高琛 支應(yīng)鵬

摘 要 目的：研究淫羊藿次苷Ⅱ（ICSⅡ）通過調(diào)節(jié)微核醣核酸-141-3p/Notch信號(hào)通路/核因子E2相關(guān)因子2（miR-141-3p/Notch/Nrf2）軸對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能的改善作用。方法：將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組（20 mg/kg）和ICSⅡ低、中、高劑量組（4、8、16 mg/kg），每組20只。構(gòu)建局灶性腦缺血大鼠模型24 h后，分別灌胃生理鹽水或相應(yīng)藥物，每天2次，連續(xù)給藥3 d。對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分;采用2， 3， 5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法測(cè)定大鼠腦梗死體積;測(cè)定大鼠腦組織含水量、血腦屏障通透性;采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定大鼠腦組織中miR-141-3p表達(dá)水平;采用Western blotting法測(cè)定大鼠腦組織中Notch、Nrf2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦組織中Notch-1、Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），腦梗死體積、腦組織含水量、血腦屏障通透性、miR-141-3p表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;腦皮質(zhì)細(xì)胞分布雜亂，可見大量神經(jīng)細(xì)胞炎性浸潤(rùn)和壞死。與模型組比較，ICSⅡ各劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦組織中Notch-1、Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），腦梗死體積、腦組織含水量、血腦屏障通透性、miR-141-3p表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;腦皮質(zhì)細(xì)胞排列規(guī)則，神經(jīng)細(xì)胞炎性浸潤(rùn)和壞死數(shù)明顯減少。結(jié)論：ICSⅡ能促進(jìn)局灶性腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，這可能與下調(diào)miR-141-3p水平，從而激活Notch/Nrf2軸有關(guān)。

關(guān)鍵詞 淫羊藿次苷Ⅱ;微核醣核酸-141-3p;Notch信號(hào)通路;核因子E2相關(guān)因子2;局灶性腦缺血模型;大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effects of icariside Ⅱ （ICS Ⅱ） on neurological function of focal cerebral ischemia model rats by regulating miR-141-3p/Notch/nuclear factor erythroid-2-related factor 2 （Nrf2） axis （miR-141-3p/Notch/Nrf2）. METHODS： The rats were divided into sham operation group， model group， nimodipine group （20 mg/kg） and ICS Ⅱ low-dose， medium-dose and high-dose groups （4， 8， 16 mg/kg）， with 20 rats in each group. Twenty-four hours after establishing focal cerebral ischemia model， model rats were given relevant medicine or normal saline intragastrically， twice a day， for consecutive 3 d. The neurological deficit of rats in each group was scored; the volume of cerebral infarction was measured by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining; water content of cerebral tissue and the permeability of blood-brain barrier were measured; HE staining was performed to observe the pathological change of cerebral tissue of rats; the expression of miR-141-3p in cerebral tissue of rats was measured by qRT-PCR; the protein expression of Notch and Nrf2 in cerebral tissue of rats were measured by Western blotting assay. RESULTS： Compared with sham operation group， the neurological deficit score， expression of Notch-1 and Nrf2 in model group were significantly lowered （P<0.05）; infarction volume， brain water content， the permeability of blood-brain barrier and the expression of miR-141-3p in cerebral tissue were increased significantly （P<0.05）; the distribution of cortical cells was disordered， and inflammatory infiltration and necrosis were observed in a large number of nerve cells. Compared with model group， the neurological deficit score， the protein expression of Notch-1 and Nrf2 in cerebral tissue were significantly increased in ICSⅡgroups （P<0.05）; infarction volume， brain water content， the permeability of blood-brain barrier and the expression of miR-141-3p in cerebral tissue were decreased significantly （P<0.05）; the arrangement of cortical cells was regular， and the inflammatory infiltration and necrosis of nerve cells were decreased significantly. CONCLUSIONS： ICS Ⅱ can promote the recovery of neurological function in focal cerebral ischemic model rats， which may be related to down-regulation of miR-141-3p and activation of Notch/Nrf2 axis.

