柯文玲，趙艷雪

(十堰市婦幼保健院兒科，湖北 十堰 442000)

呼吸道上皮細胞是人類流行性感冒(流感)病毒的主要靶細胞[1]。長期以來，上皮細胞一直被認為是免疫系統(tǒng)中的被動介質(zhì)，其主要功能是作為物理化學(xué)屏障，阻止入侵的病原體進入黏膜下層或呼吸系統(tǒng)。目前，上皮細胞對抗病毒免疫的生理作用尚未明了[2-3]。呼吸道上皮細胞對肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)、病毒免疫和流感誘導(dǎo)的免疫病理有積極作用。流感病毒感染過程中引起免疫病理的機制已被充分證實，先天免疫和適應(yīng)性免疫都參與其中[4-5]。宿主暴露于某種病原體后的結(jié)果取決于宿主抵抗和耐受感染的能力，抗性通過抑制病原體復(fù)制和促進病原體清除來保護宿主，這一過程主要是由先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)介導(dǎo)[6-7]。耐受性是指在不影響病原體負擔(dān)的情況下，通過限制組織損傷來改善疾病結(jié)果的能力[7]。過度活躍的免疫反應(yīng)會導(dǎo)致嚴重的組織損傷，從而對疾病產(chǎn)生負面影響[8]。本研究探究甲型流感病毒感染后粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)過表達對M1樣氣道單核細胞巨噬細胞極化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性NC/Nga小鼠60只，8周齡，由湖北省醫(yī)科院動物中心提供。小鼠被安置于一空調(diào)房，維持在12 h光照/黑暗循環(huán)狀態(tài)，保持在(24±2)℃和(55±15)%濕度下，隨意取食食物和水。

1.2 甲型流感病毒感染模型的建立和分組

甲型流感病毒感染模型的建立：實驗前，所有小鼠抗流感病毒核蛋白抗體測試呈陰性。小鼠在BSL2生物安全箱中被感染，經(jīng)氣管注射15 mL的甲型流感病毒懸液(FLUAVsw[A/swine/Kitzen/IDT6142/2007；H1N2]107.25 50%組織培養(yǎng)感染劑量[TCID50]/mL)，劑量1.2 mg·kg-1。

實驗分組：模型建立后，采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為甲型流感病毒感染組(對照組，n=30)和GM-CSF過表達組(過表達組，n=30)。過表達組小鼠規(guī)范使用支氣管鏡將重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)凝膠(10 μg·cm-2)(長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司)涂抹在支氣管，建立GM-CSF過表達模型。所有小鼠關(guān)在過濾器頂部的微隔離籠中。感染期間，每天觀察小鼠2次，評估發(fā)病率和病死率。

1.3 GM-CSF的誘導(dǎo)過表達實驗

GM-CSF基因的擴增：首先提取小鼠呼吸道組織總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法擴增GM-CSF基因片段，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中的GM-CSF基因序列設(shè)計擴增編碼GM-CSF基因的引物序列。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)之后，72 ℃ 5 min終止反應(yīng)。

GM-CSF原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建：分別用EcoR Ⅰ切PCR產(chǎn)物，XholⅠ雙酶切pET22b(+)質(zhì)粒DNA，插入pET22b(+)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta-gami(2)，獲得工程菌Rosetta-gami(2)-pET22ab(+)/GM-CSF。隨后采用SDS電泳收集目的片段，將GM-CSF基因經(jīng)T4 DNA連接酶導(dǎo)入pET22b(+)質(zhì)粒上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞。取構(gòu)建成功的pET22b(+)/GM-CSF質(zhì)粒導(dǎo)入大腸埃希菌表達菌株Rosetta-gami(2)感受態(tài)細胞。

GM-CSF的誘導(dǎo)過表達及純化：將Rosetta-gami(2)-pET22b(+)/GM-CSF接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1震蕩30 min，加入終濃度為0.5 mmol·L-1異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，30 ℃、200 r·min-1繼續(xù)震蕩培養(yǎng)6 h，離心收集菌細胞后，采用超聲破碎細胞，繼續(xù)離心得到細胞內(nèi)物質(zhì)。參照美國GE公司HisTrapTM FF親和層析柱說明書對表達的重組融合蛋白進行純化和鑒定。

