羅明昊 ， 胡舒鵬 ， 王瑞鈺 ， 李 暢 ， 呂鼎一 ， 楊茜洋 ， 羅素新

（1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，2重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶400016）

血管內(nèi)皮作為循環(huán)血液與內(nèi)皮下組織的屏障，在調(diào)節(jié)血管通透性與免疫炎癥反應(yīng)方面具有關(guān)鍵性作用［1］。血管內(nèi)皮細胞中的內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）產(chǎn)生的一氧化氮（nitric oxide，NO）含量的異常會導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，這在糖尿病、動脈粥樣硬化以及膿毒血癥等血管炎癥性病變的早期發(fā)病機制中尤為重要［2-3］。血管的內(nèi)皮功能障礙主要機制之一為eNOS Ser1177磷酸化位點被抑制［4-6］。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）是使eNOS Ser1177 磷酸化的上游關(guān)鍵性調(diào)節(jié)激酶，AKT 功能增強可以激活eNOS，增加NO合成［7］。

炎癥細胞因子，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6等在體內(nèi)體外條件下都對血管內(nèi)皮具有損傷作用。IL-1主要是由活化的單核-巨噬細胞產(chǎn)生的關(guān)鍵性促炎細胞因子，是體內(nèi)作用最強的炎癥介質(zhì)之一，可分為IL-1α（細胞膜型）和IL-1β（分泌型）［8］。IL-1β為血液循環(huán)中存在的主要形式，其生物學(xué)作用非常廣泛，能介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)，能夠誘導(dǎo)下游幾百種二級炎癥因子的合成與表達，進而對炎癥起促進和放大的效應(yīng)［9］。目前尚不清楚 IL-1β 如何參與調(diào)控血管內(nèi)皮細胞eNOS 磷酸化。本研究以體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）為實驗對象，探討炎癥因子IL-1β 刺激對血管內(nèi)皮細胞eNOS Ser1177 磷酸化的影響及其可能的相關(guān)機制。

材料和方法

1 細胞提取與培養(yǎng)

實驗細胞為HUVECs，臍帶的來源為重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，選用膠原酶消化法，收集的細胞在M199 培養(yǎng)液［含有20%胎牛血清、20 mg/L內(nèi)皮細胞生長補充劑（endothelial cell growth supplement，ECGS）、100 mg/L 肝素、2 mmol/L L-谷氨酰胺和1%青-鏈霉素］、CO2恒溫培養(yǎng)箱（37℃、飽和濕度、5%CO2）中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞情況。選取第6～10 代細胞，增殖至80%左右時更換培養(yǎng)液后進行實驗。細胞鑒定按本課題組先前的報道［10］進行。此研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并取得所有涉及此項研究患者的同意。

2 實驗試劑與抗體

人重組TNF-α、人重組IL-1β 和人重組IL-6（Sigma-Aldrich）；AKT 特異性激動劑SC79（MedChemExpress）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和總NO 檢測試劑盒（Beyotime Biotechnology）；抗eNOS、peNOS-Ser1177、AKT和p-AKT-Ser473 抗體（Cell Signaling Technology）；羊抗兔Ⅱ抗（Proteintech）；其它相關(guān)但未提及化合物均購于Sigma或Sangon Biotech。

3 方法

3.1 實驗分組與實驗條件 將HUVECs 隨機分為對照組（control）組、TNF-α 處理組（10 μg/L TNF-α 處理1 h）、IL-1β 處理組（0.1、1、10 和100 μg/L IL-1β 處理 1 h，或者 1 μg/L IL-1β 處理 0.5、1、2和4 h）、IL-6處理組（50 μg/L IL-6 處理1 h）、單純SC79 處理組（5 μmol/L 處理 1 h）和 SC79+IL-1β 處理組（5 μmol/L SC79預(yù)處理1 h后1 μg/L IL-1β處理1 h）。藥物處理濃度均為細胞培養(yǎng)液中的終濃度，參考相關(guān)文獻［10-15］選取。

3.2 Western blot 冰上裂解60 min 提取HUVECs總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。每孔蛋白上樣量為30 μg，選用10%分離膠進行SDS-PAGE 后（濃縮膠80 V，分離膠120 V），100 V 100 min 濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。室溫下用3%～5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，分別加入相應(yīng)Ⅰ抗［抗eNOS 抗體（1∶2 000 稀釋）、抗peNOS-Ser1177 抗體（1∶1 000 稀釋）、抗 AKT 抗體（1∶2 000 稀釋）、抗 p-AKT-Ser473 抗體（1∶1 000 稀釋）］4℃孵育過夜。Ⅱ抗（1∶10 000 稀釋）孵育1 h 后，TBST 洗 3 次，每次 10 min。ECL 化學(xué)發(fā)光顯色，條帶用Image Lab 6.0 進行灰度值分析，以磷酸化蛋白與總蛋白灰度值的比值表示磷酸化水平的高低。

