熊遠(yuǎn)果，沈瑤，張洪

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060 )

泊那替尼(ponatinib)是第3代酪氨酸酶抑制藥(tyrosine protein kinase inhibitors，TKI)，可用于對(duì)第1代(伊馬替尼)和第2代(達(dá)沙替尼)TKI耐藥的慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)的治療[1-2]。目前，泊那替尼主要用于治療兩種耐藥型白血病，即CML和費(fèi)城染色體陽(yáng)性急性淋巴細(xì)胞白血病[Philadelphia chromosome-positive(Ph+) acute lymphoblastic leukemia，Ph+ALL]成年患者，并可用于對(duì)加速期耐藥性白血病的治療[3-4]。泊那替尼對(duì)突變的費(fèi)城染色體上BCR-ABL融合基因有明顯抑制作用，并可直接抑制T315I突變，延長(zhǎng)耐藥患者生存周期，提高患者生活質(zhì)量[5-6]。X-射線晶體分析表明，泊那替尼以范德華力與T315I突變殘留結(jié)合，抑制突變蛋白表達(dá)[7-8]。但泊那替尼水溶性較差，上市片劑主要吸收部位為胃部，生物利用度低，不良反應(yīng)發(fā)生率高，制約了該藥在臨床上的使用[9]。

固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是近年發(fā)展的一種新型毫微粒類給藥系統(tǒng)，以固態(tài)的天然或合成的類脂材料將藥物包裹于類脂核中制成粒徑50～1000 nm的固態(tài)膠粒給藥體系[10]。SLN作為用于控制藥物釋放的新型納米膠團(tuán)載體的給藥系統(tǒng)，既具備聚合物納米粒穩(wěn)定性良好、藥物緩控釋的優(yōu)勢(shì)，又兼具脂質(zhì)體、乳劑低毒性、生理相容性好、良好靶向性以及可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，并且藥物包封于固體脂質(zhì)中，可避免化學(xué)或酶降解，增加藥物穩(wěn)定性[11-13]。SLN可用于口服給藥、經(jīng)皮給藥以及靜脈給藥等多種給藥途徑，應(yīng)用前景廣泛[14-15]。

為促進(jìn)泊那替尼在臨床的使用，使其更安全、有效地作用于臨床，筆者采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備口服給藥的泊那替尼固體脂質(zhì)納米粒(P-SLN)混懸液。以平均粒徑(size)、多聚分散指數(shù)(polymer dispersity index，PDI)以及包封率(entrapment efficiency，EE)對(duì)其制備工藝和處方進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其質(zhì)量結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行初步探討，以期為開(kāi)發(fā)泊那替尼新劑型提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司)；UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；TG328A型電子分析天平(上海天平儀器廠，感量：0.000 1 g)；JEM-2100 (HR)高分辨透射電鏡(日本Jeol公司)；Zetasizer ZS90型激光粒度儀(英國(guó)Malvern公司)。

1.2試藥 泊那替尼(武漢星耀艾克生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，含量：99.0%，批號(hào)：06771)；泊那替尼對(duì)照品(上海翰香生化制品有限公司，含量：99.3%，批號(hào)：20121226)；泊洛沙姆188(武漢國(guó)奧聯(lián)信生物科技有限公司，批號(hào)：C5H1002)；蛋黃卵磷脂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：69014933)；單硬脂酸甘油酯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：30093226)；甲醇[美國(guó)天地公司，高效液相色譜(HPLC)純]；乙腈(美國(guó)天地公司，HPLC純)；水為超純水(本實(shí)驗(yàn)室自制)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1P-SLN的制備 精密稱取處方量泊那替尼10 mg、單硬脂酸甘油酯100 mg、蛋黃卵磷脂75 mg，溶于適量無(wú)水乙醇，(75±2) ℃水浴形成有機(jī)相。另取100 mg泊洛沙姆188溶于相同溫度水，構(gòu)成水相。將有機(jī)相緩慢加入水相，高速乳化10 min(10 000 r·min-1)。乳化后，等溫下繼續(xù)攪拌15 min(1000 r·min-1)，除去有機(jī)溶劑。將所得半透明體系快速分散于0～2 ℃水相，高速均質(zhì)10 min(10 000 r·min-1)，即得P-SLN混懸液。同時(shí)，在空白SLN制備的方法中，除有機(jī)相中不加入泊那替尼外，其余與制備P-SLN方法相同。