1.4 觀測指標及方法

1.4.1 各組小鼠肺功能指標的測定

分別用氯胺酮/木拉嗪(130 mg·kg-1和10 mg·kg-1,i.p)麻醉小鼠，氣管插管采用19 G鈍針氣管造口，用縫線固定氣管插管，控制小鼠持續(xù)吸入1%～5%的異氟烷保持鎮(zhèn)靜。使用Flexivent小動物肺功能儀對全部小鼠在脈沖振蕩下的靜息呼吸進行頻譜分析，測定其呼吸力學(xué)參數(shù)。然后對小鼠進行支氣管肺泡灌洗(BAL)，每只小鼠取灌洗液150 g，離心10 min后移除上清液，并立即將標本在-80 ℃醫(yī)用冰箱冷凍保存。所有標本嚴格按照試劑盒說明測定BAL蛋白表達。在450 nm處，使用SpectraMax M2 UV/Vis/熒光96-384平板閱讀器測量ELISA平板的吸光度。采用ELISA或Luminex Magpix多重陣列(應(yīng)用ProcartaPlex cytokine & chemokine 36plex mouse panel 1A)檢測細胞因子CCL17、CXCL9和MMP12的BAL蛋白表達情況。所有小鼠處死后，取支氣管上皮細胞在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入常規(guī)雙抗，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當其匯合生長形成單層細胞，加入0.25%胰蛋白酶進行消化，制成單細胞懸液。在4 ℃的漢克平衡鹽溶液(HBSS)中，使用3%熒光標記的單克隆抗體對細胞進行表面染色，接種于24孔的培養(yǎng)板上。

1.4.2 免疫熒光顯微鏡觀察巨噬細胞的單核細胞分離、分化和極化

染色后的細胞標本脫蠟后置于檸檬酸緩沖液中蒸沸3 min后冷卻至室溫，重蒸1次，然后冷卻至室溫；37 ℃下，用10%山羊血清封閉標本30 min，PBS清洗；分別用1:100稀釋的PE-anti CD 197(CCR-7)、MMR和兔抗-LC3抗體4 避光染色1 h；PBS清洗；用于LC3染色的切片加入Dylight405-羊抗兔抗體，4 ℃避光染色1 h；PBS清洗；磷酸甘油緩沖液封片后于熒光顯微鏡下以相應(yīng)波長激發(fā)光激發(fā)后觀察、拍照和分析。使用Winview32和Micro-Manager(www.Micro-Manager.org)軟件包控制圖像采集。使用ImageJ軟件對與鼠腦地圖集比較識別的目標區(qū)域進行圖像處理，包括對背景圖像進行減法、去除隨機亮點(使用despeckle濾波算法、ImageJ)以及均勻調(diào)整整個圖像的亮度和對比度。強度尺度坡度按獲得圖像的時間進行縮放和規(guī)范化，用RLU/min表示。利用生物發(fā)光圖像上的RainbowRGB查找表(LUT)生成偽彩色圖像。利用ImageJ對roi進行分析，將roi歸一化為目標區(qū)域到非目標區(qū)域。

1.4.3 M1樣氣道單核/巨噬細胞極化標記基因的表達

采用SYBR Green進行實時熒光PCR反應(yīng)，分析M1樣標記物的mRNA表達，并計算極化程度(引物序列見表1)。使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)從組織提取總RNA。使用Prime-Script RT試劑盒(美國TaKaRa 公司)進行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取2 μL cDNA 進行熒光定量PCR，25 μL反應(yīng)體系含Taq酶12.5 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各0.5 μL，3 μmol·L-1TaqMan-MGB探針1 μL，ddH2O 8.5 μL。所有引物均由Invitrogen Corp構(gòu)建。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 60 s和10 s，60 ℃ 30 s擴增40個循環(huán)，讀取熒光(60 ℃)。陰性對照組是將cDNA 模板換成等體積的ddH2O。絕對定量的標準曲線制作：將標準品分別稀釋10的3、4、5、6、7個次方作為模板，反應(yīng)液配置、反應(yīng)條件和參數(shù)與PCR相同。使用SDS軟件(Applied Biosystems，HT7900，美國)計算基因表達的相對水平。

表1 RT-PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠感染流感病毒的發(fā)病率和病死率

過表達組小鼠的發(fā)病率和病死率均低于對照組(均P<0.05)，見表2。

2.2 小鼠肺功能指標的測定結(jié)果

對照組的肺力學(xué)參數(shù)、壓力容積曲線(pressure-volume curve，PV曲線)的曲率小于過表達組(均P<0.05)，對照組呼吸系統(tǒng)總阻力和組織或外圍氣道阻力大于過表達組(P<0.05)，表明GM-CSF過表達改善了甲型流感病毒感染對呼吸力學(xué)的影響。見表3。

表2 2組小鼠流感發(fā)病率和病死率比較

表3 2組小鼠呼吸力學(xué)參數(shù)的比較

過表達組細胞因子CCL17、CXCL9和MMP12的BAL蛋白表達水平高于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 2組小鼠BAL蛋白測定的結(jié)果