KEYWORDS Icariside Ⅱ; miR-141-3p; Notch; Nuclear factor erythroid-2-related factor 2; Focal cerebral ischemia model; Rats

缺血性腦卒中是一種病因復(fù)雜、危害性大的腦血管疾病，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、肢體殘疾等癥狀，而且腦組織長(zhǎng)期缺血缺氧還可引起永久性神經(jīng)元凋亡和損傷，嚴(yán)重影響患者的生命健康和生活質(zhì)量[1-2]。臨床上治療缺血性腦卒中常采用調(diào)節(jié)血壓、調(diào)節(jié)血脂、抗血小板聚集、溶栓等方法，同時(shí)在該疾病早期進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)也十分重要[3]。目前，采用中藥治療缺血性腦卒中已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，其中淫羊藿的主要活性成分淫羊藿次苷Ⅱ（IcarisideⅡ，ICSⅡ）具有延緩衰老、抗疲勞、改善心腦血管功能、抗氧化等藥理作用[4]。研究還發(fā)現(xiàn)，ICSⅡ具有緩解大鼠腦缺血再灌注損傷的作用[5-6]。微核醣核酸-141-3p（miR-141-3p）是非編碼微小RNA（miRNA），能夠與目標(biāo)mRNA的3-非編碼區(qū)域堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制[7]。Notch信號(hào)通路（Notch）與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，在血管發(fā)育、血管損傷修復(fù)及減輕炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[8]。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）具有抗炎和抗氧化作用，研究發(fā)現(xiàn)，Notch-1能夠靶向調(diào)控Nrf2的表達(dá)，進(jìn)而參與抗氧化作用[9]?；诖耍狙芯客ㄟ^構(gòu)建局灶性腦缺血大鼠模型并使用ICSⅡ進(jìn)行干預(yù)，旨在從miR-141-3p/Notch/Nrf2軸探討ICSⅡ?qū)衷钚阅X缺血模型大鼠神經(jīng)功能的改善作用，為ICSⅡ在臨床上用于缺血性腦卒中的治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

ZF-388型全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（深圳三利化學(xué)品有限公司）;CFX96型qRT-PCR擴(kuò)增儀、Trans-Blot TurboTM 型Western轉(zhuǎn)膜儀、DDY-10型電泳儀、JS680D型凝膠成像儀、蛋白凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;HY704-4型雙層烘箱（上海精密儀器儀表有限公司）;UV-1800紫外-可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）;AB204-A型電子分析天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司];SMZ645型光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）;KH19型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

ICSⅡ原料藥（南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：MH150601S02，純度：98%）;甲酰胺（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：F809511）;RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：DP430）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Genecopoeia公司，批號(hào)：C0210B）;ECL蛋白顯色試劑盒（上海生工生物工程有限公司，批號(hào)：32109）;兔抗鼠Notch-1單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：EP1238Y）;兔抗鼠β-actin單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：A5441）;兔抗鼠Nrf2多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BS-1074R）;辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（批號(hào)：873703275671）、伊文思藍(lán)（EB）染色液（批號(hào)：DK0001）、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)：C200201）、2， 3， 5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色液（批號(hào)：181532）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20170502）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水（三級(jí)）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠130只，7～8周齡，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2018-026]。大鼠飼養(yǎng)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房屏障環(huán)境[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（魯）2019-0005]，室溫為20～25 ℃，相對(duì)濕度為50%～60%，通風(fēng)良好。大鼠自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循“3R”原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

造模前大鼠均行神經(jīng)功能評(píng)分（方法見“2.2”項(xiàng)），剔除異常大鼠后，采用文獻(xiàn)方法[10]改良后構(gòu)建局灶性腦缺血大鼠模型：取110只大鼠進(jìn)行造模，腹腔注射2%戊巴比妥鈉以麻醉大鼠，固定，用手術(shù)剪剪開大鼠頸部皮膚，分離頸內(nèi)、頸外、頸總動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈的近心端，夾閉遠(yuǎn)端頸內(nèi)動(dòng)脈，用手術(shù)剪在距頸內(nèi)動(dòng)脈分叉1 cm處剪一切口，將頭端涂上硅膠的尼龍線自大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈緩慢插入頸內(nèi)動(dòng)脈至線栓到達(dá)大腦中動(dòng)脈分叉處（此時(shí)有少許阻力），固定線栓，縫合傷口，2 h后以抽回線栓恢復(fù)再灌注，大鼠造模完成。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：進(jìn)行提尾懸空實(shí)驗(yàn)時(shí)，即大鼠對(duì)側(cè)肢體癱瘓、同側(cè)眼裂減小、向?qū)?cè)轉(zhuǎn)彎。另取20只大鼠作為假手術(shù)組，除不結(jié)扎和插線外，其余操作步驟與上述方法相同。造模結(jié)束后，將造模成功的100只大鼠分為模型組、尼莫地平組（20 mg/kg）[11]和ICSⅡ低、中、高劑量組（4、8、16 mg/kg）[6]，每組20只。造模24 h后，各給藥組大鼠每天9：00和 ?16：00時(shí)灌胃相應(yīng)藥物1次，每天2次，每次給藥體積均為2 mL，連續(xù)給藥3 d;假手術(shù)組和模型組大鼠同法灌胃等體積生理鹽水。

