朱璨 王嫣 李堯鋒 付云燕 唐文超 楊長福 王和生

摘 要 目的：研究二苯乙烯苷（TSG）對人乳腺癌T-47D細(xì)胞增殖及其雌激素受體（ER）表達(dá)的影響，探討其雌激素樣作用及可能機(jī)制。方法：以ER陽性人乳腺癌T-47細(xì)胞為對象，以β-雌二醇（β-E2，1×10-8 mol/L）為陽性對照，采用CKK-8法檢測不同濃度TSG（1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4 mol/L）作用24、48、72 h后的細(xì)胞增殖情況，并計(jì)算增殖率;分別采用Western blotting法和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測經(jīng)低、中、高濃度TSG（1×10-8、1×10-6、1×10-4 mol/L）作用48 h后細(xì)胞中ER-α、ER-β蛋白及其mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果：經(jīng)不同濃度TSG作用24、48、72 h后，各給藥組各時(shí)間點(diǎn)（除β-E2組48 h外）的細(xì)胞增殖率均較空白組顯著升高，且TSG 1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L組顯著高于β-E2組（P<0.05或P<0.01）。經(jīng)低、中、高濃度TSG作用48 h后，各給藥組細(xì)胞中ER-α、ER-β蛋白及其mRNA的表達(dá)量均較空白組顯著升高（P<0.05或P<0.01）;且TSG低濃度組ER-β蛋白的表達(dá)量，各濃度組細(xì)胞中ER-α mRNA以及低、高濃度組ER-β mRNA的表達(dá)量均顯著高于β-E2組（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：TSG可誘導(dǎo)T-47D細(xì)胞的體外增殖，并可通過促進(jìn)ER-α、ER-β蛋白及其mRNA的表達(dá)來發(fā)揮雌激素樣作用;這種作用在一定濃度下強(qiáng)于β-E2。

關(guān)鍵詞 二苯乙烯苷;植物雌激素;人乳腺癌T-47D細(xì)胞;細(xì)胞增殖;雌激素受體

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects of stilbene glucoside （TSG） on the proliferation and estrogen receptor （ER） of human breast cancer T-47D cells， and to explore its estrogen-like effect and potential mechanism. METHODS： Taking ER positive human breast cancer T-47D cells as subjects， using β-estradiol （β-E2，1×10-8 mol/L） as positive control， CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation after treated with different concentrations of TSG （1×10-8， 1×10-7， 1×10-6， 1×10-5， 1×10-4 mol/L） for 24， 48， 72 h; the cell proliferation rate was calculated. Western blotting assay and RT-PCR methods were adopted to detect the protein and mRNA expression of ER-α and ER-β in cells after treated with low， medium and high concentrations of TSG （1×10-8， 1×10-6， 1×10-4 mol/L） for 48 h. RESULTS： After treated with different concentrations of TSG for 24， 48， 72 h， the cell proliferation rate of each administration group at each time point （except for β-E2 group at 48 h） increased significantly， compared with blank group; those of TSG groups （1×10-5， 1×10-6， 1×10-7 mol/L） were significantly higher than β-E2 group （P<0.05 or P<0.01）. After treated with low， medium and high concentrations of TSG for 48 h， protein and mRNA expression of ER-α and ER-β in cells were increased significantly， compared with blank group （P<0.05 or P<0.01）; protein expression of ER-β in TSG low concentration group， mRNA expression of ER-α in TSG groups as well as mRNA expression of ER-β in TSG low and high concentration groups were significantly higher than β-E2 group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TSG can induce the in vitro proliferation of T-47D cells and exert estrogen-like effects by promoting protein and mRNA expression of ER-α and ER-β， which is stronger than that of β-E2 at a certain concentration.

KEYWORDS ? Stilbene glucoside; Phytoestrogen; Human breast cancer T-47D cells; Cell proliferation; Estrogen receptor

二苯乙烯苷化學(xué)名為2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷（2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-Ο-β-D-glucoside，以下簡稱“TSG”），易溶于水，是中藥制首烏的主要活性成分，且其含量是制首烏質(zhì)量控制的專屬性指標(biāo)[1]。制首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.干燥塊根的炮制加工品，具有補(bǔ)肝腎、益精血、壯筋骨、烏須發(fā)之效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，制首烏及其活性成分TSG具有抗衰老、防治骨質(zhì)疏松、改善血管性癡呆等作用[2-3]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，制首烏具有植物雌激素樣作用，其水煎劑可調(diào)節(jié)去卵巢大鼠的生殖軸，亦能抑制雷公藤多苷對大鼠生殖功能的破環(huán)，且制首烏含藥血清可促進(jìn)人乳腺癌T-47D細(xì)胞的增殖[4-6];且前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，TSG能增加性未成熟小鼠的子宮系數(shù)，調(diào)節(jié)性激素水平，增強(qiáng)子宮雌激素受體（ER-α、ER-β）的表達(dá)，亦提示TSG具有雌激素樣活性[7]?；诖耍菊n題組擬研究TSG對雌激素受體陽性[ER（+）]人乳腺癌T-47D細(xì)胞增殖及其ER表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討TSG的雌激素樣作用及分子機(jī)制，為制首烏植物雌激素樣作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為雌激素依賴性腫瘤（如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌）患者的治療提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Eclipse TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）;Synergy 2型熒光/吸收光酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）;BB15型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Mini-PROTEAN Tetra型電泳槽、ChemicDoc Touch型超高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、C1000 Touch Thermal Cycler型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）;NanoPhotometer型超微量分光光度計(jì)（德國Implen公司）;Mi- crofuge 20R型高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman 公司）。

