劉雯 劉云 劉進(jìn)寶 郭海姣 鄭麗貞 周麗園 鐘燕妮 覃潔萍

摘 要 目的：研究藤茶不同極性部位的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜與其體內(nèi)抗炎作用的譜-效關(guān)系。方法：取藤茶藥材，以70%乙醇回流提取，再分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，或直接以水煎煮，濃縮后獲得藤茶不同極性部位。建立二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥模型，以地塞米松為陽性對(duì)照，分別考察藤茶不同極性部位的抗炎活性。采用HPLC法建立藤茶不同極性部位的指紋圖譜，色譜柱為Poroshell 120 EC-C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為365 nm，進(jìn)樣量為5 μL。運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度法分析藤茶不同極性部位HPLC指紋圖譜共有峰與其抗炎藥效之間的譜-效關(guān)系，計(jì)算關(guān)聯(lián)系數(shù)、關(guān)聯(lián)度并進(jìn)行排序。結(jié)果：小鼠抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藤茶70%乙醇提取總部位、乙酸乙酯萃取部位、水提取部位的抗炎活性最明顯（小鼠耳腫脹抑制率分別為54.07%、30.54%、30.45%）。藤茶不同極性部位HPLC指紋圖譜中共確定了5個(gè)共有峰。譜-效關(guān)系分析結(jié)果顯示，5個(gè)共有峰的關(guān)聯(lián)度均大于0.6;其中，抗炎效果較強(qiáng)的是3號(hào)峰和2號(hào)峰（二氫楊梅素），兩者的關(guān)聯(lián)度均大于0.8。結(jié)論：藤茶對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的抗炎作用是多組分協(xié)同作用的結(jié)果;3號(hào)峰未知成分和二氫楊梅素可能是藤茶抗炎作用的主要活性成分。

關(guān)鍵詞 藤茶;指紋圖譜;抗炎活性;譜-效關(guān)系;灰色關(guān)聯(lián)分析

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the spectrum-effect relationship of HPLC fingerprint of different polar parts of Ampelopsis grossedentata with its in vivo anti-inflammatory effect. METHODS： A. grossedentata was reflux extracted with 70% ethanol， then extracted with petroleum ether， chloroform， ethyl acetate and water saturated n-butanol; or it was directly decocted with water and then concentrated to obtain different polar parts. The xylene-induced mice ear swelling model was established; using dexamethasone as positive control， anti-inflammatory activity of different polar parts of A. grossedentata was investigated. Fingerprints of different polar parts of A. grossedentata were established by HPLC. The determination was performed on Poroshell 120 EC-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The column temperature was 25 ℃. The detection wavelength was set at 365 nm， and sample size was 5 μL. The grey ralational analysis method was used to analyze the spectrum-effect relationship of HPLC fingerprint common peaks of different polar parts of A. grossedentata with its anti-inflammatory effect. The correlation coefficient and correlation degree were calculated and ranked. RESULTS： Anti-inflammatory experiment showed that the anti-inflammatory effects of 70% ethanol extraction part，ethyl acetate extraction part and water extraction part were the most significant （inhibitory rates of ear swelling were 54.07%， 30.54%， 30.45%）. Five common peaks were determined in HPLC fingerprints of different polar parts from A. grossedentata. The spectrum-effect analysis results showed that the correlation of 5 common peaks were higher than 0.6; among them， peak 3 and peak 2 （dihydromyricetin） had the strongest anti- inflammatory effect， and their correlation degrees were both greater than 0.8. CONCLUSIONS： The anti-inflammatory effect of A. grossedentata on xylene-induced ear swelling in mice is the result of multi-component synergy; unknown substance of peak 3 and dihydromyricetin may be the main active components of A. grossedentata.

2.3 藤茶不同極性部位的HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 溶液制備 （1）混合對(duì)照品溶液：精密稱取楊梅素、二氫楊梅素對(duì)照品各適量，置于同一量瓶中，加入甲醇溶解制成每1 mL含楊梅素56.7 μg、二氫楊梅素103.2 μg的混合對(duì)照品溶液。（2）藤茶不同極性部位供試品溶液：分別稱取藤茶Ⅰ～Ⅵ部位樣品各適量，置于不同量瓶中，加入甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為3.00、3.37、6.02、3.05、9.10、3.02 mg/mL（以干膏量計(jì)）的供試品溶液。

2.3.2 色譜條件 色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×250 mm，4.0 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，10%A→15%A;20～40 min，15%A→19%A;40～66 min，19%A→32%A;66～67 min，32%A→10%A）;流速：1 mL/min;柱溫：25 ℃;檢測波長：365 nm;進(jìn)樣量：5 μL。

2.3.3 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗(yàn)：取“2.3.1（2）”項(xiàng)下的Ⅰ部位供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6次，記錄各色譜峰保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果，各色譜峰保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于1%，表明方法精密度良好。（2）重復(fù)性試驗(yàn)：取“2.1.2”項(xiàng)下的Ⅰ部位萃取物樣品共6份，精密稱定，按“2.3.1（2）”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，再按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各色譜峰保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果，各色譜峰保留時(shí)間和峰面積RSD均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“2.3.1（2）”項(xiàng)下的Ⅰ部位供試品溶液，于室溫條件下放置0、2、4、8、12、24 h后再按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各色譜峰保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果，各色譜峰保留時(shí)間和色譜峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在室溫條件下放置24 h較穩(wěn)定。

2.3.4 指紋圖譜的建立 取“2.3.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液和Ⅰ～Ⅵ部位供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，采集色譜圖。將色譜圖“cdf”格式文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》中，生成指紋圖譜。結(jié)果，共確定了5個(gè)共有峰，詳見圖1（圖中，R表示共有模式，S1～S2分別表示Ⅰ～Ⅵ部位供試品溶液）。