表4 2組小鼠BAL蛋白測定的結(jié)果

組別nCCL17CXCL9MMP12對照組 30224.00±20.303.21±1.0442.19±5.07過表達組30315.00±31.6012.73±3.25103.06±13.09t19.71317.23512.763P0.0060.0070.004

2.3 M1樣氣道單核/巨噬細胞極化相關(guān)標記基因的表達

對照組中巨噬細胞M1樣mRNA水平較高，其中TNF-α、MCP-1、IL-6 mRNA表達水平高于過表達組(均P<0.05)；對照組的組織中CD11b+標記氣道單核細胞/巨噬細胞極化高于過表達組(P<0.05)。提示正常組織中巨噬細胞以M2型為主，減少炎癥反應(yīng)。見圖1和表5—6。

表5 組織巨噬細胞極化相關(guān)標記基因的表達

表6 巨噬細胞表面分子的百分比

3 討論

單核細胞/巨噬細胞被認為是可塑性細胞，根據(jù)其微環(huán)境可分化為促炎(PRO-炎性，即M1)亞型，也稱為經(jīng)典活化亞型，或消炎或交替活化亞型(anti-activated subtype，M2)，小鼠極化單核細胞/巨噬細胞的表型標記已得到廣泛的研究[9-10]。

本文證明GM-CSF過表達抑制M1樣氣道單核細胞/巨噬細胞極化，暗示極化以M2樣抗炎為主，減少炎癥反應(yīng)從而改善了甲型流感病毒感染對肺力學(xué)的影響。巨噬細胞在機體對微生物的先天免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用，是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)[11]。它們的表型異質(zhì)性現(xiàn)在已得到充分認識，并已被證明取決于微環(huán)境，特別是與生長因子和細胞因子有關(guān)[12]。DUNN等[13]證明在這些因素中，(GM-CSF)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)是主要的，在單核細胞/巨噬細胞與單核細胞的分化中起著重要作用。GM-CSF和M-CSF生成的單核細胞/巨噬細胞有一些共同的識別模式，但也有一些基因標記表達不同，單核細胞/巨噬細胞之間的另一種異質(zhì)性與它們的激活/極化狀態(tài)有關(guān)[14]。FENG等[15]進一步對mRNA表達分析鑒定了M1極化的6個標志物(IL-12p35、CXCL10、CXCL11、CCL5、CCR7、IDO1)、M2極化的5個標志物(TGF-b、CCL14、CCL22、SR-B1、PPARc)和參與單核細胞/巨噬細胞極化的轉(zhuǎn)錄因子，與病毒感染后期趨化因子CCL2表達的強烈抑制有關(guān)。先天免疫系統(tǒng)檢測甲型流感至少有3種不同的機制[16-18]。首先，細胞質(zhì)受體RIG-I檢測5′-三孢?；鞲胁《净蚪M片段。在無病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)的情況下，RIG-I誘導(dǎo)產(chǎn)生一種強抗病毒型干擾素應(yīng)答。其次，toll樣受體如TLR3和TLR7檢測病毒相關(guān)的RNA分子。GM-CSF已被ZHU等[19]證明在幾個癌癥模型中促進MDSCs的招募和擴增。GM-CSF受體信號通過信號轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)的激活劑傳遞與肝外髓細胞PD-L1表達相關(guān)。16STAT3也被證明可以調(diào)節(jié)乳腺癌MDSCs中IDO的表達。JAROSZBIEJ等[20]發(fā)現(xiàn)GM-CSF驅(qū)動L-MDSC的擴增，推測GM-CSF通過STAT3信號通路誘導(dǎo)L-MDSC IDO和PD-L1表達，表明GM-CSF是L-MDSC IDO/PDL-1表達的關(guān)鍵驅(qū)動因子，也是增強肝內(nèi)抗腫瘤免疫的潛在機制靶點。

由于巨噬細胞的極化特性在培養(yǎng)的小鼠細胞中已經(jīng)基本得到了表征，且小鼠和人類之間還存在生物學(xué)差異，因此還需進一步對人類單核細胞/巨噬細胞的M1/M2表型標記進行深入研究。此外，用于從單核細胞中獲得單核細胞/巨噬細胞的生長因子，即GM-CSF或M-CSF的性質(zhì)，可能會影響其分化成特定亞型的能力。

綜上所述，GM-CSF過表達改善了甲型流感病毒感染對肺力學(xué)的影響，抑制M1樣氣道單核細胞/巨噬細胞極化則暗示極化以M2樣為主，減少炎癥反應(yīng)。