2.2 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分

在給藥第0天（即造模后24 h后、給藥前即刻）、給藥第1天和第3天，根據(jù)文獻(xiàn)方法[12]對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分：從前肢對(duì)稱外展（對(duì)稱伸展3分、輕度不對(duì)稱伸展2分、顯著不對(duì)稱伸展1分、偏癱0分）、體態(tài)對(duì)稱運(yùn)動(dòng)（對(duì)稱運(yùn)動(dòng)3分、輕度不對(duì)稱運(yùn)動(dòng)2分、顯著不對(duì)稱運(yùn)動(dòng)1分、偏癱0分）、兩側(cè)身體觸覺反射（雙側(cè)對(duì)稱反應(yīng)3分、一側(cè)反應(yīng)遲鈍2分、一側(cè)無反應(yīng)1分）、自主活動(dòng)（活動(dòng)正常3分、輕度影響2分、重度影響1分、無自主運(yùn)動(dòng)0分）、觸須對(duì)鈍棒觸及的反應(yīng)（對(duì)稱反應(yīng)3分、不對(duì)稱反應(yīng)2分、一側(cè)無反應(yīng)1分）、攀爬（攀爬容易及抓持有力3分、一側(cè)損害表現(xiàn)2分、不能攀爬或轉(zhuǎn)圈1分）等6個(gè)方面評(píng)估大鼠神經(jīng)功能損傷的程度，總分值為3～18分，得分越高說明其神經(jīng)功能損傷越小。

2.3 大鼠腦梗死體積測(cè)定

末次給藥24 h后，各組隨機(jī)選取5只大鼠，脫頸處死后取出腦組織，置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min后切片，避光條件下放入含有TTC染色液的棕色瓶中，于37 ℃下染色30 min;染色后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，以濾紙吸干后，置于顯微鏡下觀察。鏡下可見大鼠腦組織正常區(qū)域呈紅色，梗死區(qū)域呈蒼白色。采用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算各組大鼠腦組織的梗死體積。

2.4 大鼠腦組織含水量測(cè)定

末次給藥24 h后，各組隨機(jī)選取5只大鼠，脫頸處死后立刻手術(shù)開顱，取出腦組織，以濾紙吸干表面血跡，稱定腦濕質(zhì)量（W）;隨后將腦組織置于80 ℃烘箱中，烘干至恒質(zhì)量，稱定其干質(zhì)量（D）。根據(jù)公式計(jì)算大鼠腦組織含水量：腦組織含水量（%）=（W-D）/W×100%。

2.5 大鼠血腦屏障通透性測(cè)定

末次給藥24 h后，各組隨機(jī)選取5只大鼠，采用2%血-腦脊液屏障通透性示蹤劑EB于大鼠尾靜脈注射。2 h后，脫頸處死大鼠并開顱取腦組織，稱定腦組織質(zhì)量，隨后置于含有甲酰胺（1 mL/100 g）的離心管中，37 ℃水浴48 h，以3 000 r/min離心10 min后，取上清液。使用分光光度計(jì)在635 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定上清液的吸光度。以EB含量（μg/g）為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制EB標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腦組織中EB含量。EB含量越高，表示大鼠血腦屏障的通透性越大。

2.6 大鼠腦組織的病理學(xué)變化觀察

末次給藥24 h后，各組取剩余5只大鼠，脫頸處死后立刻手術(shù)開顱，取出腦組織，一部分保存于-80 ℃的冰箱中待用，一部分用4%多聚甲醛溶液固定24 h。固定后的腦組織用石蠟包埋，切片，采用HE染色后，置于顯微鏡下觀察腦組織病理學(xué)變化。

