買(mǎi)文麗 ， 郭 洋 ， 佘光鵬 ， 呂寅春 ， 鄭 倩 ， 劉 華 △

（川北醫(yī)學(xué)院 1生理教研室，2機(jī)能中心，3形態(tài)研究所，4臨床醫(yī)學(xué)系，四川南充67000）

2017 年全球糖尿病患者已達(dá)到4.25 億，我國(guó)糖尿病患者高達(dá)1.14 億，為全球之首，其中，2 型糖尿病占糖尿病發(fā)病率的90%［1-2］。高血糖導(dǎo)致多器官損害，因此控制血糖是糖尿病治療的首要任務(wù)。目前2型糖尿病治療的口服藥物雖然眾多，但是均有較大的副作用，能否選用治療效果好副作用小的植物類降糖藥是目前研究的熱點(diǎn)。

作為物質(zhì)代謝的中心，肝臟在維持糖代謝穩(wěn)態(tài)中具有不可替代的作用［3］。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（glucose transporter 2，GLUT2）是肝細(xì)胞主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，其轉(zhuǎn)位水平或含量降低會(huì)導(dǎo)致攝取葡萄糖能力下降，使血糖升高［4］。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）是葡萄糖代謝通路中重要的酶，能調(diào)控葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，G-6-P）的含量［5］，而糖原合酶（glycogen synthase，GS）能將G-6-P 變?yōu)樘窃瑑?chǔ)存于肝細(xì)胞。因此GLUT2-G6PD-GS 途徑是糖原儲(chǔ)存的重要途徑，在調(diào)節(jié)血糖方面的研究也備受關(guān)注。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中兒茶素的主要成分，占兒茶素總量的10%～15%。Ueda-Wakagi 等［6］證實(shí)，EGCG通過(guò)刺激骨骼肌中GLUT4 轉(zhuǎn)位來(lái)增加葡萄糖攝取，從而改善糖尿病嚙齒動(dòng)物的血糖水平。肝臟發(fā)生胰島素抵抗后，肝糖異生和糖原分解能力提高，導(dǎo)致肝臟葡萄糖輸出增加，血糖升高［7］。EGCG 具有激活細(xì)胞特異信號(hào)通路，改善靶組織對(duì)胰島素敏感度的作用［8］。但 EGCG 通過(guò) GLUT2-G6PD-GS 信號(hào)通路調(diào)節(jié)血糖的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本項(xiàng)工作探討EGCG對(duì)2 型糖尿病大鼠的降糖作用，并了解其是否通過(guò)GLUT2-G6PD-GS信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)血糖的調(diào)控。

材料和方法

1 動(dòng)物

清潔級(jí)4 周齡雄性健康SD 大鼠60 只，由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重（120±20）g。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。動(dòng)物合格證號(hào)SYXK（川）2018-076。

2 藥品

EGCG（批號(hào)為1220C022）和鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ；批號(hào)為615F031）均購(gòu)自Solarbio；高脂飼料（D12492）購(gòu)自Research Diets。

3 主要試劑

血糖試紙（批號(hào)為3825NS）購(gòu)自三諾有限公司；糖化血紅蛋白試劑盒（批號(hào)為20180306）和胰島素試劑盒（批號(hào)為20180317）均購(gòu)自南京建成生物研究所；抗GLUT2 抗體（批號(hào)為00051063）購(gòu)自Protentech；BCA 蛋白測(cè)定盒（批號(hào)為14G08A46）購(gòu)自博士德公司；高碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）糖原染色試劑盒（批號(hào)為20190704）購(gòu)自Solarbio；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)為AJ60874A）和定量PCR試劑盒（批號(hào)為AJ12469A）均購(gòu)自TaKaRa。