3.3 NO 含量檢測 收集各組HUVECs 培養(yǎng)液，按照總NO 檢測試劑盒步驟進行操作，檢測樣品中的硝酸鹽與亞硝酸鹽含量推算出總NO 的量。通過比色法在全波長酶標(biāo)儀上測定吸光度（A），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品測得標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測品A值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式算得培養(yǎng)液中NO含量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有的實驗數(shù)據(jù)來源于至少3 次獨立實驗結(jié)果，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用GraphPad Prism 8.0 軟件統(tǒng)計并作圖。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TNF-α、IL-1β和IL-6 處理 HUVECs 后 p-eNOSSer1177蛋白水平的變化

與對照組相比，IL-1β 干預(yù) HUVECs 1 h 后 peNOS-Ser1177 蛋白水平顯著下降（P＜0.05），而TNF-α和IL-6 處理 HUVECs 1 h 后 p-eNOS-Ser1177 蛋白水平與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

Figure 1.HUVECs were treated with TNF-α（10 μg/L），IL-1β（10 μg/L）and IL-6（50 μg/L）for 1 h，and the protein level of p-eNOS-Ser1177 in the HUVECs was detected by Western blot.Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group.圖1 TNF-α、IL-1β和IL-6 對 HUVECs 中 p-eNOS-Ser1177蛋白水平的影響

2 不同濃度的IL-1β 處理HUVECs 后p-eNOSSer1177蛋白水平的變化

用不同濃度（0.1、1、10 和100 μg/L）的IL-1β 處理HUVECs 1 h，結(jié)果顯示，與對照組相比，1、10 和100 μg/L 濃度處理組的 p-eNOS-Ser1177 蛋白水平均顯著降低（P＜0.05），見圖2。

3 IL-1β處理HUVECs不同時間后p-eNOSSer1177蛋白水平的變化

用IL-1β（1 μg/L）處理HUVECs 0.5、1、2 和4 h，結(jié)果顯示，與對照組相比，1、2 和4 h 處理組的peNOS-Ser1177 蛋白水平均顯著降低（P＜0.05），見圖3。

4 IL-1β處理HUVECs不同時間后培養(yǎng)液中NO含量的變化

Figure 2 HUVECs were treated with 0.1，1，10 and 100 μg/L IL-1β for 1 h，and the protein level of p-eNOSSer1177 in the HUVECs was detected by Western blot.Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs control group.圖2 不同濃度的IL-1β 處理HUVECs 后p-eNOS-Ser1177蛋白水平的變化

Figure 3.HUVECs were treated with IL-1β（1 μg/L）for 0.5，1，2 and 4 h，and the protein level of p-eNOSSer1177 in the HUVECs was detected by Western blot.Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group.圖3 IL-1β 處理 HUVECs 不同時間后 p-eNOS-Ser1177 蛋白水平的變化

用IL-1β（1 μg/L）處理HUVECs 0.5、1、2 和4 h，結(jié)果顯示，1、2 和4 h 處理組培養(yǎng)液中NO 含量較對照組均顯著降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 4.HUVECs were treated with IL-1β（1 μg/L）for 0.5，1，2 and 4 h，and the content of NO in the medium was detected by chemical colorimetry.Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group.圖4 IL-1β 處理HUVECs 不同時間后培養(yǎng)液中NO 含量的變化

5 IL-1β 處理 HUVECs 不同時間后 p-AKT-Ser473蛋白水平的變化

用IL-1β（1 μg/L）處理HUVECs 0.5、1、2 和4 h，結(jié)果顯示，0.5、1、2 和4 h 處理組p-AKT-Ser473 蛋白水平均較對照組顯著下降（P＜0.05），見圖5。

6 SC79預(yù)處理對IL-1β調(diào)節(jié)HUVECs 中 p-eNOSSer1177蛋白水平的影響

SC79 能顯著阻斷 IL-1β 對 HUVECs 中 p-eNOSSer1177 蛋白水平的下調(diào)作用（P＜0.05），單純SC79組p-eNOS-Ser1177 水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

7 SC79預(yù)處理對IL-1β調(diào)節(jié)HUVECs 培養(yǎng)液中NO含量的影響

SC79能顯著阻斷IL-1β對HUVECs培養(yǎng)液中NO含量的下調(diào)作用（P＜0.05），單純SC79 組細胞培養(yǎng)上清中的NO含量與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖7。

討 論

體外實驗中HUVECs 已被廣泛用于血管內(nèi)皮細胞相關(guān)的研究［5-6］，而本研究使用的HUVECs 已經(jīng)Ⅷ因子和CD31 的熒光染色實驗驗證為高純度（≥95%）的內(nèi)皮細胞［10］。

