孫林雍，嚴(yán)嘉琦，陳 昶，陳 昱，鄒 艷，陳 杰，唐 源

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)感染引起的慢性傳染性疾病，病原菌為MTB復(fù)合群，包括：結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌等[1]，可侵犯人體全身各種器官，以肺部最常見。骨關(guān)節(jié)結(jié)核是一種罕見的肺外結(jié)核病，早期癥狀不明顯，近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，尤其在不發(fā)達(dá)國(guó)家。我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)之一，患病人數(shù)位居世界第2[2]，因此結(jié)核病成為制約我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大公共問題之一[3]。骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶中結(jié)核分枝桿菌比肺結(jié)核病灶中少，增加了早期診斷的難度。且此類結(jié)核通常進(jìn)程緩慢，早期正確診斷和盡早適當(dāng)治療對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的預(yù)后至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time PCR, RT-PCR)及抗酸染色檢測(cè)，并與臨床診斷結(jié)果進(jìn)行比較，分析兩種檢測(cè)方法的靈敏度、特異性差異，以及MTB檢出率與臨床診斷符合率的一致性。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取四川大學(xué)華西醫(yī)院2017年1月～2018年1月臨床送檢疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核樣本253例。所有樣本均經(jīng)石蠟包埋組織切片，鏡下形態(tài)學(xué)以肉芽腫性炎伴壞死部分區(qū)域可見鈣化為主要組織學(xué)改變(圖1)；對(duì)所有標(biāo)本同時(shí)行RT-PCR及抗酸染色檢測(cè)。

①②

1.2 儀器與試劑QIAamp DNA Tissue Kit(Cat.56404)、MTB核酸檢測(cè)試劑盒(凱杰生物公司)、組織切片抗酸染色試劑盒(Ventana AFB Ⅲ Staining Kit，Roche公司)、Qiacube全自動(dòng)組織處理機(jī)(Qiagen公司)、CFX-96 real-time PCR儀(Bio-Rad公司)、BenchMark全自動(dòng)特殊染色機(jī)(羅氏診斷產(chǎn)品上海公司)。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 取石蠟包埋組織切成5 μm厚切片3～5張裝入EP管中用于DNA提取。操作步驟按照QIAamp(Cat.56404)DNA FFPE Tissue Kit(50 T)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2抗酸染色 將石蠟包埋組織5 μm厚切片，裱片，烤片，打印相應(yīng)條碼貼于載玻片一側(cè)，將玻片放置于BenchMark全自動(dòng)特殊染色機(jī)，選擇抗酸染色程序，進(jìn)行自動(dòng)染色，染色結(jié)束后封固蓋玻片。

1.3.3RT-PCR 按產(chǎn)品說(shuō)明配置反應(yīng)體系，除待測(cè)樣本外，同時(shí)進(jìn)行陰性、陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn),陰、陽(yáng)對(duì)照為試劑盒自帶。將PCR反應(yīng)管放入CFX-96 real-time PCR檢測(cè)分析儀。PCR反應(yīng)條件：37 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，同時(shí)實(shí)施信號(hào)采集，返回第三步循環(huán)41次，結(jié)束反應(yīng)。

1.3.4結(jié)果判讀 抗酸染色切片油鏡下見棕紅色兩端鈍圓稍彎曲的細(xì)絲狀桿菌判定為陽(yáng)性，否則為陰性。RT-PCR按MTB核酸檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明，陰性對(duì)照Ct值=0，陽(yáng)性對(duì)照Ct值<25，檢測(cè)樣本Ct值=0或>37判定為陰性，Ct值≤37判定為陽(yáng)性。本實(shí)驗(yàn)將臨床資料(結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)、結(jié)核菌培養(yǎng)等)綜合診斷并經(jīng)抗結(jié)核治療的病例歸類為結(jié)核，臨床資料未診斷為結(jié)核的病例歸類為非結(jié)核。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各組檢測(cè)結(jié)果采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用四格表χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征253例樣本中，男性127例，占50.2%，女性126例，占49.8%，男女比約1 ∶1?；颊吣挲g1～82歲,中位年齡44歲。病變部位：脊椎139例、膝關(guān)節(jié)34例、髖關(guān)節(jié)22例、肋骨14例、腕關(guān)節(jié)9例、其他35例。

2.2 RT-PCR及抗酸染色檢測(cè)結(jié)果與臨床結(jié)果比較253例樣本中，總檢出率為45.8%(116/253)；其中，RT-PCR檢出率為38.3%(97/253)，抗酸染色檢出率為41.5%(105/253)，兩種檢測(cè)的符合率為88.1%(223/253)(表1，圖2、3)。在116例陽(yáng)性病例中，僅RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性11例，臨床確診9例，臨床符合率為81.8%(9/11)；僅抗酸染色檢測(cè)陽(yáng)性19例，臨床確診5例，臨床符合率為26.3%(5/19)；兩種檢測(cè)均陽(yáng)性86例，臨床確診80例，臨床符合率為93.0%(80/86)。兩種檢測(cè)均陽(yáng)性比僅抗酸染色陽(yáng)性與臨床結(jié)果符合率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=44.910，P<0.001)；僅RT-PCR陽(yáng)性比僅抗酸染色陽(yáng)性與臨床結(jié)果符合率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.623，P=0.003)；僅RT-PCR陽(yáng)性比兩種檢測(cè)均陽(yáng)性與臨床符合率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.618，P=0.203)。本組樣本中脫鈣組織5例，其中3例臨床確診為結(jié)核病，2例臨床確診為非結(jié)核病。

表1 RT-PCR和抗酸染色法檢測(cè)結(jié)果比較

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果陽(yáng)性，擴(kuò)增曲線升起，CT值<37，陰、陽(yáng)對(duì)照正常

