鐘琳陽，江 健，方龍君，馮 珍

(南昌大學(xué)a.研究生院醫(yī)學(xué)部2017級； b.第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,南昌 330006)

全球傷殘和死亡的主要原因中腦外傷(TBI)占首位，流行病學(xué)顯示每10萬個人中就有73個人會因意外發(fā)生腦外傷，專家預(yù)測在2020年腦外傷將成為全球第三大疾病負擔[1]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷進步，TBI患者的病死率明顯下降，但仍有約14%的患者在手術(shù)治療后不能蘇醒，長期處于最小意識狀態(tài)(MCS)和持續(xù)植物狀態(tài)(PVS)，這不僅嚴重影響了疾病的發(fā)展和預(yù)后，降低了患者的生存質(zhì)量，還給家庭及社會造成了嚴重的精神壓力和經(jīng)濟負擔[2]。因此TBI昏迷患者的有效促醒具有重要的意義。

目前，臨床上對TBI昏迷促醒的主要方法包括：藥物治療、高壓氧治療、感覺刺激、干細胞移植和神經(jīng)電刺激等[3-6]。神經(jīng)電刺激主要包括迷走神經(jīng)電刺激、正中神經(jīng)電刺激、經(jīng)顱直流電治療以及深部腦刺激(deep brain stimulation,DBS)。有研究[7]表明，DBS能通過刺激TBI患者腦內(nèi)相應(yīng)靶點來提高患者的意識狀態(tài)水平。YAMAMOTO等[8-9]研究表明，對TBI造成的PVS患者的腦內(nèi)相應(yīng)靶點進行刺激后，患者大腦內(nèi)局部血流量(CBF)明顯增加，意識狀態(tài)發(fā)生改變，并出現(xiàn)了覺醒反應(yīng)。然而，當前DBS對TBI患者昏迷促醒的機制尚不明確，有學(xué)者[10]認為，中樞神經(jīng)遞質(zhì)Orexins及其受體(OX1R)在TBI昏迷促醒中扮演著關(guān)鍵作用。本課題組的前期研究中，通過迷走神經(jīng)電刺激對TBI昏迷大鼠進行促醒，測得蘇醒后的大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)(PFC)Orexins受體OX1R水平升高，提示中樞神經(jīng)遞質(zhì)Orexins及其受體OX1R在TBI昏迷促醒中扮演著關(guān)鍵作用[11]。本研究旨在探討DBS對TBI昏迷大鼠的促醒效果及對PFC區(qū)OX1R表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料及儀器

普通級，體重250～300 g的成年Sprague-Dawley大鼠54只，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部動科部提供，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周后開始實驗?？筄XlR抗體(ab77370，香港Abcam有限公司)、抗GADPH單克隆抗體(ab181602，香港Abcam有限公司)、組織蛋白抽提試劑盒(CWB10，北京康為世紀生物科技有限公司)、ZS-BS數(shù)顯腦立體定位儀(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)、電刺激儀(ES-420，日本伊藤超短波株式會社)、切片機(RM2015，LEICA)、平頭微量進樣器(10 μL，寧波鎮(zhèn)海三愛儀器廠)、牙科鉆(上海美耐特實業(yè)有限公司)。

1.2 動物分組及模型建立

將54只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為3組：空白對照組(n=18，不做任何處理)；對照組(n=18)和DBS組(n=18)通過自由落體撞擊大鼠腦部建立腦外傷昏迷大鼠模型，造模成功后對照組大鼠丘腦植入電極，但不予DBS，DBS組大鼠丘腦植入電極，并予DBS。

通過吸入乙醚麻醉大鼠，然后使其自然呼吸空氣。麻醉后，進行5 mm垂直切口以暴露顱骨。用注射器針頭在靠近左中線2 mm處和冠狀縫合線前1 mm處標記沖擊目標。接下來，從38～42 cm的垂直高度落下一個圓柱形沖擊錘(質(zhì)量400 g，直徑2 cm)，使大鼠頭部產(chǎn)生顱骨的凹陷骨折。造模成功后，縫合頭部皮膚，關(guān)閉切口，對每只造模成功大鼠進行消毒并置于籠中[12]。共有10只大鼠在造模過程中死亡(死亡率為19%)，補充同等數(shù)量的大鼠繼續(xù)造模。

1.3 意識狀態(tài)評估

造模成功后1 h根據(jù)大鼠的感覺、運動功能，按照意識狀態(tài)水平6級評分法將大鼠分為6級：Ⅰ級，可正常在籠內(nèi)活動；Ⅱ級，在籠內(nèi)活動的頻率減少；Ⅲ級，在籠內(nèi)活動的評率明顯減少并并伴有運動失調(diào)；Ⅳ級，將大鼠翻轉(zhuǎn)放在桌面上，大鼠能左右滾動(翻轉(zhuǎn)反射存在)，但不能站立；Ⅴ級，將大鼠翻轉(zhuǎn)放在桌面上，大鼠不能左右滾動(翻正反射消失)但用力捏大鼠四肢，肢體有回縮反應(yīng)(對疼痛刺激有反應(yīng))；Ⅵ級，對任何刺激無反應(yīng)。根據(jù)意識狀態(tài)6級評分法中規(guī)定意識狀態(tài)Ⅴ級和Ⅵ級的大鼠為昏迷狀態(tài)[13]。