2.2含量測(cè)定

2.2.1檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 精密稱取泊那替尼對(duì)照品10 mg，置100 mL量瓶，并用無(wú)水乙醇定容，搖勻，即得100 μg·mL-1泊那替尼濃貯備液。以濃貯備液配制15 μg·mL-1泊那替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液，以空白乙醇溶液作參比，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，于190～800 nm全波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示泊那替尼有多個(gè)吸收峰，考慮到輔料在低波長(zhǎng)范圍內(nèi)有干擾作用，選擇280 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2色譜條件 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)[16-17]，確定色譜柱：Inertsil ODS-3柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.2%三乙胺乙酸緩沖鹽(85：15，pH值=7)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.3專屬性考察 按處方比例制備空白SLN，加入無(wú)水乙醇溶解，過(guò)孔徑0.45 μm膜進(jìn)樣測(cè)定。同時(shí)按照處方比例制備含藥SLN，同法進(jìn)行測(cè)定，其HPLC圖見(jiàn)圖1(測(cè)定濃度10 μg·mL-1)。由圖1可知SLN中輔料對(duì)樣品含量測(cè)定干擾較小，說(shuō)明該方法專屬性好。

A.泊那替尼對(duì)照品；B.空白固體脂質(zhì)納米粒；C.P-SLN樣品。

Fig.1HPLCchromatogramofP-SLN

2.2.4線性范圍考察 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精密稱量泊那替尼對(duì)照品10 mg，置100 mL量瓶，加無(wú)水乙醇溶解，搖勻，定容至刻度，即得泊那替尼對(duì)照品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密量取上述泊那替尼對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液4.0，3.5，3.0，2.5，2.0，1.5，1.0，0.5，0.1 mL于10 mL量瓶，加無(wú)水乙醇至刻度。配成濃度分別為40，35，30，25，20，15，10，5，1 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.2”項(xiàng)方法進(jìn)樣，依次進(jìn)樣量20 μL。每個(gè)樣品溶液進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。以5次測(cè)定的泊那替尼峰面積平均值(A)對(duì)進(jìn)樣濃度(μg·mL-1)做線性回歸，結(jié)果為：A=33.17C+9.286 7 (r=0.999 7) (1～40 μg·mL-1)(n=5)。結(jié)果表明，泊那替尼在1～40 μg·mL-1范圍內(nèi)樣品濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度和回收率實(shí)驗(yàn) 精密度測(cè)定：取“2.2.4”項(xiàng)泊那替尼對(duì)照品溶液，分別精密配制高、中、低(30，20，10 μg·mL-1)濃度溶液，1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，不同天內(nèi)，每天進(jìn)樣1次，連續(xù)5 d，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果日內(nèi)精密度RSD分別為0.14%，0.28%，0.16%，日間精密度RSD為0.67%，0.49%，1.49%。

回收率測(cè)定：取“2.2.4”項(xiàng)泊那替尼對(duì)照品溶液，分別精密配制高、中、低(30，20，10 μg·mL-1)濃度溶液。精密量取空白SLN混懸液1.0 mL，共3份，分別準(zhǔn)確加入上述對(duì)照品溶液1.0 mL，過(guò)濾，按“2.2.2”項(xiàng)進(jìn)樣。結(jié)果回收率分別為(99.25±0.05)%、(101.59±0.10)%、(100.28±0.08)%。

2.3包封率的測(cè)定 精密移取P-SLN混懸液1.0 mL，于4 ℃下高速離心30 min(12 000 r·min-1)，去除上清液，沉淀用 0.1 mol·L-1鹽酸溶液清洗3次，除去未包封的藥物，加入乙腈1.0 mL和蒸餾水1.0 mL破乳，得到樣品A；另精密量取P-SLN混懸液1.0 mL，直接加乙腈破乳1 mL，加蒸餾水至與A液等體積，得樣品B。HPLC法測(cè)定A、B兩樣品中泊那替尼含量，按以下公式計(jì)算包封率，包封率(EE，%)=(樣品A中藥物含量/樣品B中藥物含量)×100%。

2.4單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，制備工藝條件是影響固體脂質(zhì)納米粒粒徑和PDI的主要因素。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)制備工藝條件作了進(jìn)一步的考察和優(yōu)化：固化方法(自然固化、冰水浴固化、機(jī)械攪拌固化、高速均質(zhì)固化)、納米乳與冰水浴(0～2 ℃)體積比(1：1～1：20)、乳化及固化均質(zhì)時(shí)間(5～15 min、2～20 min)、乳化溫度(65～85 ℃)。結(jié)果見(jiàn)表1～4。根據(jù)粒徑和PDI確定最優(yōu)制備工藝為：冰水浴高速均質(zhì)固化，納米乳與冰水浴體積比為1：5，乳化及固化均質(zhì)時(shí)間均為10 min，乳化溫度為75 ℃。在此制備工藝下，所制納米粒粒徑較小，粒徑分布比較均勻。

