李林梅，宋太發(fā)，索成林，胡雄，唐娟麗，李帥帥

(湖南天濟(jì)草堂制藥股份有限公司，湖南 長沙，410205)

鹽酸莫西沙星由德國拜耳公司于20世紀(jì)90年代末期開發(fā)上市的第4代廣譜氟喹諾酮類抗菌藥，自1999年以來已在多個(gè)國家上市，鹽酸莫西沙星片于2002年在中國批準(zhǔn)上市，上市劑型有片劑、小容量注射劑及大容量注射劑。

朱榮等[1-2]采用梯度洗脫的方法，對(duì)鹽酸莫西沙星含量和有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法進(jìn)行了研究，其中包括雜質(zhì)A～E。蘇敏等[3]采用等度洗脫，通過流動(dòng)相比例優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了鹽酸莫西沙星葡萄糖溶液中雜質(zhì)A～E的分離檢測(cè)。高宏偉等[4-5]也采用高效液相色譜法，對(duì)鹽酸莫西沙星雜質(zhì)進(jìn)行了分析。董雅等[6]對(duì)莫西沙星有關(guān)物質(zhì)研究的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了綜述報(bào)道，文章指出目前針對(duì)莫西沙星有關(guān)物質(zhì)的控制，大多僅研究了雜質(zhì)A～E。鄭家晴等[7]報(bào)道了A～F的有關(guān)物質(zhì)分析方法。

2012年，URSZULA等[8]報(bào)道了莫西沙星在紫外照射條件下，以及有無Cu(Ⅱ)，Zn(Ⅱ)，Al(Ⅲ)和Fe(Ⅲ)等離子的溶液和固體中，莫西沙星會(huì)發(fā)生光降解，其中2’-氧代莫西沙星為光降解雜質(zhì)之一。本文結(jié)合鹽酸莫西沙星的生產(chǎn)工藝路線，針對(duì)6個(gè)雜質(zhì)，分別為1-環(huán)丙基-6,7-二氟-1,4-二氫-8-羥基-4-氧代-3-喹啉羧酸(雜質(zhì)K，中間體降解產(chǎn)物)、1-環(huán)丙基-6,7-二氟-1,4-二氫-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸乙酯(雜質(zhì)L，工藝雜質(zhì))、6-羥基莫西沙星(雜質(zhì)N，工藝雜質(zhì))、2’-氧代莫西沙星(雜質(zhì)M，文獻(xiàn)報(bào)道的光降解雜質(zhì))、加替沙星中間體(母核，合成莫西沙星的關(guān)鍵物料)、1-環(huán)丙基-6,7-二氟-1,4-二氫-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧酸-(O3,O4)-雙-(乙酰氧基)-硼酸酯(中間體，工藝雜質(zhì))，進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)分析方法開發(fā)。同時(shí)雜質(zhì)A～F在該方法下進(jìn)行了專屬性研究，排除雜質(zhì)A～F不會(huì)干擾這6個(gè)雜質(zhì)的檢出。

對(duì)各國收錄的鹽酸莫西沙星片標(biāo)準(zhǔn)比較，發(fā)現(xiàn)其有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法大多采用苯基柱。本文優(yōu)化了有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法，采用常用的C18柱和等度洗脫的方法，可有效分離上述6個(gè)雜質(zhì)。同時(shí)對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示：此方法專屬性好，操作簡(jiǎn)便，對(duì)多個(gè)雜質(zhì)均能有效分離，可作為有關(guān)物質(zhì)檢查方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000高效液相色譜儀(Thermo Fisher Scientific公司)，EX125DZH型電子天平(OHAUS公司，精密度1/100 000)。

鹽酸莫西沙星片,批號(hào)190301，190302(湖南天濟(jì)草堂制藥股份有限公司)；雜質(zhì)A,批號(hào)151023(北京康派森醫(yī)藥科技有限公司，含量99.4%)；雜質(zhì)B,批號(hào)33266(北京康派森醫(yī)藥科技有限公司，含量99.2%)；雜質(zhì)C，批號(hào)34835(北京康派森醫(yī)藥科技有限公司，含量99.4%)；雜質(zhì)D，批號(hào)27546(北京康派森醫(yī)藥科技有限公司，含量99.6%)；雜質(zhì)E，批號(hào)39081(北京康派森醫(yī)藥科技有限公司，含量98.3%)；雜質(zhì)F，批號(hào)25520(北京康派森醫(yī)藥科技有限公司，含量99.9%)；雜質(zhì)N，批號(hào)MX-190422(深圳博泰爾生物技術(shù)有限公司，含量96.1%)；中間體，批號(hào)39065(北京康派森醫(yī)藥科技有限公司，含量99.9%)；雜質(zhì)M，批號(hào)2798-072A3(TLC，含量99.4%)；雜質(zhì)L，批號(hào)19-MVI-71-2(TRC，含量98.0%)；雜質(zhì)K，批號(hào)MXJ20111201(北京康派森醫(yī)藥科技有限公司，含量99.3%)；母核，批號(hào)MXG20111201(北京康派森醫(yī)藥科技有限公司，含量98.4%)；鹽酸莫西沙星對(duì)照品，批號(hào)3.0(EP，含量96.9%)；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水(Millipore公司)，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