1.2 藥品與試劑

TSG對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：J17O8Z45941，純度：99.9%）;β-雌二醇對照品（β-E2，陽性對照，北京索萊寶科技有限公司，批號：521C022，純度：≥98.0%）;DMEM高糖培養(yǎng)液、無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號分別為8118240、2003881、1967534）;胎牛血清（FBS）、活性炭-葡聚糖苷處理的胎牛血清（CDT-FBS，以色列Biological Industries公司，批號分別為1829596、1742900）;兔源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、ER-α抗體（美國CST公司，批號分別為4、6）;兔源ER-β抗體（美國Abcam公司，批號：GR3211677-6）;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）二抗（美國Jackson Immuno Research公司，批號：139799）;青-鏈霉素雙抗、CCK-8試劑盒、細(xì)胞裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS- PAGE）凝膠配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、快速封閉液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為091818180923、013018181008、082018180910、081518180916、103018181030、0710181- 80906、110818181108）;TRNzol Universal總RNA提取試劑、FastKing一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，批號分別為R6917、Q6214];PCR引物（序列及擴(kuò)增片段長度見表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)、合成;二甲基亞砜（DMSO）等試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 細(xì)胞

ER（+）人乳腺癌T-47D細(xì)胞株由上海復(fù)祥生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及預(yù)處理

將T-47D細(xì)胞置于含10%FBS、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2、相對飽和濕度的條件下培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。于試驗(yàn)開始前3 d，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗2次后，替換為含5%CDT-FBS、1%青-鏈霉素雙抗的無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以進(jìn)一步增加細(xì)胞對雌激素樣物質(zhì)的敏感性[8]。

2.2 細(xì)胞增殖情況檢測

采用CCK-8法檢測。取“2.1”項(xiàng)下經(jīng)培養(yǎng)且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞適量，用PBS清洗2次，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，以不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度，并按1×103個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔總體積為150 μL。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，將其隨機(jī)分為空白組、β-E2組[1×10-8 mol/L，以含DMSO、5%CDT-FBS、1%青鏈霉素、雙抗的無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋（DMSO最終體積分?jǐn)?shù)為0.000 3%），濃度參考文獻(xiàn)方法[9]和本課題組前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置;下同]和TSG不同濃度組（1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8 mol/L，濃度參考本課題組前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。吸棄上清液，空白組加入含5%CDT-FBS、1%青-鏈霉素雙抗的無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)液150 μL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物以及5%CDT-FBS、1%青-鏈霉素雙抗的無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)液150 μL。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，各孔加入CCK-8試劑15 μL，于37 ℃孵育2 h，使用熒光/吸收光酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測各孔的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞增殖率：增殖率（%）=（試驗(yàn)組平均A值/空白組平均A值）×100%。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 細(xì)胞中ER-α、ER-β蛋白表達(dá)情況檢測

采用Western blotting法檢測。取“2.1”項(xiàng)下經(jīng)培養(yǎng)且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞適量，用PBS清洗2次，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，以不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度，并按1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，每孔總體積為2 mL。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，將其隨機(jī)分為空白組、β-E2組（1×10-8 mol/L）和TSG低、中、高濃度組（濃度參考“2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。吸棄上清液，空白組加入含5%CDT-FBS、1%青-鏈霉素雙抗的無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)液2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物以及5%CDT-FBS、1%青-鏈霉素雙抗的無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)液2 mL。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解后，以12 000 r/min離心15 min，取上清液按BCA法測定蛋白濃度。將蛋白于100 ℃變性5 min后，取20 μg行SDS-PAGE。電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉15 min，加入ER-α、ER-β和β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液清洗10 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 10 000），室溫孵育1 h;用TBST溶液清洗10 min×3次，經(jīng)ECL顯色后，于超高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上成像。使用Image-Pro Express 5.1軟件分析，以相應(yīng)蛋白與內(nèi)參β-actin條帶的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞中ER-α、ER-β mRNA表達(dá)情況檢測