Figure 5.HUVECs were treated with IL-1β（1 μg/L）for 0.5，1，2 and 4 h，and the protein level of p-eNOSSer1177 in the HUVECs was detected by Western blot.Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group.圖5 IL-1β 處理 HUVECs 不同時間后 p-AKT-Ser473 表達水平的變化

Figure 6.HUVECs were pretreated with AKT agonist SC79（5 μmol/L）1 h before IL-1β（1 μg/L）treatment，and the protein level of p-eNOS-Ser1177 in the HUVECs was detected by Western blot.Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs IL-1β group.圖6 SC79預(yù)處理對IL-1β調(diào)節(jié)HUVECs 中 p-eNOSSer1177蛋白水平的影響

Figure 7.HUVECs were pretreated with AKT agonist SC79（5 μmol/L）1 h before IL-1β（1 μg/L）treatment，and the content of NO in the medium was detected by chemical colorimetry.Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs IL-1β group.圖7 SC79預(yù)處理對IL-1β 調(diào)節(jié)HUVECs培養(yǎng)液中NO 含量的影響

IL-1β 可通過調(diào)控 NF-κB 導(dǎo)致 HUVECs 中 eNOS蛋白表達量減少［11］，還可以使人內(nèi)皮細胞系ISOHAS 細胞 eNOS mRNA 的表達量降低［16］；還有研究報道IL-1β 可使視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞eNOS 蛋白表達量下降［17］。eNOS 功能的調(diào)控可以發(fā)生在基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和蛋白質(zhì)之間的相互作用等多個層面［2］。但目前的研究多集中于解釋IL-1β 如何使內(nèi)皮細胞eNOS啟動子活性降低（轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)）和影響mRNA 穩(wěn)定性（轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)）從而調(diào)控eNOS 的蛋白總量，而IL-1β 是否影響以及如何影響eNOS 的磷酸化位點國內(nèi)外尚無報道?？拷黣NOS 羧基端的Ser1177 位點是激活eNOS 功能一個關(guān)鍵的調(diào)控位點，在研究中常作為eNOS 活性的檢測位點。本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β 能濃度依賴性及時間依賴性地下調(diào)p-eNOS-Ser1177 蛋白水平，進而抑制eNOS 的活性，使NO 生成減少。已有大量文獻證實各種血管炎性病變中內(nèi)皮功能障礙的主要表現(xiàn)為eNOS 的Ser1177 位點磷酸化被抑制導(dǎo)致的NO 生成減少，具體是哪種炎癥因子起關(guān)鍵作用文獻報道不一［4］。本研究中用 TNF-α 與 IL-6 干預(yù) HUVECs，但p-eNOS-Ser1177 蛋白水平均無顯著變化，進一步證明在炎癥因子中IL-1β 對該位點的特異性。有相關(guān)動物研究報道，使用IL-1β 抑制劑可以顯著提高膿毒血癥小鼠生存率［18］；也有文獻報道，IL-1β 參與了醛固酮介導(dǎo)的小鼠血管內(nèi)皮舒張受損［19］。本研究通過體外實驗提示，IL-1β 可能通過抑制eNOS 的Ser1177 位點磷酸化而參與了血管內(nèi)皮功能障礙，在一定程度上解釋了IL-1β 在血管炎性病變早期中的作用。

作為eNOS 關(guān)鍵上游蛋白，AKT 已被證明可通過激活eNOS 顯著增強血管舒張，其過度表達導(dǎo)致靜息血管直徑和血流量顯著增加，而AKT 的功能被抑制則減弱了乙酰膽堿對內(nèi)皮依賴性血管舒張的反應(yīng)［20］。AKT 在參與高血壓的內(nèi)皮功能障礙中也發(fā)揮重要作用［21］。本實驗觀察到 IL-1β 干預(yù) HUVECs 后AKT 的Ser473 磷酸化水平下降且早于p-eNOSSer1177 的下降，激活A(yù)KT 功能可恢復(fù)eNOS 活性。這一結(jié)果提示AKT 活性被抑制是IL-1β 導(dǎo)致peNOS-Ser1177 蛋白水平降低及eNOS 活性降低的可能機制。IL-1β致使AKT活性下降的分子機制如何，本研究尚未完全闡明。本實驗沒有檢測AMP 活化蛋白激酶、蛋白激酶A 等其他eNOS 上游蛋白表達，無法確定這些蛋白功能的變化是否也參與IL-1β 下調(diào)p-eNOS-Ser1177 的過程。此外，本實驗主要研究eNOS Ser1177 磷酸化水平的變化，而對于 IL-1β 是否影響eNOS 的其他磷酸化位點如Thr495 位點或Ser633位點，還需要深入探討。

綜上所述，IL-1β 可能通過AKT 通路下調(diào)peNOS-Ser1177 蛋白水平，從而抑制eNOS 的活性；而AKT 特異性激動劑可使eNOS 活性恢復(fù)，進而起到保護血管內(nèi)皮功能的作用。