4 主要方法

4.1 動(dòng)物分組和模型的建立 2型糖尿病大鼠模型的建立參照既往方法［9］。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后高脂飼料喂養(yǎng) 4 周，空腹12 h 后給予 STZ（25 mg/kg），腹腔注射，注射前用pH 4.5 枸櫞酸緩沖液配成1%濃度，正常組大鼠用等量枸櫞酸緩沖液處理，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4 周后采尾靜脈血測(cè)定空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）和空腹血清胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)INS），并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI），以FBG≥11.1 mmol/L 作為 2 型糖尿病模型判斷標(biāo)準(zhǔn)［10-12］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)立5 組，每組10 只：正常（control，Con）組、糖尿病模型（model，M）組、二甲雙胍（metformin，Met；200 mg/kg）組、低劑量（50 mg/kg）EGCG（EL）組和高劑量（100 mg/kg）EGCG（EH）組［13］。Met和EGCG 持續(xù)灌胃給藥 8 周，其余2 組均灌服生理鹽水（0.1 mL/kg）。動(dòng)物飼養(yǎng)于川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由飲水，治療期間，全部大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間定期檢測(cè)動(dòng)物FBG和FINS 水平。8 周后，M 組大鼠死亡一只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于治療8周末空腹12 h，從心臟采血制備血漿和血清標(biāo)本，-80℃保存待測(cè)；斷髓處死動(dòng)物，每組動(dòng)物摘取部分肝臟迅速凍存于液氮中待測(cè)，再取部分肝臟4%多聚甲醛固定做石蠟切片。

4.2 血糖和胰島素檢測(cè) 取大鼠尾靜脈血測(cè)定血糖，用血糖儀及配套的試紙定期檢測(cè)，方法參照說(shuō)明書(shū)。胰島素測(cè)定具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

4.3 糖化血紅蛋白檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于治療8 周末空腹12 h，然后從心臟采血2 mL，肝素抗凝，1 500×g離心 30 min，取上清，加入 96 孔板，按 ELISA 試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測(cè)量結(jié)果。

4.4 PAS 染色 將石蠟包埋的肝組織切片，厚度設(shè)定為5 μm，每個(gè)組織切3 片，根據(jù)PAS 染色試劑盒使用說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，高倍鏡鏡檢、拍照、保存圖片。

4.5 real-time PCR 檢測(cè) G6PD mRNA 的表達(dá) 液氮冷凍加入Trizol快速研磨肝臟組織提取總RNA，然后RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用特異性引物對(duì)cDNA 進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增。G6PD 的正向引物序列為5'-ACCGCATCGACCACTACCT-3'，反向引物序列為5'-TGGGGCCGAAGATCCTGTT-3'。PCR 條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，60℃延伸30 s，循環(huán)40次；之后進(jìn)行熔解曲線分析。以βactin 為內(nèi)參照，用 2-ΔΔCt法測(cè)定 G6PD mRNA 的相對(duì)表達(dá)量［14］。

4.6 Western blot 法檢測(cè)大鼠肝臟中GS 和GLUT2的表達(dá) 在冰上研磨肝組織，離心30 min，取上清液，BCA 法測(cè)蛋白濃度，加上樣緩沖液后進(jìn)行蛋白變性備用。12% SDS-PAGE 分離蛋白，半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)至PVDF 膜后，5% BSA 封閉 2 h，分別加入兔抗 GS 和GLUT2 多克隆抗體（1∶1 000），4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST 洗滌 6 次，每次 5 min，然后加入 HRP 標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶2 000），搖床上孵育1 h，TBST 洗滌6次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光顯影，在凝膠成像系統(tǒng)Fusion Fx5 Spectra 進(jìn)行曝光和拍照，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析［15-16］。

4.7 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)GLUT2 將固定在4%多聚甲醛的肝臟組織經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，隨后進(jìn)行連續(xù)切片厚度5 μm，切片于37℃過(guò)夜，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，于37℃用過(guò)氧化氫孵育10 min 以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響，隨后用檸檬酸緩沖液100℃，15 min，之后加入Ⅰ抗（抗GLUT2 抗體，1∶150），4℃孵育過(guò)夜，PBS 清洗3 次之后滴加Ⅱ抗，免疫組化反應(yīng)通過(guò)使用SABC 擴(kuò)增，用3'-3-二氨基聯(lián)苯胺顯色，并用蘇木精復(fù)染。使用ImageJ圖像分析軟件分析［14］。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EGCG干預(yù)前各組大鼠FBG、FINS和ISI的變化

與 Con 組比較，M、Met、EL和EH 組大鼠 FBG、FINS 和體重均顯著升高（P＜0.05），ISI顯著降低（P＜0.01）；M、Met、EL 和EH 組大鼠FBG、FINS、體重和ISI的組間比較均無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 EGCG干預(yù)前各組大鼠FBG、FINS和ISI的變化Table 1.The levels of FBG，F(xiàn)INS and ISI in rats of different groups before EGCG intervention（Mean±SD. n=10）

