肝成纖維細胞中的細胞衰老，CCN1 阻止了這些產生ECM 的細胞的增殖并將其轉化為ECM 降解的細胞，從而加速了纖維化的消退。CCN1 在肝損傷前期激活肝星狀細胞以修復損傷，在后期限制纖維化以促進組織完整性，因此CCN1在肝損傷修復過程中扮演重要角色。

3.3 CCN1 對非酒精性脂肪肝并發(fā)癥的調控 非酒精性脂肪肝與糖尿病的發(fā)生密切相關，而慢性皮膚損傷是糖尿病最為常見也最為嚴重的一種并發(fā)癥。目前研究認為，由于糖尿病患者血糖、血脂等基礎代謝失調致使局部皮膚微環(huán)境紊亂，繼而影響到損傷部位參與創(chuàng)面修復的細胞的功能，最后傷口發(fā)生持續(xù)炎癥及愈合障礙［33］。

Stramer 等［34］和 Gurtner 等［35］發(fā)現(xiàn)，在傷口愈合和損傷修復過程中，無論器官或組織如何，通常都要經歷3 個階段，這3 個階段在時間上重疊但功能上不同：在初始階段，免疫細胞對抗微生物并清除細胞碎片；在增殖階段，肌成纖維細胞產生大量ECM，以促進組織完整性和實質細胞的增殖；最后，在成熟階段重建臨時ECM，以重建原始未損傷組織的結構。由于CNN1結構的特殊性及受體的多樣性，決定了其廣泛參與了機體胚胎發(fā)育、創(chuàng)口愈合、炎癥起始等病理生理過程［36］。

Lau［37］證明CCN1通過特異性整合素受體與不同細胞類型相互作用，從而調節(jié)損傷修復的每個階段。Jun 等［38］認為，在皮膚損傷后，CCN1 在炎癥期和成熟期以雙向方式被上調：在炎癥期，通過結合巨噬細胞和凋亡細胞中的整合素 αVβ3/αVβ5，CCN1 作為一種橋接分子刺激中性粒細胞清除；在成熟階段，CCN1 通過整合素α6β1結合到肌成纖維細胞的CT 結構域，從而觸發(fā)肌成纖維細胞衰老來抑制和限制纖維化。在皮膚傷口愈合的炎癥階段，CCN1 的一個顯著活性是刺激凋亡細胞的吞噬清除。中性粒細胞的浸潤是創(chuàng)傷后最先發(fā)生的事件之一，以抵御微生物感染。然而，中性粒細胞壽命短暫，并迅速經歷凋亡和壞死。Silva［39］發(fā)現(xiàn)，凋亡的中性粒細胞必須被移除才能繼續(xù)愈合，因為這些細胞會發(fā)生繼發(fā)性壞死，并分泌蛋白酶和細胞因子，導致進一步的組織損傷。從機理上講，CCN1 作為橋接分子，與磷脂酰絲氨酸結合，磷脂酰絲氨酸是凋亡細胞上的吞噬信號，與巨噬細胞中的αVβ3/αVβ5結合，從而觸發(fā)凋亡中性粒細胞的吞噬清除，見圖1［40］。 Jun 等［38］發(fā)現(xiàn)，Ccn1D125A/D125A小鼠的傷口缺乏由CCN1 介導的凋亡中性粒細胞清除，停滯在炎癥階段，導致向增殖階段的進展受阻。

Figure 1.The role of CCN1 in wound healing［40］.In the inflammatory phase，CCN1 stimulates the clearance of apoptotic neutrophils，allowing wound healing to progress to the proliferation phase in which myofibroblasts produce extracellular matrix（ECM）to promote tissue integrity.During the maturation phase，CCN1 induces cellular senescence in myofibroblasts to stimulate matrix remodeling and limit fibrosis.圖1 CCN1在傷口愈合過程中的作用

Jun 等［41］發(fā)現(xiàn)，在增殖階段，成纖維細胞、周細胞和間充質干細胞樣細胞可轉分化為肌成纖維細胞并產生ECM，以促進組織完整性和細胞增殖，當愈合進入成熟階段時，則會通過經歷凋亡、衰老、去分化或譜系重編程而停止產生ECM。然而，Bochaton-Piallat等［42］和Wynn等［43］均認為，如果損傷是慢性的或傷口愈合不受控制，肌成纖維細胞不受控制的刺激會導致纖維化瘢痕形成和器官功能喪失。Jun 等［38］發(fā)現(xiàn)，皮膚創(chuàng)傷的炎癥階段之后，CCN1 水平下降，但在愈合階段又上升。CCN 蛋白與皮膚創(chuàng)面修復關系密切，因此在肥胖、非酒精性脂肪肝等基礎代謝失調致使局部皮膚損傷以及損傷修復障礙的研究中，CCN蛋白可以作為一個新靶點和新方向。

4 結語

CCN 蛋白參與肥胖和非酒精性脂肪肝發(fā)生、發(fā)展過程中關鍵細胞信號通路的調控，但目前對于CCN 家族成員的蛋白生物學功能在肥胖和非酒精性脂肪肝中作用機制的研究較為有限，主要集中在CCN1 和CCN2 分子水平的調控和作用機制。因此，CCN 家族蛋白的生物學特性、作用機制和臨床應用有更廣闊的研究空間。這些研究對于今后進一步闡明肥胖和非酒精性脂肪肝發(fā)生、發(fā)展及預后的分子機制具有重要意義，而且CCN蛋白可能在基因診斷、基因治療及轉歸預后等方面有較大臨床應用前景。