張安莉，李倩倩，李 恒，孫思柏，李玉潔，王 偉，吳海波

食管基底細(xì)胞樣鱗狀細(xì)胞癌(basaloid squamous cell carcinoma, BSCC)是一種食管少見的鱗狀細(xì)胞癌變異亞型，發(fā)病率為0.2%～11.3%[1]，具有獨特的組織形態(tài)特點和明顯的侵襲性行為，較普通食管鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后更差。細(xì)胞程序性死亡配體1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)免疫治療是目前備受矚目的新一代抗腫瘤治療方法，旨在利用自身的免疫系統(tǒng)對抗腫瘤細(xì)胞，通過PD-L1蛋白抗體阻止PD-L1識別T細(xì)胞，從而恢復(fù)T細(xì)胞的正常識別和防御功能，有助于殺死腫瘤細(xì)胞[2]。文獻(xiàn)報道PD-L1可表達(dá)于膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌和淋巴造血系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤，但在食管BSCC中尚未見報道。本文應(yīng)用免疫組化法檢測PD-L1在BSCC中的表達(dá)，探討PD-L1表達(dá)與BSCC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010年7月～2018年12月中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)手術(shù)切除的食管癌標(biāo)本，經(jīng)病理組織學(xué)和免疫組化檢查明確診斷食管BSCC合計65例，其中37例有隨訪資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者術(shù)前均未行放療、新輔助化療和激素類藥物治療，具有手術(shù)適應(yīng)癥；(2)經(jīng)術(shù)后組織學(xué)和免疫組化檢查證實為食管BSCC；(3)臨床病理資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)合并心腦血管疾病或嚴(yán)重肝腎功能危及生命者；(3)合并其他重大疾病者。37例食管BSCC中男性32例，女性5例；年齡49～81歲，平均(64.73±7.88)歲；Ⅰ+Ⅱ期26例，Ⅲ+Ⅳ期11例；其中癌組織浸潤至黏膜下層4例，肌層6例，外膜層27例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例。采用電話隨訪，隨訪時間截止到2019年6月，隨訪時間6～112個月，直至患者死亡或隨訪截止時間。

1.2 方法手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水浸蠟、包埋后切片，分別行HE和免疫組化染色。蠟塊4 μm厚切片，行PD-L1免疫組化SP法染色(使用DAKO自動免疫組化染色儀Link48)。所用一抗(PD-L1單克隆鼠抗人，克隆號22C3)、二抗試劑盒(PD-L1抗體22C3 pharmDx)均購自DAKO公司，所有切片均設(shè)立陰、陽性對照。

1.3 結(jié)果判讀兩名高年資病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判讀，PD-L1主要表達(dá)于細(xì)胞膜，呈現(xiàn)部分或完整細(xì)胞膜著色。按照PD-L1陽性細(xì)胞所占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比評分(tumor proportion score, TPS)進(jìn)行結(jié)果判讀[3]。腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞膜染色、細(xì)胞質(zhì)染色的腫瘤細(xì)胞被排除在評分之外。PD-L1高表達(dá)定義為TPS>1%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管BSCC及癌旁正常組織中PD-L1的表達(dá)食管BSCC組織學(xué)形態(tài)主要由基底樣細(xì)胞組成，瘤細(xì)胞較小，胞質(zhì)少，核呈圓形或卵圓形，核分裂象多見，癌細(xì)胞呈實性巢狀排列(圖1)。組織學(xué)形態(tài)與神經(jīng)內(nèi)分泌癌相似，免疫組化標(biāo)記CK5/6、p63、p40均彌漫陽性，Syn、CgA、CD56、CD117均陰性。PD-L1主要表達(dá)于細(xì)胞膜，呈現(xiàn)部分或完整細(xì)胞膜著色(圖2)。PD-L1在食管BSCC中的高表達(dá)率為29.73%(11/37)，在癌旁正常鱗狀上皮中不表達(dá)。在PD-L1高表達(dá)BSCC中可見PD-L1在腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞中也有表達(dá)，在PD-L1低表達(dá)BSCC中腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞幾乎不表達(dá)PD-L1。

①②

2.2 食管BSCC中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系食管BSCC組織中PD-L1表達(dá)與腫瘤浸潤深度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，PD-L1表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05，表1)。