2 EGCG干預(yù)后各組大鼠FBG、FINS和ISI的變化

與 Con 組比較，M 組大鼠 FBG 與 FINS 均顯著升高（P＜0.05），體重顯著降低（P＜0.05），ISI 顯著降低（P＜0.01）；與 M 組比較，Met、EL和EH 組 FBG 與FINS 均顯著降低（P＜0.05），ISI 顯著升高（P＜0.01），Met 和EH 組體重顯著升高（P＜0.05）；Met、EL 和EH組大鼠FBG、FINS 與ISI 的組間比較均無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表2。

3 EGCG對(duì)糖化血紅蛋白的影響

與Con 組比較，M 組大鼠糖化血紅蛋白顯著升高（P＜0.05）；與M組比較，給藥組大鼠糖化血紅蛋白均顯著降低（P＜0.05）；給藥組之間糖化血紅蛋白無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

表2 EGCG干預(yù)后各組大鼠FBG、FINS和ISI的變化Table 2.The levels of FBG，F(xiàn)INS and ISI in rats of different groups after EGCG intervention(Mean±SD)

Figure 1.The levels of glycosylated hemoglobin in different groups.Mean±SD. n=9.#P＜0.05 vs Con group；*P＜0.05 vs M group.圖1 各組大鼠糖化血紅蛋白的變化

4 肝組織糖原PAS染色

Con 組、Met 組和EH 組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)大量特征性玫瑰紅糖原顆粒，而M 組胞質(zhì)內(nèi)幾乎見(jiàn)不到玫瑰紅糖原顆粒，EL 組胞質(zhì)中可見(jiàn)少量糖原顆粒，淀粉酶消化后，上述陽(yáng)性顆粒消失，見(jiàn)圖2。

5 EGCG對(duì)肝組織G6PD mRNA的影響

與 con 組比較，m 組大鼠肝臟 G6PD mRNA 顯著降低（P＜0.05）；與m 組比較met 組和EH 組大鼠肝臟G6PD mRNA 顯著增高（P＜0.05）；Met和EH 給藥組之間大鼠肝臟G6PD mRNA 無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

6 EGCG對(duì)肝組織GLUT2和GS蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果表明，與 con 組大鼠比較 m 組大鼠肝臟GS 的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與m 組比較met 組和EH 組大鼠肝臟GS 的蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。與con 組比較m 組肝細(xì)胞GLUT2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），與m 組比較met 組和EH 組大鼠肝細(xì)胞GLUT2 的蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)圖4、5。

7 EGCG對(duì)肝組織GLUT2蛋白表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，未受刺激時(shí)GLUT2 大量分布在胞質(zhì)；與Con 組比較，M 組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)棕色GLUT2顆粒明顯減少；與M組比較，給藥組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)棕色GLUT2 顆粒明顯增加，EH 組肝細(xì)胞胞質(zhì)中棕色GLUT2顆粒較EL組明顯增加，見(jiàn)圖6。

Figure 2.Glycogen in hepatic tissues of different groups was detected by PAS staining（shown by arrows）.Scale bar=20 μm.A：Con group；B：M group；C：Met group；D：EL group；E：EH group.圖2 各組大鼠肝組織糖原合成情況

Figure 3.Relative mRNA expression levels of G6PD in hepatic tissues of each group.Mean±SD. n=9.#P＜0.05 vs Con group；*P＜0.05 vs M group.圖3 各組大鼠肝組織G6PD mRNA的表達(dá)

Figure 4.The protein expression levels of GLUT2 in hepatic tissues of different groups detected by Western blot.Mean±SD. n=6.#P＜0.05 vs Con group；*P＜0.05 vs M group.圖4 各組大鼠肝組織GLUT2蛋白水平表達(dá)

討 論

Hu等［17］的研究顯示過(guò)去30年來(lái)，中國(guó)糖尿病患病率急劇增加，已成為全球糖尿病患者人數(shù)最多的國(guó)家，對(duì)糖尿病動(dòng)物模型的研究有利于人類對(duì)糖尿病發(fā)病機(jī)制和治療的探索。高脂飼養(yǎng)+小劑量STZ腹腔注射，是目前復(fù)制2 型糖尿病大鼠普遍選用的方法［18］。本研究模型組大鼠多次空腹血糖≥11.1 mmol/L，EGCG 干預(yù)前大鼠 FBG和FINS 水平均顯著升高，ISI 顯著降低，表明模型大鼠病理特點(diǎn)與2 型糖尿病病理相符，說(shuō)明造模成功［10-12］。經(jīng)二甲雙胍和EGCG 治療后FBG 在正常范圍，F(xiàn)INS 水平和糖化血紅蛋白顯著降低，ISI 顯著升高，但EL 組治療效果弱于EH組，證明EGCG 確實(shí)可以減低血糖，改善2型糖尿病癥狀，與前期研究結(jié)果相符［6］。