2.7 大鼠腦組織中miR-141-3p表達(dá)水平檢測(cè)

采用熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)。取出“2.6”項(xiàng)下冷凍的腦組織適量，采用RNA提取試劑盒提總RNA，再使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒處理得到cDNA。用qRT-PCR儀測(cè)定miR-141-3p表達(dá)水平。反應(yīng)體系（20 ?L）：cDNA模板1 ?L，上游引物0.5 ?L，下游引物0.5 ?L，H2O 8 ?L，2×Mix 10 ?L。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s、62 ℃退火30 s，78 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸5 min。用2-ΔΔCt法對(duì)miR-141-3p表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。使用在線軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)所得qRT-PCR所需引物，其中miR-141-3p上游引物序列為5′-TAACACTGTCTGGTAAAGATGG-3′，下游引物序列為5′- ATCTTTACCAGACAGTGTTATT-3′，引物長(zhǎng)度為60 bp;內(nèi)參U6上游引物序列為5′-ATTGGAACGATACA- GAGAAGATT-3′，下游引物序列為5′-GGAACGCTT- CACGAATTTG-3′，引物長(zhǎng)度為100 bp。

2.8 大鼠腦組織中Notch-1、Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blotting法檢測(cè)。取出“2.6”項(xiàng)下冷凍的腦組織適量，加入RIPA蛋白裂解液，研磨均勻，以3 000 r/min離心10 min后，取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白水平。蛋白煮沸變性后，取20 ?g，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，濕法轉(zhuǎn)膜，以5% BSA封閉結(jié)合位點(diǎn)，再分別加入Notch-1、Nrf2、β- actin一抗（1 ∶ 2 000），4 ℃孵育過夜;加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1 ∶ 5 000），37 ℃孵育1 h，使用ECL蛋白顯色試劑盒曝光顯色后，于凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察拍照。使用軟件Image Lab 5.1分析各蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)灰度值，來表示其表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

與假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平組、ICSⅡ各劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，給藥第1、3 天，除給藥第1天時(shí)ICSⅡ低劑量組外，ICSⅡ各劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均顯著升高（P<0.05）;ICSⅡ高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分與尼莫地平組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表1。

3.2 各組大鼠腦梗死體積比較

與假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平組、ICSⅡ各劑量組大鼠腦梗死體積顯著增大（P<0.05）;與模型組比較，ICSⅡ各劑量組大鼠腦梗死體積均有不同程度縮小，且ICSⅡ中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;ICSⅡ高劑量組大鼠腦梗死體積與尼莫地平組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見圖1、表2。

3.3 各組大鼠腦組織含水量和血腦屏障通透性比較

與假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平組、ICSⅡ各劑量組大鼠腦組織含水量和血腦屏障通透性均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，ICSⅡ各劑量組大鼠腦組織含水量和血腦屏障通透性顯著降低（P<0.05）;ICSⅡ高劑量組大鼠腦組織含水量和血腦屏障通透性與尼莫地平組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表3。

3.4 各組大鼠腦組織病理學(xué)變化比較

假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞分布均勻，核仁可見、呈橢圓形、輪廓可辨，未見神經(jīng)細(xì)胞炎性浸潤(rùn)或壞死;模型組可見腦皮質(zhì)細(xì)胞分布雜亂，核仁固縮、破裂，可見大量神經(jīng)細(xì)胞炎性浸潤(rùn)和壞死;ICSⅡ各劑量組大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞排列規(guī)則，核仁完整，神經(jīng)細(xì)胞炎性浸潤(rùn)和壞死數(shù)減少，詳見圖2。

3.5 各組大鼠腦組織中miR-141-3p表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平組、ICSⅡ各劑量組大鼠腦組織中miR-141-3p表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，ICSⅡ各劑量組大鼠腦組織中miR-141-3p表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;ICSⅡ高劑量組大鼠腦組織中miR-141-3p表達(dá)水平與尼莫地平組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表4。

3.6 各組大鼠腦組織中Notch-1、Nrf2蛋白表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組、尼莫地平組、ICSⅡ各劑量組大鼠腦組織中Notch-1、Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，ICSⅡ各劑量組大鼠腦組織中Notch-1、Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;ICSⅡ高劑量組大鼠腦組織中Notch-1、Nrf2蛋白表達(dá)水平與尼莫地平組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見圖3、表5。