表1 不同固化方式對(duì)P-SLN粒徑和PDI的影響

2.5正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)可知，各種乳化劑比例、載體材料用量和投藥量對(duì)P-SLN的各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)有較大影響。因此在預(yù)實(shí)驗(yàn)和單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇泊那替尼(A)、單硬脂酸甘油酯(B)、蛋黃卵磷脂(C)和泊洛沙姆188(D)用量4個(gè)因素，各因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，按正交設(shè)計(jì)的原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察因素水平見(jiàn)表5，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。

表2 納米乳與冰水浴體積比對(duì)P-SLN粒徑和PDI的影響

表3 溫度對(duì)P-SLN粒徑和PDI的影響

表4 高速均質(zhì)時(shí)間對(duì)P-SLN粒徑和PDI的影響

表5 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表6 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

表7 方差分析結(jié)果

為全面綜合評(píng)價(jià)P-SLN制備工藝，本實(shí)驗(yàn)采用DF來(lái)進(jìn)行綜合評(píng)分[18-19]。其中，評(píng)價(jià)指標(biāo)(di)包括P-SLN粒徑(d1)、PDI(d2)和包封率(d3)，di和DF分別按以下公式計(jì)算。

粒徑(d1)及PDI(d2)計(jì)算公式：di=(Ymax-Yi) / (Ymax-Ymin) ；包封率(d3)計(jì)算公式：di=(Yi-Ymin) / (Ymax-Ymin) ；綜合評(píng)分 DF計(jì)算公式：DF=0.25×d1+0.25×d2+0.50×d3。其中，0.25，0.25及0.50分別為粒徑、PDI和包封率的權(quán)值；Yi為各項(xiàng)測(cè)得值，Ymax、Ymin為各項(xiàng)測(cè)得值中最大值及最小值。

由表6，7可知，4個(gè)因素R值大小排列為A>B>C>D，表明泊那替尼用量、單硬脂酸甘油酯用量、蛋黃卵磷脂用量和泊洛沙姆188用量對(duì)P-SLN制備的影響程度逐漸減弱。各因素水平分析結(jié)果分別為A2>A1>A3、B1>B2>B3、C3>C2>C1、D3>D1>D2。其中，泊那替尼用量(A因素)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余因素差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。選取各因素的最高水平，并綜合直觀分析結(jié)果，初步確定最佳處方組合為A2B1C3D3，即泊那替尼用量10 mg，單硬脂酸甘油酯用量50 mg，蛋黃卵磷脂用量100 mg，泊洛沙姆188用量150 mg。

2.6形貌觀察 按照優(yōu)化后的處方、工藝制備P-SLN，用鑷子夾著銅網(wǎng)沾取少量P-SLN混懸液，用2%磷鎢酸染色2～3 min，并用濾紙吸取多余的溶液，自然晾干，置于透射電子顯微鏡下觀察，并攝影(圖2)。從圖中可看出所制納米粒為類球形粒子，大小分布比較均勻。

圖2 P-SLN透射電鏡照片(×25 000)

2.7粒徑分布及Zeta電位測(cè)定 將所制P-SLN混懸液以純化水稀釋10倍，Zetasizer ZS90型激光粒度儀測(cè)定納米粒子的粒徑、粒徑分布(圖3)及Zeta電位(圖4)。從圖可看出納米粒子粒徑分布比較均勻，平均粒徑為155.1 nm，PDI為0.152，Zeta電位為-22.0 mV。

圖3 P-SLN粒徑分布圖

2.8驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 按照優(yōu)化后的處方工藝制備3批P-SLN，測(cè)定其粒徑、電位及包封率，結(jié)果見(jiàn)表8。從表8可看出，采用乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備P-SLN，重復(fù)性良好。

2.9體外釋藥實(shí)驗(yàn) 精密移取按優(yōu)化后的處方制備3批P-SLN混懸液1 mL，加入到最大通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量(DA)為8000～10 000透析袋，除去透析袋中氣泡，兩端用線系好，置于100 mL含有1%聚山梨酯-80的磷酸鹽緩沖液(pH值=7.4)，置于恒溫?fù)u床，保持釋藥溫度為(37±1)℃，轉(zhuǎn)速100 r·min-1，分別于0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0 h等不同時(shí)間間隔取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)充同溫同體積釋藥介質(zhì)1 mL。過(guò)膜，按含量測(cè)定方法測(cè)定含量，計(jì)算累積釋放率，繪制累積釋藥曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。另按處方量，制備泊那替尼與空白固體脂質(zhì)納米粒物理混合混懸液(P solution)，按上述方法測(cè)定其體外釋藥累積曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