表1 PD-L1表達(dá)與食管BSCC臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 PD-L1表達(dá)與食管BSCC預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明，PD-L1高表達(dá)食管BSCC患者術(shù)后總生存期(overall survival, OS)和無進(jìn)展生存期(progression free survival, PFS)均比PD-L1低表達(dá)食管BSCC者明顯降低(χ2=13.283，P=0.000 3；χ2=7.700，P=0.006，圖3、4)。兩組患者中位OS分別為12、24個月，5年生存率分別為27.27%、34.62%；中位PFS分別為8、20個月，5年生存率分別為9.09%、26.92%。

圖3 PD-L1表達(dá)與食管BSCC患者OS的關(guān)系

圖4 PD-L1表達(dá)與食管BSCC患者PFS的關(guān)系

3 討論

BSCC是一種少見的特殊類型鱗狀細(xì)胞癌，好發(fā)于上呼吸道及上消化道，由Wain等[4]于1986年首次報道，其以明顯的侵襲性、較差的預(yù)后和獨特的病理形態(tài)引起廣泛關(guān)注。早期人們對食管BSCC缺乏認(rèn)識，易誤診為腺樣囊性癌、小細(xì)胞癌、低分化鱗狀細(xì)胞癌、腺鱗癌等，隨著對其認(rèn)識的深入，文獻(xiàn)報道的發(fā)病率也在逐年增加。本病好發(fā)于中老年人，男性多見，本組男性32例，女性5例，平均年齡64.7歲。BSCC的5年生存率為20.2%，與普通食管鱗狀細(xì)胞癌的5年生存率(40.4%)相比，預(yù)后更差[5]。治療上目前多采取食管根治手術(shù)加化療，但效果不太令人滿意。因此在分析BSCC臨床病理特征的基礎(chǔ)上，積極尋找BSCC有效的治療方案顯得尤為重要。

免疫治療是繼腫瘤分子靶向治療之后新的研究熱點。機(jī)體免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中既能清除腫瘤細(xì)胞，又能促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD1)主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，含有288個氨基酸受體，結(jié)構(gòu)域同免疫球蛋白可變區(qū)相似，包括胞外N端域、穿膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域3個部分。其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域在免疫抑制中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，介導(dǎo)強(qiáng)效免疫抑制信號，阻礙T效應(yīng)細(xì)胞的分化和功能，對抗病毒和抗腫瘤免疫反應(yīng)產(chǎn)生的負(fù)面影響[6]。PD-L1是由290個氨基酸亞基組成的跨膜蛋白，胞外由1個IgV樣區(qū)和1個IgC樣區(qū)構(gòu)成，二級結(jié)構(gòu)與B7-1、B7-2非常相似。PD-L1是PD1的主要結(jié)合配體，PD1與其配體PD-L1結(jié)合后，通過抑制T、B細(xì)胞活性來防止自身免疫疾病的發(fā)生[7]。T細(xì)胞共刺激信號通路包括B7-1/B7-2-CD28/CTLA-4超家族，它們對于T細(xì)胞活化和耐受必不可少，PD1作為抑制性受體，其配體PD-L1作為B7-1/B7-2-CD28/CTLA-4家族的另一個成員，確立了免疫檢查點對維持T細(xì)胞免疫耐受的重要性。

浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征，也是影響患者預(yù)后的主要因素。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesmenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞緊密連接及黏附連接消失，Ⅲ型EMT與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。PD-L1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Slug和Twist的表達(dá)，抑制E-cadherin表達(dá)，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生[9]，這表明PD-L1在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。隨著CTLA-4作為潛在的抑制性免疫檢查點的發(fā)現(xiàn)，PD1/PD-L1抑制通路在治療上被應(yīng)用。在腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)已被證明抑制T細(xì)胞的活化并可以誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，同時發(fā)現(xiàn)特異性封閉PD-L1抗體可以用于治療各種類型的惡性腫瘤。目前PD-L1已被報道在膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌和淋巴造血系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤均有表達(dá)。在這些腫瘤中，PD-L1高表達(dá)常與較短的OS相關(guān)。食管BSCC中PD-L1的表達(dá)國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見報道，針對食管癌的免疫治療也尚未明確。在本組實驗中，PD-L1在食管BSCC中的高表達(dá)率為29.73%(11/37)，在癌旁正常鱗狀上皮中不表達(dá)。在PD-L1高表達(dá)BSCC中可見PD-L1在癌巢間質(zhì)淋巴細(xì)胞中也有表達(dá)，在PD-L1低表達(dá)BSCC中癌巢間質(zhì)淋巴細(xì)胞幾乎不表達(dá)PD-L1。食管BSCC組織PD-L1表達(dá)與腫瘤浸潤深度、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，但與年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)。PD-L1在腫瘤浸潤外膜層中的高表達(dá)率顯著高于浸潤至黏膜下層及肌層。Ⅲ+Ⅳ期食管BSCC中PD-L1的高表達(dá)率高于Ⅰ+Ⅱ期。PD-L1高表達(dá)患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高。這些結(jié)果均提示PD-L1高表達(dá)的食管BSCC有更強(qiáng)的侵襲性。Kaplan-Meier生存分析表明，PD-L1高表達(dá)食管BSCC患者的OS和PFS均明顯低于PD-L1低表達(dá)患者，提示PD-L1在食管BSCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，也為食管BSCC患者的治療帶來了新的機(jī)會。

