梁素儀，莫楚銘，李志慧，郭麗冰，陶曙紅，尹永芹

(廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006)

多枝霧水葛[Pouzolziazeylanica(L.) Benn.Var.Microphylla (Wedd.)W.T.Wang]為蕁麻科霧水葛屬植物。研究表明，多枝霧水葛提取物具有消腫排膿、促進傷口愈合、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌等作用[1-3]，通過大孔吸附樹脂純化的多枝霧水葛總黃酮具有顯著的體外抗炎作用[4]。本課題組以多枝霧水葛總黃酮提取物為藥效成分，自主研制了多枝霧水葛軟膏(專利公開號：CN107233368A)，該軟膏具有抗感染、消腫排膿、加速皮膚創(chuàng)面愈合等功效[5-7]。目前，對多枝霧水葛軟膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已有研究，確定了多枝霧水葛總黃酮中的7種黃酮苷類成分，其中芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖8-C-β-D-葡萄糖苷(簡稱：芹菜素苷)，槲皮素-3，7-2-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(簡稱：槲皮素苷)以及山奈酚-3，7-2-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(簡稱：山奈酚苷)3種成分總含量>50%[6]，由于對照品難以獲得，需要自制，限制了對本制劑質(zhì)量控制的應(yīng)用。王智民等[8]提出一測多評方法，通過中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，僅測定 1種成分 (對照品較容易得到者)，來實現(xiàn)多種成分 (對照品沒有或難以供應(yīng) ) 的同步監(jiān)控。該方法操作簡易、精確，廣泛應(yīng)用于中藥材以及中藥制劑的質(zhì)量控制[9-14]。筆者在本實驗將一測多評法用于多枝霧水葛軟膏的質(zhì)量控制，以含量最高的槲皮素苷為內(nèi)參物，建立其他兩個成分的相對校正因子，以期為多枝霧水葛軟膏質(zhì)量控制和評價提供技術(shù)檢測依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津企業(yè)管理有限公司)，SPD-20A檢測器(日本島津企業(yè)管理有限公司)，KQ-30E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Sartorius BP211D電子天平(南京創(chuàng)睿儀器儀表有限公司，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 芹菜素苷對照品(自制，含量≥98%)，槲皮素苷對照品(自制，含量≥98%)，山奈酚苷對照品(自制，含量≥98%)。TLC驗證：不同展開劑下均為單一斑點；HPLC檢測：用面積歸一化法檢測不同波長不同流動相下的對照品峰面積百分比，結(jié)果峰面積百分比≥98%。多枝霧水葛軟膏(自制，批號：2018112401，2018112402，2018112403，2018112404，2018112405，2018112406，2018112407，2018112408，2018112409)，乙腈(廣州飛恩新材料有限公司，色譜純)，甲酸(廣州飛恩新材料有限公司，色譜純)，純化水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1多枝霧水葛總黃酮提取物及軟膏的制備

2.1.1多枝霧水葛總黃酮提取物的制備[6]取多枝霧水葛藥材，[2016年1月購自廣西壯族自治區(qū)玉林市，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥標(biāo)本館劉基柱副教授鑒定為蕁麻科霧水葛屬植物多枝霧水葛Pouzolzia zeylanica (L.) Benn. Var. Microphylla (Wedd.)W.T.Wang帶根全草]粉碎，稱量藥材粗粉500 g，置圓底燒瓶，分別加入8倍量石油醚80 ℃回流提取2 次，每次1 h。濾渣揮去石油醚，加入8倍量70%乙醇回流提取3 次，每次1 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，加水使充分溶解，3000 r·min-1離心10 min(r=16 cm)，取上清液加水調(diào)整至相當(dāng)于生藥0.3 g·mL-1并調(diào)節(jié) pH 值至5。將上述樣品溶液加入AB-8大孔樹脂柱(直徑：5.0×30 cm)，上樣流速2倍柱體積(BV)·h-1，加水2 BV 除雜，加 60%乙醇2 BV以2 BV·h-1洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至流浸膏狀，冷凍干燥，粉碎，即得。

2.1.2軟膏的制備 分別稱取硬脂酸2.4 g、液體石蠟1 g、白凡士林1 g和單硬脂酸甘油酯1.1 g，85 ℃水浴加熱溶化作為油相。稱取十二烷基硫酸鈉0.14 g、三乙醇胺0.6 g、甘油1.2 g、純化水12 mL、月桂氮酮0.7 g、尼泊金乙酯0.01 g及多枝霧水葛總黃酮提取物1.00 g，85 ℃水浴加熱至無細(xì)小顆粒作為水相。將水相緩慢加入油相，磁力攪拌器200 r·min-1攪拌5 min至乳化完全，制得多枝霧水葛軟膏。