采用高級(jí)液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件為：色譜柱為Agilent poroshell EC-C18柱(5.0 μm，4.6 mm×250 mm，Agilent公司)；四丁基硫酸氫銨緩沖液∶甲醇(90∶10)(V/V)為流動(dòng)相A；甲醇∶四丁基硫酸氫銨緩沖液(90∶10)(V/V)為流動(dòng)相B；流動(dòng)相為A稀釋溶劑；采用等度洗脫，檢測(cè)波長為247 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積20 μL；流速1.3 mL/min。

1.2.2 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)

鹽酸莫西沙星涉及的6個(gè)雜質(zhì)，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 鹽酸莫西沙星6個(gè)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)Fig.1 The six impurity Structrue of Moxifloxacin hydrochloride

1.2.3 專屬性

雜質(zhì)定位溶液制備：精密稱取A～F等各雜質(zhì)適量，制成100 μg/mL的各雜質(zhì)貯備液；精密移取1 mL各雜質(zhì)貯備液，分別置100 mL量瓶中，稀釋定容，制成1.0 μg/mL的單個(gè)雜質(zhì)定位溶液。

1.2.4 系統(tǒng)適用性溶液制備

精密稱取雜質(zhì)K，L，M，N，中間體和母核等各雜質(zhì)適量，制成100 μg/mL的單個(gè)雜質(zhì)貯備液。精密移取1 mL各雜質(zhì)貯備液，置同一100 mL量瓶中，稀釋定容，制成終質(zhì)量濃度約為1.0 μg/mL的雜質(zhì)混合溶液；另精密稱取鹽酸莫西沙星對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，加雜質(zhì)混合溶液稀釋并定容至刻度，制成各雜質(zhì)質(zhì)量濃度為1 μg/mL、莫西沙星約為1.0 mg/mL的系統(tǒng)適用性溶液。

1.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

將系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積20 μL，系統(tǒng)適用性要求：主峰莫西沙星與相鄰雜質(zhì)，以及各雜質(zhì)之間的分離度均不得小于1.5，主峰理論板數(shù)不得小于20 000；雜質(zhì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)均不得小于2.0%，保留時(shí)間的RSD均不得小于1.0%(n=6)。

1.2.6 供試品溶液的制備

精密稱取鹽酸莫西沙星片適量(相當(dāng)于莫西沙星50 mg)，置50 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1.0 mg/mL的供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性

空白溶劑、各雜質(zhì)定位溶液、系統(tǒng)適用性溶液等樣品溶液，進(jìn)樣體積20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，各雜質(zhì)不干擾2’-氧代莫西沙星的測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見表1，相關(guān)圖譜見圖2和圖3。

表1 方法專屬性結(jié)果Table 1 Resuit of method specificity

圖2 空白溶劑圖譜Fig.2 Chromatogram of blank solution

圖3 系統(tǒng)適用性溶液圖譜Fig.3 Chromatogram of system suitability solution

2.2 進(jìn)樣精密度

按所述色譜條件試驗(yàn)，精密量取系統(tǒng)適用性溶液20 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，重復(fù)進(jìn)樣6次。2’-氧代莫西沙星峰保留時(shí)間RSD為0.10%；峰面積RSD為1.18%，說明儀器精密度良好。

2.3 定量限與檢測(cè)限

同2.2項(xiàng)操作，精密量取2’-氧代莫西沙星(雜質(zhì)M)對(duì)照貯備液適量，用稀釋劑逐級(jí)稀釋，分別注入色譜儀，當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限(LOQ)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限(LOD)，連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄色譜圖，定量限為3.021 ng，RSD%(n=6)4.56%，檢測(cè)限為1.510 ng。

2.4 線性與范圍

精密量取2’-氧代莫西沙星(雜質(zhì)M)對(duì)照貯備液適量，稀釋成0.015 1，0.201 0，0.503 0，0.806 0，1.007 0和2.517 0 μg/mL的系列質(zhì)量濃度線性溶液，各質(zhì)量濃度進(jìn)樣20 μL，以2’-氧代莫西沙星的質(zhì)量濃度與峰面積之比進(jìn)行線性回歸。得回歸方法：y=0.297x-0.016(r=0.999 5)，線性范圍為0.151～2.517 μg/mL，定量下限為0.151 μg/mL。