目前PD1/PD-L1通路在不同腫瘤臨床治療中取得了20%～90%的有效率。腫瘤和腫瘤微環(huán)境高表達(dá)PD-L1的患者均對PD1-PD-L1通路阻斷治療有良好的臨床反應(yīng)。同時腫瘤間質(zhì)和腫瘤中浸潤的免疫細(xì)胞也有PD-L1的表達(dá)。在沒有PD-L1表達(dá)上調(diào)的患者中，對PD1與PD-L1通路阻斷治療則反應(yīng)差。靶向PD1或PD-L1的抗體已經(jīng)進(jìn)入臨床治療，包括Pembrolizumab和Nivolumab。在未經(jīng)治療的Ⅲ、Ⅳ期惡性黑色素瘤中Nivolumab聯(lián)合Iplimumab有效率為57.6%[10]。在用抗PD-L1抗體Atezolizumab治療的非小細(xì)胞性肺癌中，未進(jìn)行PD-L1免疫組化檢測患者中的有效率為15%，而在PD-L1高表達(dá)患者中的有效率高達(dá)38%[11]。決定抗PD-L1療效的因素包括腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞PD-L1、腫瘤組織中PD-L1陽性細(xì)胞數(shù)。不表達(dá)PD-L1的腫瘤療效差，腫瘤組織中浸潤的PD-L1陽性免疫細(xì)胞少則療效差。迄今為止，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)PD1/PD-L1抑制劑治療9種惡性腫瘤，其中包括腎細(xì)胞癌、肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、鼻咽癌、尿路上皮癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌。目前，關(guān)于食管癌的免疫治療尚在研究中。前期研究表明，長時間持續(xù)使用PD1/PD-L1抑制劑并不能達(dá)到期望的生存率，這可能與PD-L1在食管鱗狀細(xì)胞癌的陽性率較低有關(guān)，食管BSCC的PD-L1表達(dá)情況卻未見報道，可能與本腫瘤亞型病例數(shù)較少有關(guān)。腫瘤的免疫治療包括多個信號通路，因此聯(lián)合治療成為腫瘤免疫治療的新方案。Larkin等[12]研究表明，使用Nivolumab和Iplimumab聯(lián)合治療53例晚期黑色素瘤患者，入組患者的客觀緩解率為40%，腫瘤體積減少80%。Lussier等[13]使用PD1/PD-L1抗體和抗CTLA-4抗體聯(lián)合治療方法，轉(zhuǎn)移性骨肉瘤實驗小鼠的PFS約為60%，而單用PD-L1抗體治療的實驗小鼠PFS為0，且只用抗CTLA-4治療也未顯示良好的效果，這表明抗體阻斷聯(lián)合治療具有協(xié)同作用。目前抗CTLA-4抗體與抗PD1或抗PD-L1抗體聯(lián)合治療的腫瘤還包括腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、三陰型乳腺癌、膀胱癌等，該類臨床實驗為腫瘤治療開啟了新思路。

目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)認(rèn)證檢測PD-L1表達(dá)的抗體包括22C3和SP142，本組實驗中使用的PD-L1抗體為22C3，對于PD-L1高表達(dá)食管BSCC患者是否可以嘗試腫瘤化療聯(lián)合免疫治療，以便給食管BSCC患者提供全新的治療選擇，需要進(jìn)一步臨床分析。