陳天昱 張 雷 厲詩嫻 周坤鵬 林 悅 李 婧

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性，它能夠清除人體內(nèi)自由基、促進抗氧化因子再生、抑制自由基酶的產(chǎn)生、與金屬離子螯合提高抗氧化酶的水平，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑[1]。山奈酚是黃酮類化合物中比較有代表性的一種，具有抗氧化、抗炎、抗癌、止咳等作用[2]。它主要來源于山奈(一種姜科植物)的根莖中，廣泛存在于各種蔬菜、水果中。根據(jù)中藥配位化學(xué)理論，天然藥物的藥理學(xué)活性大都源于其內(nèi)含有機物與礦物質(zhì)之間形成配合物產(chǎn)生的協(xié)同作用[3]。山奈酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有超離域度和大π鍵共軛體系，分子中的羰基氧和羥基具有很高的活性可與多種金屬離子發(fā)生配位反應(yīng)[4]。通過制備黃酮類化合物的金屬離子配合物，觀察其理化性質(zhì)及生物活性的改變，以找尋提高其在生物體內(nèi)作用效果的方法是近些年研究的熱點[5]。本文將銅與山奈酚進行配位，制得山奈酚-銅配合物，并研究其在體外清除自由基的能力，為山奈酚金屬配合物的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

山奈酚(上海麥克林公司)，新戊酸銅(天津致遠)，溴化鉀(天津光復(fù))，1，1-二甲基-2-三硝基苯肼(DPPH·上海阿拉丁試劑)，Tris-base(Santa Cruz)，鄰苯三酚(上海阿拉丁試劑)，30%H2O2(南京試劑公司)，試劑、藥品均為分析純。

1.2 儀器

JENWAY 6715型超微量紫外分光光度計；Thermo Fisher Scientific Nicolet 380型紅外光譜儀(KBr壓片法)，Vario Micro cube元素分析儀。

1.3 方法

1.3.1 配合物的合成

山奈酚2 mmol充分溶解于15 mL無水乙醇，新戊酸銅1 mmol(或0.5 mmol)充分溶解于15 mL無水乙醇；將二者混合，置于85 ℃水浴中冷凝回流60 min，冷卻后10 000 r/min離心5 min，去上清，留固態(tài)沉淀自然揮干，用無水乙醇淋洗三次后干燥，得到黑色產(chǎn)物，為配合物1(或配合物2)。

1.3.2 待測樣品溶液的配置

精密稱量0.001 4 g山奈酚粉末，用無水乙醇溶解定容于10 mL容量瓶，制成濃度為500 nmol/mL山奈酚乙醇待測溶液，呈淡黃色；精密稱量0.003 2 g銅配合物，以DMSO溶解，定容10 mL制成濃度500 nmol/mL待測溶液，呈橙黃色。將上述兩種待測溶液按梯度稀釋為250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、2和1 nmol/mL共10個濃度。

1.3.3 清除DPPH自由基能力測定

精密稱量0.002 g DPPH固體，用無水乙醇溶解并定容于10 mL棕色容量瓶，制得500 nmol/mL DPPH溶液；取1.5 mL EP管加入0.5 mL DPPH溶液和0.5 mL樣品溶液，震蕩均勻后于室溫條件下用錫箔紙遮蓋避光反應(yīng)35 min，以無水乙醇為背景，在517 nm處測其紫外吸光度A1；將樣品溶液替換為樣液所用溶劑，重復(fù)上述過程，記錄紫外吸光度A0；將DPPH替換為無水乙醇，仍加入0.5 mL樣品溶液，重復(fù)上述過程，并記錄紫外吸光度A2。

DPPH清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%。

精密稱量0.605 7 g Tris-base固體，用雙蒸水溶解定容于50 mL容量瓶，制成0.1 mmol/mL Tris溶液；量取濃鹽酸4.3 mL，用雙蒸水定容50 mL，制成1 mmol/mL的HCl溶液；精密稱量0.006 3 g鄰苯三酚固體，用0.01 mmol/mL HCl溶液溶解，并定容至100 mL，制成500 nmol/mL鄰苯三酚溶液。

取1.5 mL EP管加入0.5 mL鄰苯三酚溶液和0.2 mL Tris溶液，混勻后反應(yīng)1.5 min，加入0.5 mL樣品溶液，震蕩均勻，反應(yīng)5 min，最后加入0.125 mL HCl溶液(1 mmol/mL)終止反應(yīng)，303 nm測紫外吸光度A1；將樣品溶液替換為溶劑，重復(fù)上述過程，303 nm 處測紫外吸光度A0；測定各濃度山柰酚及其銅配合物試樣溶液在303 nm處的吸光度A2。