2.5 溶液穩(wěn)定性

取2.3項(xiàng)下2’-氧代莫西沙星(雜質(zhì)M)對(duì)照貯備液適量，稀釋制成終質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的對(duì)照品溶液，室溫放置，分別于0，4，12，14，16，18和20 h精密量取20 μL，測(cè)定峰面積，峰面積RSD(n=6)為1.17%，小于5%，說明對(duì)照品溶液室溫0～20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性

取鹽酸莫西沙星適量，用稀釋劑溶解并稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液，平行配制6份，按照2’-氧代莫西沙星檢測(cè)方法測(cè)定，6份供試品中均未檢出2’-氧代莫西沙星，結(jié)合回收率結(jié)果，該法重復(fù)性良好。

2.7 回收率

配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度2’-氧代莫西沙星(5.04，10.12和15.03 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)系列樣品各3份，進(jìn)樣20 μL，記錄2’-氧代莫西沙星的峰面積。按照2.3項(xiàng)下新配制2’-氧代莫西沙星對(duì)照品溶液，終質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，進(jìn)樣20 μL，記錄對(duì)照峰面積。2’-氧代莫西沙星3個(gè)質(zhì)量濃度水平的回收率為97.7%,98.5%和99.7%，平均回收率98.6%，RSD(n=9)為1.51%，結(jié)果見表2。

表2 2’-氧代莫西沙星回收率結(jié)果(n=9)Table 2 Recovery results of 2’-oxymoxifloxacin in moxifloxacin hydrochloride (n=9)

3 討論

目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道鹽酸莫西沙星片中光降解雜質(zhì)2’-氧代莫西沙星的測(cè)定方法，本文建立的HPLC方法，不僅能有效分離多個(gè)雜質(zhì)，同時(shí)能有效檢測(cè)2’-氧代莫西沙星，專屬性良好。在建立本定量分析方法時(shí)，對(duì)流動(dòng)相比例、檢測(cè)波長、流速、柱溫等分析方法進(jìn)行了篩選優(yōu)化，改善了各雜質(zhì)的分離度，最終確定本文采用的色譜條件。

采用Agilent Poroshell EC-C18色譜柱，固定柱溫35 ℃，流速1.3 mL/min，檢測(cè)波長設(shè)為293 nm[1](293 nm為莫西沙星的最大吸收波長)，通過調(diào)整流動(dòng)相A相和B相的比例進(jìn)行檢測(cè)方法的優(yōu)化。當(dāng)流動(dòng)相比例為60∶40(V/V)時(shí)，運(yùn)行時(shí)間60 min內(nèi)雜質(zhì)K，L，M，中間體和母核5個(gè)雜質(zhì)未完全分離，其中2個(gè)雜質(zhì)相互重疊為一個(gè)峰；當(dāng)調(diào)整流動(dòng)相比例至(50∶50)(V/V)時(shí)，運(yùn)行時(shí)間35 min內(nèi)5個(gè)雜質(zhì)均能有效分離，最小分離度為1.45，各峰峰行良好。但該檢測(cè)條件，雜質(zhì)N未出峰。

鑒于雜質(zhì)N未出峰，通過對(duì)單個(gè)雜質(zhì)溶液、混合雜質(zhì)溶液的紫外吸收波長掃描分析，最終選用247 nm作為該方法的檢測(cè)波長。固定流動(dòng)相比例至50∶50(V/V)，在247 nm進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示：雜質(zhì)K，L，M，N，中間體和母核6個(gè)雜質(zhì)與主峰全部實(shí)現(xiàn)有效分離，最小分離度為2.97，各峰峰行良好。

將流速設(shè)為1.0 mL/min，雜質(zhì)K，L，M，N，中間體和母核6個(gè)雜質(zhì)全部有效分離，最小分離度達(dá)1.81，各峰峰行良好，說明流速的調(diào)整，對(duì)分離效果影響不大。

將波長設(shè)為247 nm，柱溫設(shè)為30 ℃，雜質(zhì)K，L，M，N，中間體和母核6個(gè)雜質(zhì)全部有效分離，最小分離度達(dá)3.21，各峰峰行良好，說明降低柱溫，可提高分離效果。

綜上，采用Agilent Poroshell EC-C18色譜柱，四丁基硫酸氫銨緩沖液∶甲醇(90∶10)(V/V)為流動(dòng)相A；甲醇∶四丁基硫酸氫銨緩沖液(90∶10)(V/V)為流動(dòng)相B；流動(dòng)相A為稀釋溶劑；采用等度洗脫，檢測(cè)波長為247 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積20 μL；流速1.3 mL/min。參照相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道的驗(yàn)證思路，結(jié)果表明：本文研究方法專屬性好，靈敏度滿足檢測(cè)要求，可作為新的分析方法，用于鹽酸莫西沙星片多個(gè)雜質(zhì)的研究。