2.2色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 XBridge Shield RP18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為0.2%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫乙腈10%～60%，50 min，流速0.8 mL·min-1，檢測波長330 nm，柱溫30 ℃，進樣量5 μL。此條件下各待測成分分離度良好，色譜圖見圖1。

A.軟膏基質(zhì)陰性對照品；B.混合對照品；C.軟膏供試品(批號：2018112401)；1.芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖8-C-β-D-葡萄糖苷；2.槲皮素-3，7-2-O-α-L-吡喃鼠李糖苷；3.山奈酚-3，7-2-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。

Fig.1HPLCchromatogramofPouzolziaZeylanicaointmentandthreereferencestandards

2.3對照品溶液的制備 精密稱取芹菜素苷10.40 mg、槲皮素苷20.54 mg，山奈酚苷30.45 mg，置10 mL量瓶，70%乙醇溶解定容，制成每毫升含芹菜素苷1.04 mg、槲皮素苷2.054 mg、山奈酚苷3.045 mg的混合對照品儲備液。分別取儲備溶液0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL置5 mL量瓶，加70%乙醇溶解定容，得3個對照品混合溶液，將其編號為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ。

2.4供試品溶液的制備 精密稱取多枝霧水葛軟膏1.00 g于50 mL具塞錐形瓶，精密移取70%乙醇30 mL于錐形瓶中，稱質(zhì)量，經(jīng)45 min超聲處理(300 W，5 Hz)，放涼，緩慢滴加70%乙醇補足減失質(zhì)量，混合均勻，轉(zhuǎn)移至冰箱4 ℃靜置1 h，濾過，取濾液至50 mL量瓶，以70%乙醇定容至50 mL，得0.02 g·mL-1供試品溶液。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1線性關(guān)系考察 取“2.3”項對照品溶液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ分別進樣5 μL，平行各進樣3針，按“2.2”項HPLC色譜條件測定峰面積，計算峰面積平均值。結(jié)果以濃度(μg·μL-1)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：芹菜素苷Y=238 709X-1 268.7(R2=0.9991)，線性范圍為41.6～520.0 μg·mL-1，槲皮素苷Y=169 202X+ 1 124.9(R2=0.999 3)，線性范圍為82.2～1027.0 μg·mL-1，山奈酚苷Y=51 507X-184.36(R2=0.999 3)，線性范圍121.8～1 522.5 μg·mL-1。

2.5.2精密度實驗 取多枝霧水葛軟膏適量，按照“2.4”項方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下操作，連續(xù)進樣供試品溶液6次，測定芹菜素苷、槲皮素苷、山奈酚苷峰面積，計算RSD。結(jié)果顯示芹菜素苷、槲皮素苷及山奈酚苷的峰面積RSD分別為1.46%，1.42%，1.78%，RSD均<2%，表明實驗儀器精密度良好。

2.5.3重復(fù)性實驗 取多枝霧水葛軟膏適量，各6份，按“2.4”項方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件操作，測定供試品溶液中芹菜素苷、槲皮素苷、山奈酚苷的峰面積，計算RSD。結(jié)果顯示芹菜素苷、槲皮素苷及山奈酚苷的峰面積RSD分別為2.82%，0.99%，1.47%，RSD均<3%，表明該方法有良好的重復(fù)性。

2.5.4穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液，按“2.2”項色譜條件，分別在 0，4，8，12，20，24 h 不同時間點測定芹菜素苷、槲皮素苷、山奈酚苷的峰面積，計算RSD。結(jié)果芹菜素苷、槲皮素苷及山奈酚苷的峰面積RSD分別為3.38%，3.25%，4.19%，RSD均<5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)測定結(jié)果基本穩(wěn)定。

2.5.5加樣回收率實驗 稱取6份已知含量多枝霧水葛軟膏，精密稱重，精密加入芹菜素苷3.10 mg；取已知含量多枝霧水葛軟膏樣品6份，精密加入槲皮素苷9.00 mg；取已知含量多枝霧水葛軟膏樣品6份，精密加入山奈酚苷3.66 mg。按“2.4”項方法制備供試品溶液，依法測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。多枝霧水葛軟膏中芹菜素苷的平均加樣回收率為98.16%，RSD為0.84%(n=6)，槲皮素苷的平均加樣回收率為97.83%，RSD為1.17%(n=6)。山奈酚苷平均加樣回收率97.77%，RSD為1.24%(n=6)，表明軟膏中3種成分加樣回收實驗良好，符合定量分析要求。