2 結(jié)果與分析

2.1 山奈酚配合物的制備

黃酮類化合物的3′-OH，4′-OH，3-OH，4-C=O等均會參與金屬配位，可形成多種配位化合物[6]。反應(yīng)物中新戊酸銅的新戊酸根也具有配位能力。不同反應(yīng)物用量可能形成多種配位化合物[7]。本實驗采用兩種配比反應(yīng)，探索山奈酚的配位情況。在合成過程中兩個配比反應(yīng)情況相同，產(chǎn)物通過表征驗證結(jié)構(gòu)組成。

2.2 山奈酚及配合物紅外光譜

山奈酚及配合物的紅外光譜主要代表性基團分布見表1。紅外圖譜及特征峰比較結(jié)果顯示，山奈酚的羰基振動頻率υ(C=O)位置為1 655 cm-1，形成配合物后位于1 635 cm-1，向低波數(shù)方向位移了20 cm-1，可見山奈酚的4-C=O參與了配位，使羰基成鍵電子更加偏向氧原子。配合物在618 cm-1出現(xiàn)了υ(Cu-O)振動，說明有銅的配位鍵生成。配合物1和配合物2苯環(huán)π鍵共軛體系υ(C=C)為1 603 cm-1和1 602 cm-1，相對于山奈酚的1 625 cm-1，向低波數(shù)方向位移了22 cm-1和23 cm-1這是由于配合物中形成了一個穩(wěn)定的新環(huán)而使共軛效應(yīng)增強所致。在1 200～1 300 cm-1，υ(C-O)振動峰的強度明顯減弱，并伴有藍移，證明配體中有部分羥基參與了配位。山奈酚的酚羥基的υ(O-H)和芳醚鍵的υ(C-O-C)在形成配合物后變化不大。

表1 山奈酚及其銅配合物的主要吸收峰歸屬(cm-1)

2.3 山奈酚及配合物的紫外光譜

山奈酚是典型的黃酮類化合物，在200～400 nm存在兩個主要的紫外特征吸收帶[8]。如圖1所示，山奈酚和配合物的紫外吸收譜圖均有2個強吸收帶，其中山奈酚的長波區(qū)帶Ⅱ在365 nm處，屬于π→π*電子躍遷；短波區(qū)帶Ⅰ位于267 nm處，屬于n→π*電子躍遷。而配合物1和的配合物2的主要吸收帶分別是帶Ⅰ281 nm，帶Ⅱ420 nm，且兩個配合物的吸收帶位置相同。對比配體和配合物的兩處紫外吸收帶，兩種配合物的吸收帶均發(fā)生了紅移，且吸收強度下降。這很可能是由于 Cu2+與配體中3-OH和4-C=O形成新環(huán)，使得整個分子的共軛體系增長，電子的離域程度增大，導(dǎo)致電子躍遷時所需的能量降低，故紫外吸收峰紅移[9]。

圖1 山奈酚、山奈酚銅配合物1、2的紫外光譜

綜合紅外與紫外結(jié)果，配合物1與配合物2的譜圖及各主要基團的峰值極為接近?？紤]到測量中一些不可避免的誤差，二者差別可以忽略。因此推斷配合物1和2在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相同，且酸根未參與配合物的形成。

對配合物進行元素分析，實際值C：55. 61%，H：2.97%；理論值C：55.13%，H：3.21%。綜合多項實驗結(jié)果，推斷該配合物的結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 山奈酚銅配合物的分子結(jié)構(gòu)圖

2.4 抗氧化活性測定

2.4.1 山奈酚及山奈酚-銅配合物對DPPH自由基的清除作用

由圖3可以看出，山奈酚及其銅配合物清除DPPH自由基的能力都隨著濃度的增加而增加。在試樣濃度達到125 nmol/mL后基本達到完全清除的效果。在試樣濃度小于2 nmol/mL時山奈酚清除DPPH自由基的效果略優(yōu)于配合物。在濃度大于3.9 nmol/mL小于125 nmol/mL時，配合物的效果要略優(yōu)于山奈酚。濃度大于125 nmol/mL后，兩者基本都能達到完全清除的效果。整體上看，山奈酚-銅配合物清除DPPH自由基的效果要略優(yōu)于山奈酚本身。

圖4 山奈酚及其銅配合物對自由基的清除效果

3 結(jié)論