Figure 5.The protein expression levels of GS in hepatic tissues of different groups detected by Western blot.Mean±SD. n=6.#P＜0.05 vs Con group；*P＜0.05 vs M group.圖5 各組大鼠肝組織GS蛋白水平表達(dá)

生理狀態(tài)下，肝臟的糖原合成、分解以及糖異生處于動(dòng)態(tài)平衡，從而維持血糖濃度的穩(wěn)定［19］。餐后糖原儲(chǔ)存能力可以反應(yīng)肝臟的胰島素敏感性［7］，本研究中正常組大鼠肝糖原儲(chǔ)備豐富，而模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)僅見(jiàn)散在少許糖原顆粒，說(shuō)明模型組大鼠肝細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗，導(dǎo)致糖原儲(chǔ)存障礙。而給藥組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)豐富糖原顆粒，說(shuō)明EGCG確實(shí)有改善胰島素抵抗的作用，與之前報(bào)道一致［20］。

餐后葡萄糖進(jìn)入肝臟最主要的路徑就是經(jīng)GLUT 途徑進(jìn)行的轉(zhuǎn)運(yùn)，肝細(xì)胞內(nèi)主要是 GLUT2［21］。本研究中模型組大鼠肝臟GLUT2 水平顯著降低，考慮與STZ 的毒性破環(huán)，使肝細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，導(dǎo)致 GLUT2 蛋白表達(dá)減少［22-23］有關(guān)。本研究中 Met 和EH 組大鼠肝臟GLUT2 蛋白表達(dá)顯著增高，表明EGCG 可通過(guò)改善肝細(xì)胞的胰島素抵抗，促進(jìn)GLUT2蛋白合成，并且表現(xiàn)出劑量依賴性。

肝糖原的GLUT2-G6PD-GS 合成路徑中，GLUT2是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的門(mén)戶，GS 是糖原合成中的限速酶［24］，G-6-P 是 GS 的變構(gòu)激活劑［25］，能激活 GS。因此，GS 的變構(gòu)狀態(tài)和G6PD 含量影響糖原合成。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠G6PD mRNA 含量下降，而Met 和EH 組 G6PD mRNA 顯著高于模型組，表明 EGCG 可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平影響G6PD mRNA 表達(dá)，增加G6PD合成，有利于調(diào)節(jié)G-6-P 含量，降低血糖。模型組總GS蛋白水平顯著下降，而給藥組GS蛋白水平顯著增高，可能是模型組GS 過(guò)度磷酸化，而EGCG 能減輕GS 磷酸化程度，更好的促進(jìn)糖原合成。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)高劑量EGCG 對(duì)給藥組大鼠GLUT2/G6PD/GS 改善作用優(yōu)于低劑量，表現(xiàn)出EGCG 治療的劑量依賴性。但本研究中GS 磷酸化水平的檢測(cè)未涉及，這也是研究的不足之處，在后續(xù)的研究中，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

Figure 6.Expression of GLUT2 in hepatic tissues of different groups was detected by immunohistochemical staining（shown by arrows）.Scale bar=20 μm.A：Con group；B：M group；C：Met group；D：EL group；E：EH group.圖6 各組大鼠肝組織GLUT2的分布

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中給予EGCG 后糖尿病大鼠空腹血糖、空腹胰島素水平和糖化血紅蛋白均降低，同時(shí)肝糖原含量增加，說(shuō)明EGCG 通過(guò)增加肝糖原儲(chǔ)存來(lái)降低血糖。進(jìn)一步研究顯示給予EGCG 后大鼠肝細(xì)胞膜上GLUT2 和G6PD mRNA 表達(dá)增加，GS蛋白水平增加，證明EGCG 確實(shí)可以通過(guò)影響GLUT2-G6PD-GS 路徑，增加肝糖原合成和儲(chǔ)存，最終實(shí)現(xiàn)降低血糖改善糖尿病的作用。