2.6相對校正因子的建立

2.6.1相對校正因子的測定 精密吸取“2.3”項編號為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ 的混合對照品溶液各5 μL，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，記錄色譜峰峰面積。相對校正因子計算公式fz/x=fz/fx=(Ax×Cz)/(Cx×Az)，其中C代表濃度，A代表峰面積，z為對照品內(nèi)參物；x為對照品中待測成分，以多枝霧水葛軟膏提取物中特征成分槲皮素苷為內(nèi)參物，分別建立其與芹菜素苷和山奈酚苷之間的校正因子(relative correlatoin factor，RCF)值，結(jié)果見表2。

2.6.2不同柱溫對RCF的影響 取“2.3”項混合對照品溶液，進樣 5 μL，考察其在不同柱溫(25，30，35 ℃)下對 RCF 值的影響，按“2.2”項色譜條件，記錄多枝霧水葛軟膏3種成分在不同柱溫下的峰面積值，計算RCF值。結(jié)果顯示，不同柱溫(25，30，35 ℃)條件下測得的f槲皮素苷/芹菜素苷和f槲皮素苷/山奈酚苷的RSD分別為0.71%，1.27%，RSD 均<5%，說明柱溫在此范圍內(nèi)波動時對RCF值并無大的影響，校正因子在25～35 ℃均適用。

2.6.3不同流速對RCF值的影響 取“2.3”項混合對照品溶液，進樣5 μL，考察其在不同流速(0.7，0.8，0.9 mL·min-1)條件下對RCF值得影響，按“2.2”項色譜條件，記錄多枝霧水葛軟膏3個成分峰面積值，計算RCF值。結(jié)果顯示，不同流速(0.7，0.8，0.9 mL·min-1)條件下測得f槲皮素苷/芹菜素苷和f槲皮素苷/山奈酚苷的RSD分別為1.19%，1.08%， RSD 均<5%，說明流速在此范圍內(nèi)波動時對 RCF 值影響不大。

2.6.4不同色譜柱對RCF值的影響 取“2.3”項混合對照品溶液，進樣5 μL，考察其在不同色譜柱：XBridge Shield RP18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Waters symmetryshild RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm) ，Dikma Platisil ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)對RCF值的影響，按“2.2”項色譜條件，記錄多枝霧水葛軟膏中3種黃酮苷類成分的峰面積值，計算RCF值。結(jié)果顯示，不同色譜柱測得的f槲皮素苷/芹菜素苷和f槲皮素苷/山奈酚苷的RSD分別為4.53%，0.80%，RSD 均<5%，說明3個色譜柱測定對 RCF 值影響不大。見表3。

2.7待測組分色譜峰的定位 色譜峰定位以多枝霧水葛軟膏中3種黃酮苷類成分色譜峰相對保留時間來確定，結(jié)果顯示，兩待測成分與內(nèi)參物色譜峰相對保留時間的RSD分別為0.11%，0.10%，均<5%。

2.8相對誤差評價一測多評法與外標(biāo)法所得含量結(jié)果 分別精密稱取9批自制軟膏各1.00 g，按照“2.3”項方法制備供試品溶液，依法測定，記錄各成分色譜峰峰面積，分別采用常規(guī)外標(biāo)法和一測多評法計算各成分含量，比較兩種方法所得結(jié)果(表4)，外標(biāo)法所測槲皮素苷平均含量38.482 8 mg·g-1，芹菜素苷平均含量3.262 2 mg·g-1，山奈酚苷平均含量6.346 5 mg·g-1，一測多評法中芹菜素苷平均含量3.240 0 mg·g-1，山奈酚苷6.320 0 mg·g-1，見表4。9批軟膏含量測定結(jié)果，兩種方法RSD均<5%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 不同因素對RCF值的影響

表4 一測多評法與外標(biāo)法所得含量結(jié)果比較

3 討論

筆者在本實驗考察相對保留時間法及保留時間差法，結(jié)果顯示，待測成分與內(nèi)參物色譜峰相對保留時間與保留時間的差值的RSD分別均<5%。但保留時間差值的RSD較相對保留時間的RSD大，故采用相對保留時間法來定位色譜峰。對軟膏的供試液處理，前期用簡單的過濾方法，放置一段時間后濾液中有細(xì)小顆粒，濾過不完全，放入冰箱冷處理后，情況好轉(zhuǎn)。

筆者在本實驗選用槲皮素苷為內(nèi)參物，因為其在多枝霧水葛藥材及軟膏中含量均最高，自制對照品相對容易些。研究結(jié)果表明，3種主要有效成分色譜分離效果良好，所建立的一測多評法，方法耐用性良好，與外標(biāo)法結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可用于多枝霧水葛軟膏的含量測定，為多枝霧水葛軟膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善及質(zhì)量評價提供了依據(jù)。

多枝霧水葛總黃酮有效部位中，其他4種黃酮苷類成分含量低，未能大量分離出來作為對照品，故暫未建立其與槲皮素苷之間的相對校正因子，此方面研究有待課題組后續(xù)進一步完善。