采用RT-PCR法檢測。取“2.1”項(xiàng)下經(jīng)培養(yǎng)且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，按“2.3”項(xiàng)下方法培養(yǎng)、分組、給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，參照TRNzol Universal總RNA提取試劑說明書方法提取總RNA，使用超微量分光光度計(jì)測定其純度（即A260 nm/A280 nm值，若該值為1.8～2.0即表明其純度符合試驗(yàn)要求[10]）。參照FastKing一步法RT-PCR試劑盒說明書方法進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系（50 μL）：總RNA 2 μL，2×FastKing One Step RT-PCR Master Mix 25 μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μL，上/下游引物各1.25 μL、無RNA酶的ddH2O 18.5 μL。反應(yīng)條件：40 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min;95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)35次;72 ℃再延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，于超高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上成像。使用Image Lab 5.2.1軟件分析，以相應(yīng)基因與內(nèi)參β-actin條帶的灰度值比值作為目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)量。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TSG對T-47D細(xì)胞增殖的影響

與空白組比較，β-E2組和TSG各濃度組各時(shí)間點(diǎn)（除β-E2組48 h外）的細(xì)胞增殖率均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且用藥72 h時(shí)TSG 1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L組的細(xì)胞增殖率均顯著高于β-E2組（P<0.05），詳見表2。根據(jù)上述結(jié)果，本研究以1×10-8、1×10-6、1×10-4 mol/L作為TSG的低、中、高濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 TSG對T-47D細(xì)胞中ER-α、ER-β蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，各給藥組細(xì)胞中ER-α、ER-β蛋白的表達(dá)量均顯著升高，且TSG低濃度組ER-β蛋白的表達(dá)量顯著高于β-E2組（P<0.05或P<0.01）。其中，β-E2組細(xì)胞中ER-α、ER-β蛋白的表達(dá)量分別增加了56%、29%，TSG低、中、高濃度組細(xì)胞中上述蛋白的表達(dá)量分別增加了61%、69%、30%（ER-α）和83%、28%、34%（ER-β），詳見圖1、表3。

3.3 TSG對T-47D細(xì)胞中ER-α、ER-β mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，各給藥組細(xì)胞中ER-α、ER-β mRNA的表達(dá)量均顯著升高，且TSG各濃度組ER-α mRNA以及TSG低、高濃度組ER-β mRNA的表達(dá)量均顯著高于β-E2組（P<0.05或P<0.01）。其中，β-E2組細(xì)胞中ER-α、ER-β mRNA的表達(dá)量分別增加了22%、27%，TSG低、中、高濃度組細(xì)胞中上述mRNA的表達(dá)量分別增加了52%、127%、41%（ER-α）和95%、26%、131%（ER-β），詳見圖2、表3。

4 討論

雌激素是女性體內(nèi)重要的性激素，不僅能促進(jìn)女性生殖器官發(fā)育、維持第二性征，而且在骨代謝、心血管活動(dòng)和神經(jīng)功能中也具有重要作用[11]。雌激素水平低下可引發(fā)一系列疾病，如骨質(zhì)疏松、更年期綜合征、心血管疾病等，嚴(yán)重影響了女性的正常生活;同時(shí)，長期應(yīng)用雌激素替代療法的副作用較多，且可增加雌激素依賴性腫瘤（如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等）發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[11]。因此，不良反應(yīng)少的植物雌激素逐漸受到學(xué)者的關(guān)注，現(xiàn)已成為相關(guān)研究的熱點(diǎn)之一[12]。

植物雌激素可與ER結(jié)合而發(fā)揮雌激素樣作用，在調(diào)節(jié)ER表達(dá)水平的同時(shí)，亦可用于治療骨質(zhì)疏松、圍絕經(jīng)期綜合征、心血管疾病、肥胖等癥[12-13]。ER主要包括ER-α和ER-β，其中ER-α的親和力及總體活性更高[14]。TSG是中藥制首烏的主要活性成分，前期研究表明其在體內(nèi)具有一定的植物雌激素作用。為進(jìn)一步探討該化合物雌激素樣活性及作用機(jī)制，本課題組以ER（+）T47-D細(xì)胞（該細(xì)胞含有豐富的ER，易受雌激素或雌激素樣物質(zhì)誘導(dǎo)而增殖，是用于檢測化合物雌激素樣活性的常用細(xì)胞株[15]）為對象，以β-E2為陽性對照，通過體外試驗(yàn)初步考察了不同濃度TSG對細(xì)胞增殖和ER表達(dá)影響。

CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，各給藥組各時(shí)間點(diǎn)（除β-E2組48 h外）的細(xì)胞增殖率均較空白組顯著升高，且用藥72 h時(shí)TSG 1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L組的細(xì)胞增殖率均顯著高于β-E2組。這提示陽性對照藥和TSG均具有促進(jìn)T-47D細(xì)胞增殖的作用，且TSG（1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L）的作用持續(xù)時(shí)間可能較陽性對照藥更長。在本研究過程中發(fā)現(xiàn)，TSG各濃度組細(xì)胞的增殖率均有先升高后降低的趨勢，且在濃度為1×10-6 mol/L（24、72 h）時(shí)達(dá)到峰值;同時(shí)，TSG在1×10-8～1×10-4 mol/L的濃度范圍內(nèi)均可顯著促進(jìn)T-47D細(xì)胞的增殖，故本研究最終選擇了1×10-8、1×10-6、1×10-4 mol/L作為TSG后續(xù)試驗(yàn)中的低、中、高濃度。

本研究進(jìn)一步采用Western blotting法和RT-PCR法分別測定了各組細(xì)胞中ER-α蛋白及其mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，各給藥組細(xì)胞中ER-α蛋白及其mRNA的表達(dá)量均較空白組顯著升高，且TSG各濃度組ER-α mRNA的表達(dá)量均顯著高于β-E2組。這提示陽性對照藥和TSG均可不同程度地上調(diào)ER-α蛋白及其mRNA的表達(dá)。值得注意的是，TSG各濃度組細(xì)胞ER-α蛋白表達(dá)量與β-E2組無明顯差異，但其mRNA的表達(dá)量卻顯著升高，這可能與設(shè)計(jì)ER-α mRNA擴(kuò)增引物時(shí)未包含變異片段，而β-E2可誘導(dǎo)引物外某些序列片段轉(zhuǎn)錄有關(guān)[16]。此外筆者還發(fā)現(xiàn)，在TSG 1×10-8～1×10-4 mol/L的濃度作用范圍內(nèi)，細(xì)胞中ER-α蛋白及其mRNA的表達(dá)呈先上升后下降的趨勢，在TSG 1×10-6 mol/L（中劑量）時(shí)其增強(qiáng)上述指標(biāo)表達(dá)的效果最明顯，這可能與PE的雙重調(diào)節(jié)作用有關(guān)，即低濃度協(xié)同、高濃度拮抗的擬/抗雌激素作用[17]。

本研究同法測定了各組細(xì)胞中ER-β蛋白及其mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，各給藥組細(xì)胞中ER-β蛋白及其mRNA的表達(dá)量均較空白組顯著升高，且TSG低濃度組ER-β蛋白表達(dá)量以及TSG低、高濃度組ER-β mRNA的表達(dá)量均顯著高于β-E2組。這提示陽性對照藥和TSG均可不同程度地上調(diào)ER-β蛋白及其mRNA的表達(dá)，且TSG低濃度的誘導(dǎo)作用普遍強(qiáng)于陽性對照藥。值得注意的是，雖然高濃度TSG也可顯著上調(diào)ER-β mRNA的表達(dá)，但其對蛋白的上調(diào)作用相對較弱，這可能是因?yàn)榈鞍妆磉_(dá)除受mRNA降解的影響外，可能還受蛋白自組裝的影響，從而導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白翻譯水平不同步[18-19]。此外筆者還發(fā)現(xiàn)，在TSG 1×10-8～1×10-4 mol/L的作用濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞中ER-β蛋白呈先下降后升高的趨勢，在TSG 1×10-8 mol/L（低劑量）時(shí)其增強(qiáng)上述指標(biāo)表達(dá)的效果最明顯。ER-β與ER-α變化趨勢不同，這可能與兩種亞型活性不同、應(yīng)答不同有關(guān)[12]。

有文獻(xiàn)指出，植物雌激素的活性較雌激素弱[12]，且本課題組前期研究也得出了類似結(jié)論[6]。但本研究結(jié)果卻提示，TSG的雌激素樣活性與β-E2無明顯差異，甚至在某些濃度下還強(qiáng)于β-E2。筆者分析其原因，認(rèn)為：其一，β-E2多以DMSO為溶劑，若DMSO體積分?jǐn)?shù)超過0.2%則會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性[20];其二，受試物TSG是單一化學(xué)成分，而本課題組前期研究以制首烏為對象，成分復(fù)雜，故作用強(qiáng)弱有所差異。

綜上所述，制首烏活性成分TSG可誘導(dǎo)T-47D細(xì)胞的體外增殖，并可通過促進(jìn)ER蛋白及mRNA的表達(dá)來發(fā)揮雌激素樣作用。本課題組將在此研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討TSG對雌激素依賴性腫瘤細(xì)胞的影響，挖掘其雌激素樣作用的具體機(jī)制，以期為制首烏藥材及其活性成分的雌激素樣作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究以及臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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