4 討論

腦血管疾病是威脅人類生命健康的三大疾病之一，主要表現(xiàn)為缺血性腦卒中，其病因?yàn)槟X動(dòng)脈粥樣硬化引起腦血栓、栓塞形成，使腦組織局部血液循環(huán)障礙，導(dǎo)致腦組織局部缺氧、缺血，誘發(fā)水腫、神經(jīng)損傷等病變[13]。目前，中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中受到越來越多的關(guān)注，其中中藥淫羊藿的主要活性成分ICSⅡ?qū)π哪X血管系統(tǒng)疾病具有一定防治作用[4]。本研究通過構(gòu)建局灶性腦缺血大鼠模型，并使用ICSⅡ進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)以急性缺血性腦卒中的常用治療藥物尼莫地平為陽(yáng)性對(duì)照，探討ICSⅡ?qū)θ毖阅X卒中的作用及相關(guān)機(jī)制。

氧化應(yīng)激損傷是造成缺血性腦卒中的主要因素，研究發(fā)現(xiàn)，ICSⅡ能降低活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的水平，提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性，從而抑制過氧化氫誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡[14]。此外，研究表明，ICSⅡ能改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，提高SOD活性，下調(diào)MDA水平，從而緩解大鼠的腦組織損傷[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，ICSⅡ可通過下調(diào)海馬體組織中β淀粉樣多肽1-42（Aβ1-42）的水平，上調(diào)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ（LC3-Ⅱ）/LC3-Ⅰ的比值，以改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶減退癥狀[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低;腦梗死體積、腦組織含水量和血腦屏障通透性升高;腦皮質(zhì)細(xì)胞分布雜亂以及大量神經(jīng)細(xì)胞炎性浸潤(rùn)和壞死，說明模型大鼠出現(xiàn)腦組織損傷，具有缺血性腦卒中的癥狀。經(jīng)ICSⅡ干預(yù)后，大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分升高;腦梗死體積、腦組織含水量和血腦屏障通透性降低;腦皮質(zhì)細(xì)胞排列規(guī)則，神經(jīng)細(xì)胞炎性浸潤(rùn)和壞死數(shù)減少，說明ICSⅡ能夠促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，改善缺血性腦卒中癥狀。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2是抗氧化應(yīng)激的主要通路之一，柚皮素可能通過調(diào)控Nrf2通路，促進(jìn)腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞增殖和抑制其凋亡，從而緩解氧化應(yīng)激損傷[13];另有研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸可降低海藻樣ECH相關(guān)蛋白1 ?（Keap1）的水平，激活Nrf2表達(dá)，從而導(dǎo)致抗氧化因子表達(dá)增加，降低對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝毒性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平降低，說明Nrf2與缺血性腦卒中密切相關(guān);經(jīng)ICSⅡ干預(yù)后，大鼠腦組織中Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高，說明ICSⅡ可上調(diào)Nrf2表達(dá)以緩解缺血性腦卒中的癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，Notch和Nrf2相互關(guān)聯(lián)，可以相互調(diào)節(jié)[17];隨后Yamaguchi M等[9]證明，Nrf2是Notch-1的下游調(diào)控因子。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中Notch-1蛋白表達(dá)水平顯著降低，經(jīng)ICSⅡ干預(yù)后，大鼠腦組織中Notch-1蛋白表達(dá)水平顯著升高，說明Notch-1與Nrf2可能存在一定的相關(guān)性，推測(cè)Notch-1可通過調(diào)控Nrf2水平參與缺血性腦卒中的進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-141-3p水平可激活Notch/Nrf2軸，從而發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗水腫等作用，減輕百草枯引起的急性肺損傷[18]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中miR-141-3p表達(dá)水平顯著升高，說明miR-141-3p在缺血性腦卒中大鼠腦組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，可促進(jìn)缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展;經(jīng)ICSⅡ干預(yù)后，大鼠腦組織中miR-141-3p表達(dá)水平降低，提示miR-141-3p表達(dá)下調(diào)，可使Notch mRNA翻譯能力減弱，導(dǎo)致Notch/Nrf2軸活化，從而緩解缺血性腦卒中癥狀，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

綜上所述，ICSⅡ可緩解大鼠局灶性腦缺血癥狀，促進(jìn)其神經(jīng)功能恢復(fù)，這可能與下調(diào)miR-141-3p水平、激活Notch/Nrf2軸相關(guān)。但本研究未深入探討miR-141- 3p與Notch/Nrf2軸之間的具體調(diào)控機(jī)制，有待于后續(xù)研究加以完善。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] HASEGAWA Y，NAKAGAWA T，MATSUI K，et al. Renal denervation in the acute phase of ischemic stroke provides brain protection in hypertensive rats[J]. Stroke，2017，48（4）：1104-1107.