1.4 深部腦電刺激

建立昏迷大鼠模型后1 h，將對照組和DBS組大鼠剝離骨膜，利用三維立體定向儀將同軸雙極鉑銥合金電極置入雙側(cè)丘腦(距前囟點后：-1.70 mm，外：±1.00 mm，深-3.00 mm)，通過CT定位明確電極已植入丘腦部位，給予連續(xù)的丘腦電刺激(Deep brain stimulation,DBS)。刺激參數(shù)：頻率200 Hz：脈寬0.1 ms；電壓2～4 V;刺激方式：依次刺激左側(cè)和右側(cè)丘腦，左右交替刺激，每次5 min，持續(xù)1 h[14]。

1.5 組織提取及檢測方法

在DBS結(jié)束后，再次評定大鼠意識狀態(tài)。在DBS刺激完成后的12 h，將3組大鼠每組分別處死6只大鼠用來組織提取和檢測，剩余大鼠依據(jù)動物倫理學(xué)，斷頭處理。用10%水合氯醛(0.1 g·mL-1)給每組用來檢測的大鼠腹腔注射，使大鼠深度麻醉，深度麻醉后，向大鼠心臟灌注4%多聚甲醛至大鼠全身僵硬死亡。用組織蛋白抽提試劑盒提取大鼠PFC區(qū)組織蛋白，冷凍離心處理后，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。運用Western-blot(WB)、免疫熒光技術(shù)分別測定3組大鼠PFC區(qū)OX1R的表達情況。

1.5.1 WB

在冰盒上分離并收集大鼠PFC區(qū)組織，將腦組織置于低溫高速離心機中離心10 min，得到蛋白質(zhì)膜，依次進行配膠、蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，置于含5%脫脂奶粉的TBST內(nèi)，室溫下60 r·min-1搖床上孵育1 h。孵育結(jié)束后用TBST在80 r·min-1的搖床上漂洗3次×5 min。根據(jù)目的蛋白分子量的大小，裁剪條帶，置于一抗內(nèi)。4 ℃冰箱孵育過夜。將條帶取出后用TBST在80 r·min-1的搖床上漂洗3次×5 min。山羊抗兔IgG使用含5%脫脂奶粉的TBST稀釋(稀釋比例1:2000)，室溫下60 r·min-1搖床上孵育1 h。取出條帶，用TBST在80 r·min-1的搖床上漂洗3次×5 min。用覆蓋上曝光液進行曝光，曝光結(jié)束后存儲照片。使用Image Lab對曝光后條帶的灰度值進行分析，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，計算目的蛋白與β-actin的比值。

1.5.2 免疫熒光技術(shù)

用4%水合氯醛深度麻醉大鼠后，向大鼠心臟灌注4%多聚甲醛至大鼠全身僵硬死亡并斷頭取腦，取前額葉皮質(zhì)區(qū)組織蛋白。將取出的蛋白組織冠狀切片，片厚4 μm，用PBS漂洗，漂洗后用0.3%的H2O2處理30 min，滴加稀釋好的一抗并放入濕盒，孵育過夜，過夜溫度4 ℃，隨后滴加稀釋好的熒光二抗，放入濕盒中孵育1 h，濕盒內(nèi)溫度控制在20～37 ℃，PBS漂洗后再滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，PBS 5 min×4次洗去多余的DAPI，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像，從中選取最有意義的組織相進行分析處理。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計處理。計數(shù)資料采用Mann-Whitney秩和檢驗；計量資料先行方差齊性檢驗，若方差齊，則采用方差分析；若方差不齊，則采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 意識狀態(tài)水平

DBS前，2組意識狀態(tài)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.323)。DBS刺激1 h后，DBS組16只出現(xiàn)翻正反射(16/18)，對照組昏迷大鼠中7只出現(xiàn)翻正反射(7/18)，DBS組行為學(xué)狀態(tài)好于對照組(U=96.00，P=0.026)。見表1。

表1 DBS前大鼠意識狀態(tài)評估 只

2.2 大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)OX1R表達

WB結(jié)果顯示：各組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)OX1R的表達，DBS組高于對照組(P<0.05)，對照組低于空白對照組(P<0.05)。見圖1、表2。

免疫熒光技術(shù)顯示：各組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)OX1R的表達，DBS組明顯高于對照組(P<0.05)，對照組明顯低于空白對照組(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 WB和免疫熒光技術(shù)檢測各組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)OX1R相對表達量