2.3 靈敏度及特異性99例臨床確診為結(jié)核病樣本中，RT-PCR檢測(cè)89例陽(yáng)性，10例陰性，靈敏度為89.9%(89/99)；抗酸染色檢測(cè)85例陽(yáng)性，14例陰性，靈敏度為85.9%(85/99)。154例臨床確診為非結(jié)核病樣本中，RT-PCR檢測(cè)8例陽(yáng)性，146例陰性，特異性為94.8%(146/154)；抗酸染色檢測(cè)20例陽(yáng)性，134例陰性，特異性為87.0%(134/154)(表2)。

表2 RT-PCR和抗酸染色法檢測(cè)骨關(guān)節(jié)組織中結(jié)核分枝桿菌的靈敏度和特異性比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中RT-PCR檢出率為38.3%(97/253)，抗酸染色檢出率為41.5%(105/253)。國(guó)內(nèi)關(guān)于結(jié)核桿菌檢出的報(bào)道中，姚梅宏等[4]對(duì)40例確診結(jié)核病的石蠟包埋組織樣本進(jìn)行MTB檢測(cè)，PCR及抗酸染色法的檢出率分別為80%(32/40)、50%(20/40)，均高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本組為可疑骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的石蠟包埋組織樣本，報(bào)道選取確診結(jié)核病的不限于骨關(guān)節(jié)的石蠟包埋組織樣本。分析原因可能與樣本選取有關(guān)。吳啟秋等[5]對(duì)250例復(fù)治骨關(guān)節(jié)結(jié)核病經(jīng)BACTEC法初代分離培養(yǎng)進(jìn)行檢測(cè)，檢出率為18.4%(46/250)，明顯低于本實(shí)驗(yàn)中骨關(guān)節(jié)結(jié)核病RT-PCR的檢出率，其原因可能與檢測(cè)方法及研究樣本制備方法不同有關(guān)。李小燕等[6]對(duì)110例石蠟包埋組織樣本行RT-PCR及抗酸染色檢測(cè)，檢出率分別為36.4%(40/110)、17.3%(19/110)。其RT-PCR的檢出率與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，但抗酸染色的檢出率明顯低于本組結(jié)果，其原因可能與不同實(shí)驗(yàn)室抗酸染色質(zhì)量、診斷醫(yī)師鏡下觀察經(jīng)驗(yàn)有關(guān)。

國(guó)內(nèi)一組研究報(bào)道[7]不限于骨結(jié)核的肉芽腫性炎伴壞死，RT-PCR的檢出率高于抗酸染色，而本組中RT-PCR的檢出率略低于抗酸染色。分析原因可能與活檢小標(biāo)本組織過小，導(dǎo)致PCR檢測(cè)組織中沒有病變組織；以及骨組織、脫鈣組織對(duì)PCR擴(kuò)增的影響有關(guān)。本組兩種檢測(cè)的符合率為88.1%，林曉[8]對(duì)118例疑似結(jié)核病樣本進(jìn)行檢測(cè)，兩種檢測(cè)的符合率為95.76%。分析本組病例符合率低于報(bào)道的原因，可能與選取樣本及樣本量有關(guān)。

本組19例抗酸染色陽(yáng)性而RT-PCR檢測(cè)陰性病例中，臨床確診為MTB(5例)的數(shù)量低于為非MTB(14例)。其原因可能與我院地處西南，病例構(gòu)成來(lái)自多民族地區(qū)且人員流動(dòng)復(fù)雜，容易造成其他抗酸陽(yáng)性分枝桿菌感染有關(guān)。11例僅RT-PCR陽(yáng)性病例中，臨床確診為MTB 9例、非MTB 2例。86例抗酸染色與RT-PCR均陽(yáng)性病例中，臨床確診為MTB 80例、非MTB 6例。其中臨床確診為非MTB(8例)的病例均未經(jīng)抗結(jié)核治療，分析原因可能與骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)展緩慢，臨床特征不明顯有關(guān)。由于RT-PCR為結(jié)核病的特異性檢測(cè)，因此當(dāng)RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性臨床診斷為非MTB時(shí)建議患者隨訪。本組樣本中脫鈣組織5例，臨床確診為結(jié)核病3例，其中2例抗酸染色及RT-PCR檢測(cè)均為陰性；1例抗酸染色陽(yáng)性，RT-PCR檢測(cè)陰性。臨床確診為非結(jié)核病2例，抗酸染色及RT-PCR檢測(cè)均為陰性。說(shuō)明脫鈣組織可能對(duì)抗酸染色及PCR擴(kuò)增有影響。

本實(shí)驗(yàn)中RT-PCR檢測(cè)試劑盒采用一對(duì)PCR引物和一個(gè)熒光雙標(biāo)記探針，中期擴(kuò)增片段為IS6110，特異性通過了NMPA認(rèn)證，檢測(cè)靈敏度為每毫升10個(gè)MTB即可檢出。盡管全自動(dòng)抗酸染色與手工染色比較，染色條件恒定不受外界環(huán)境變化的影響，但由于抗酸染色陽(yáng)性包括了MTB復(fù)合群、麻風(fēng)分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，不能區(qū)分MTB與非MTB，并受觀察者主觀因素影響，易造成漏、誤診[9]。因此，同時(shí)行RT-PCR及抗酸染色檢測(cè)可以提高診斷結(jié)核病的準(zhǔn)確性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核石蠟包埋組織RT-PCR和抗酸染色結(jié)果與臨床結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅抗酸染色陽(yáng)性時(shí)，因不能排除其他分枝桿菌感染，建議結(jié)合臨床考慮；當(dāng)RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性臨床診斷為非MTB時(shí)，建議患者隨訪。