[ 2 ] PIEROT L，GAWLITZA M，SOIZE S. Techniques for endovascular treatment of acute ischemic stroke[J]. Rev Neurol：Paris，2017，173（9）：594-599.

[ 3 ] KAMAL N，JEERAKATHIL T，MRKLAS K，et al. Improving door-to-needle times in the treatment of acute ischemic stroke across a Canadian province：methodology[J]. Crit Pathw Cardiol，2019，18（1）：51-56.

[ 4 ] 鞠靜，譚人千，潘宇政.淫羊藿次苷Ⅱ的藥理作用研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2019，17（1）：65-69.

[ 5 ] 馬山，麻培培，諶文元，等.基于抗氧化作用的淫羊藿抗衰老藥效研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2017，34（6）：836-840.

[ 6 ] 龍隆，徐應(yīng)淑，雷鳴，等.淫羊藿次苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注損傷的作用[J].中國(guó)新藥與臨床雜志，2017，36（10）：598-602.

[ 7 ] LIEP J，KILIC E，MEYER HA，et al. Cooperative effect of miR-141-3p and miR-145-5p in the regulation of targets in clear cell renal cell carcinoma[J]. PLoS One，2016. DOI：10.1371/journal.pone.0157801.

[ 8 ] BALAGANAPATHY P，BAIK SH，MALLILANKARAMAN K，et al. Interplay between Notch and p53 promotes neuronal cell death in ischemic stroke[J]. J Cereb Blood Flow Metab，2018，38（10）：1781-1795.

[ 9 ] YAMAGUCHI M，MURAKAMI S，YONEDA T，et al. Evidence of Notch-Hesr-Nrf2 axis in muscle stem cells，but absence of Nrf2 has no effect on their quiescent and undifferentiated state[J]. PLoS One，2015. DOI：10.1371/journal.pone.0138517.

[10] LONGA EZ，WEINSTEIN PR，CARLSON S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke，1989，20（1）：84-91.

[11] 李艷，宋亞剛，苗明三，等.月季花總黃酮對(duì)局灶性腦缺血再灌注模型大鼠的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019，25（12）：64-70.

[12] GARCIA JH，WAGNER S，LIU KF，et al. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats[J]. Stroke，1995，26（4）：627-635.

[13] KWAK KA，KWON HB，LEE JW，et al. Current perspectives regarding stem cell-based therapy for ischemic stroke[J]. Curr Pharm Des，2018，24（28）：3332-3340.

[14] 高健美，雷鳴，令狐浪，等.基于ROS/GSK-3β信號(hào)通路研究淫羊藿次苷Ⅱ?qū)^氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床，2016，32（5）：23- 27.

[15] 鄧媛媛，李安霞，尹彩霞，等.淫羊藿次苷Ⅱ通過誘導(dǎo)自噬改善鏈脲佐菌素所致的大鼠學(xué)習(xí)記憶減退[J].中國(guó)新藥與臨床雜志，2017，36（6）：347-352.

[16] HUA K，SHENG X，LI TT，et al. The edaravone and 3-n- butylphthalide ring-opening derivative 10b effectively attenuates cerebral ischemia injury in rats[J]. Acta Pharmacol Sin，2015，36（8）：917-927.

[17] WAKABAYASHI N，CHARTOUMPEKIS DV，KENSLER TW. Crosstalk between Nrf2 and Notch signaling[J]. Free Radic Biol Med，2015，88（Pt B）：158-167.

[18] JIN Y，LIU W，LIU X，et al. Transplantation of endothe- ?lial progenitor cells attenuated paraquat-induced acute lung injury via miR-141-3p-Notch-Nrf2 axis[J]. Cell Biosci，2018. DOI：10.1186/s13578-018-0219-1.

（收稿日期：2020-01-14 修回日期：2020-09-07）

（編輯：羅 瑞）