2.3.5 HPLC指紋圖譜特征峰的標(biāo)定 取“2.3.1（1）”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析并采集色譜圖，然后與“2.3.4”項(xiàng)下得到的色譜圖共有峰進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，2號(hào)峰為雙氫楊梅素，5號(hào)峰為楊梅素。混合對(duì)照品溶液和藤茶極性部位供試品溶液的高效液相色譜圖見圖2（其中，供試品溶液以Ⅰ部位供試品溶液為代表進(jìn)行峰位比對(duì)，其余部位供試品樣品圖略）。

2.4 藤茶不同極性部位HPLC指紋圖譜與抗炎活性的灰色關(guān)聯(lián)度分析

2.4.1 數(shù)據(jù)集建立 以藤茶6個(gè)不同極性部位（Ⅰ～Ⅵ）樣品的HPLC指紋圖譜中5個(gè)共有峰峰面積（即按稱樣量和出膏得率折算成相等生藥量后對(duì)應(yīng)的峰面積）和上述樣品對(duì)小鼠耳腫脹的抑制率建立數(shù)據(jù)集，結(jié)果見表2。

2.4.2 數(shù)據(jù)無量綱化處理 由于表2數(shù)據(jù)中峰面積和腫脹抑制率的量綱不一致，因此采用均值化法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理：K′i（j）=Ki（j）/Ki（j），K′i（t）=Ki（t）/Ki（t）。式中，K′i（j）為原始數(shù)據(jù)均值化處理后的數(shù)據(jù)，Ki（j）為原始數(shù)據(jù)，Ki（j）為第i批樣品第j個(gè)指標(biāo)的均值化處理后的數(shù)據(jù)，t為參考序列[11，13]，結(jié)果見表3。

2.4.3 關(guān)聯(lián)系數(shù)的計(jì)算 以藤茶不同極性部位（Ⅰ～Ⅵ）對(duì)小鼠耳腫脹的抑制率為參考序列（t），以峰面積為比較序列（j），求參考序列與比較序列的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)：ξi（j）=（minΔKi（j）′+ρ×maxΔKi（j）′）/（|Ki（j）′-Ki（t）′|+ρ×maxΔKi（j）′），式中，分辨系數(shù)ρ取值為0.5[11，13]，結(jié)果見表4。

2.4.4 關(guān)聯(lián)度和關(guān)聯(lián)序的計(jì)算 分別計(jì)算各參考序列與比較序列之間的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)的均值，即關(guān)聯(lián)度，并對(duì)其進(jìn)行排序，組成關(guān)聯(lián)序，結(jié)果見表5。由表5可見，5個(gè)共有峰峰面積與小鼠耳腫脹抑制率的關(guān)聯(lián)度均大于0.6，說明藤茶抗炎作用是多組分協(xié)同作用的結(jié)果[9]。根據(jù)關(guān)聯(lián)序結(jié)果可知，抗炎效果較強(qiáng)的是3號(hào)峰和2號(hào)峰，兩者關(guān)聯(lián)度均大于0.8。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本研究考察了多種十八烷基硅烷鍵合相色譜柱，發(fā)現(xiàn)Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×250 mm，4.0 ? ? μm）的分離效果明顯優(yōu)于其他5.0 μm粒徑的色譜柱;采用乙腈-0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，獲得的色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰峰形狀佳、分離度好。

3.2 藤茶不同極性部位的譜-效關(guān)系分析

藤茶功效清熱解毒、消炎利咽，民間主要用于治療咽喉炎、皮膚病、感冒發(fā)燒等癥，因此本研究選擇抗炎活性作為藤茶藥效學(xué)指標(biāo)對(duì)其藥效進(jìn)行評(píng)價(jià);中藥指紋圖譜作為一種綜合的可量化的檢測手段，可以反映中藥中化學(xué)成分的構(gòu)成和含量，故本研究選擇HPLC指紋圖譜作為檢測藤茶中化學(xué)成分的手段?；疑P(guān)聯(lián)法是根據(jù)因素之間發(fā)展趨勢的相似或相異程度，作為衡量因素間關(guān)聯(lián)程度的一種方法，該方法對(duì)樣本數(shù)量和數(shù)據(jù)規(guī)律性的要求較低，適用于評(píng)價(jià)中藥化學(xué)成分與藥效之間的關(guān)聯(lián)程度，篩選功效成分[11，13]。本研究采用灰色關(guān)聯(lián)分析對(duì)藤茶不同極性部位的譜-效關(guān)系進(jìn)行考察，旨在篩選出藤茶中的抗炎活性物質(zhì)。結(jié)果顯示，藤茶不同極性部位的HPLC指紋圖譜中共確定了5個(gè)共有峰;二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，70%乙醇提取總部位、乙酸乙酯萃取部位、水提取部位的抗炎作用顯著;進(jìn)一步通過灰色關(guān)聯(lián)度法分析后發(fā)現(xiàn)，5個(gè)共有峰對(duì)藤茶抗炎效果的貢獻(xiàn)均較大（關(guān)聯(lián)度均大于0.6），其中抗炎效果較強(qiáng)的是3號(hào)峰（未知成分）和2號(hào)峰（二氫楊梅素）。

綜上所述，藤茶對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的抗炎作用是多組分協(xié)同作用的結(jié)果;HPLC指紋圖譜中的3號(hào)峰未知成分和二氫楊梅素是藤茶抗炎作用的主要活性成分。其中，3號(hào)峰對(duì)應(yīng)的未知成分尚需進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

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（收稿日期：2020-04-03 修回日期：2020-08-05）

（編輯：段思怡）