3 討論

DBS最初僅運用于癲癇、帕金森病、特發(fā)性震顫等疾病的治療，近年在神經(jīng)學(xué)領(lǐng)域[7,15]應(yīng)用廣泛。2017年，由多個國家參與的臨床研究[16-18]發(fā)現(xiàn)，DBS可明顯改善由于重型顱腦損傷所導(dǎo)致昏迷的患者的意識狀態(tài)水平。大量研究[8-9,19]顯示，DBS可通過刺激前額葉皮質(zhì)區(qū)釋放更多的神經(jīng)遞質(zhì)，最終提高昏迷患者各方面的行為學(xué)功能和意識狀態(tài)水平。目前國內(nèi)外DBS促醒治療的靶點主要集中在丘腦和中腦兩個部位[5]。本研究旨在探討DBS促醒的有效性。

本實驗中，DBS 1 h后，再次行意識狀態(tài)評估，空白對照組18只大鼠蘇醒(Ⅰ級18只)；DBS組中16只大鼠蘇醒(Ⅲ級10只，Ⅳ級6只)，2只大鼠昏迷(Ⅴ級2只)；對照組中7只大鼠蘇醒(Ⅲ級7只)，11只昏迷(Ⅴ級5只，Ⅵ級6只)，DBS組意識狀態(tài)水平好于對照組(U=96.00，P=0.026)。提示，DBS能夠改善腦外傷昏迷大鼠的意識狀態(tài)水平，加速腦外傷昏迷大鼠的覺醒反應(yīng)。

當前DBS促醒的機制尚不明確，其可能機制主要包括：增加腦血流量及代謝水平；興奮大腦皮質(zhì)及腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；增強腦電活動；影響神經(jīng)遞質(zhì)的分泌[20]。DBS可使受損的神經(jīng)細胞內(nèi)外電位回復(fù)致正常水平，促進神經(jīng)細胞修復(fù)和神經(jīng)通路的正常運行，使TBI昏迷患者腦脊液中神經(jīng)遞質(zhì)恢復(fù)到正常水平，進而提高其意識狀態(tài)水平，達到促醒的效果。

中樞神經(jīng)遞質(zhì)主要包括兩類，即興奮性遞質(zhì)和抑制性遞質(zhì)。抑制性遞質(zhì)主要包括γ-氨基丁酸(GABA)、5-羥色胺(5-HT)，β-內(nèi)啡肽(β-EP)等，能夠促進睡眠；興奮性遞質(zhì)主要包括乙酰膽堿(Ach)、谷氨酸(Glu)、和食欲素(Orexins)等，能夠促進覺醒反應(yīng)[21-23]。其中Orexins是由外側(cè)下丘腦外側(cè)區(qū)分泌合成的一種神經(jīng)多肽，在維持覺醒中扮演著重要的作用[14]。Orexins主要包括Orexins-A和Orexins-B,Orexins-A的受體主要是Orexins 1受體(OX1R)，Orexins-B的受體主要是Orexins 2受體(OX2R)，他們都在大腦皮層中有廣泛的投射。有研究[24]發(fā)現(xiàn)，給麻醉大鼠模型側(cè)腦室注射Orexins-A可加速大鼠的蘇醒，縮短其昏迷時間；反之，給予OX1R拮抗劑可使麻醉大鼠的昏迷時間延長。本課題組前期研究[21]也發(fā)現(xiàn)，MNS和VNS能夠提高前額葉皮質(zhì)區(qū)Orexins及其受體的表達，進而促進腦外傷昏迷大鼠的意識狀態(tài)水平恢復(fù)。唐麗娜等[25]發(fā)現(xiàn)，Orexins神經(jīng)元發(fā)出興奮性投射至除小腦之外的整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)。盛晴等[26]指出，丘腦底核接受來自下丘腦Orexins能纖維支配，并表達Orexins受體，故丘腦也可能通過調(diào)節(jié)Orexins的表達來促醒。

本實驗中WB、免疫熒光技術(shù)結(jié)果顯示：空白對照組大鼠前額葉皮質(zhì)區(qū)OX1R的表達水平明顯高于對照組大鼠(P<0.05)，對照組低于空白對照組(P<0.05)，提示DBS促醒的可能機制是，DBS通過上調(diào)前額葉皮質(zhì)區(qū)Orexins受體OX1R的表達水平，進而提高TBI后昏迷大鼠的意識狀態(tài)水平。

本研究的局限性和不足：1)在大鼠的行為學(xué)評估上僅用了意識狀態(tài)六級評分法作為評估標準，腦電圖、誘發(fā)電位將進一步應(yīng)用以完善評估體系；2)未來將通過利用OX1R受體拮抗劑進一步驗證其關(guān)鍵性作用；3)DBS促醒機制是否與其他神經(jīng)遞質(zhì)的表達有關(guān)，未來仍需進一步的深入研究。

綜上所述，本研究進一步驗證了DBS促醒的有效性，即DBS促醒的可能作用機制是，DBS通過上調(diào)前額葉皮質(zhì)區(qū)Orexins受體OX1R的表達水平，進而提高TBI后昏迷大鼠的意識狀態(tài)水平。