以釋藥方程擬合P-SLN混懸劑的累積釋藥曲線。由累積釋藥結(jié)果所得，擬合方程最佳的為：Weibull方程：lnln[1/(1-R)]=0.644 3lnt-1.044 3，r=0.986 9。

圖4 P-SLN Zeta電位分布圖

表8 P-SLN平均粒徑、PDI、Zeta電位和包封率

圖5 P-SLN的體外累積釋放曲線(n=3)

2.10P-SLN凍干粉的制備 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇海藻糖和甘露醇作為P-SLN的凍干保護(hù)劑。取一系列不同濃度以及不同組分的凍干保護(hù)劑處方溶液，與P-SLN混懸液按1：1體積比例，各取2 mL，置于西林瓶中。在-74 ℃超低溫冰箱中預(yù)凍24 h，取出在真空冷凍干燥機(jī)干燥24 h，即得P-SLN凍干粉。實(shí)驗(yàn)處方及結(jié)果見(jiàn)表9。綜合考慮，P-SLN凍干粉外觀、復(fù)溶時(shí)間、復(fù)溶后形態(tài)以及粒徑變化，以5%甘露醇凍干保護(hù)劑的P-SLN凍干粉表現(xiàn)最為理想，凍干前后變化最小，確定以此處方制備P-SLN凍干粉。

2.11差動(dòng)熱分析儀(differential scanning calorimetry，DSC)物相分析 采用CDR-4P DSC進(jìn)行P-SLN凍干粉樣品物相分析。分別取適量泊那替尼原料藥、輔料、處方量混合的物理混合物和P-SLN凍干粉，以空坩堝(Al2O3)為參比，10 ℃·min-1速度進(jìn)行DSC掃描，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

3 討論

制備P-SLN的方法主要有薄膜分散法、高溫乳化-低溫固化法、高壓均質(zhì)法、微乳法等[18-22]。其中，高壓均質(zhì)法因其良好的可靠性和可重復(fù)性被廣泛應(yīng)用[23]。但高壓均質(zhì)對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)提出了較高的設(shè)備要求，使用成本和能耗較大。在高溫乳化-低溫固化法中引入高剪切均質(zhì)，可以明顯縮短其制備過(guò)程，優(yōu)化參數(shù)指標(biāo)。其中，固化方法對(duì)制劑有明顯影響，冰水浴結(jié)合高剪切固化法，可使粒徑以及PDI明顯減小。在高速均質(zhì)中，乳化均質(zhì)時(shí)間對(duì)制劑參數(shù)有較大影響，時(shí)間過(guò)短，乳化不充分，所制備的粒徑和PDI較大，均質(zhì)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能破壞已經(jīng)形成的穩(wěn)定系統(tǒng)，造成粒徑和PDI大幅改變。本研究表明，高速均質(zhì)優(yōu)化的高溫乳化-低溫固化法，簡(jiǎn)易可行，工藝可控，具有較好的可靠性和可重復(fù)性。

在脂質(zhì)材料選擇上，山崳酸甘油脂、硬脂酸以及單硬脂酸甘油酯等脂質(zhì)材料用于制備泊那替尼固體脂質(zhì)納米粒。山崳酸甘油脂、硬脂酸制備的納米粒在1周內(nèi)發(fā)生沉降，納米粒穩(wěn)定性較差，單硬脂酸甘油酯制備的納米粒表現(xiàn)良好，故最終確定脂質(zhì)材料為單硬脂酸甘油酯。由于脂質(zhì)材料在常溫下為固態(tài)，制備溫度應(yīng)控制在高于脂質(zhì)熔點(diǎn)5～10 ℃或10 ℃以上，使藥物和脂質(zhì)混合熔融。并且，乳化溫度會(huì)影響乳化劑的乳化能力，溫度過(guò)高會(huì)破壞乳化效果。單硬脂酸甘油酯的熔點(diǎn)在約55 ℃，在制備過(guò)程中溫度應(yīng)高于此值。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，確定納米粒制備的最佳乳化溫度為(75±2)℃。

體外釋藥中，泊那替尼固體脂質(zhì)納米粒在最初的30 min內(nèi)約10%主藥突釋，其中的原因?yàn)槲皆诹Ｗ颖砻娴乃幬锸紫鹊玫结尫牛S后是脂質(zhì)核中的藥物釋放[24]。在研究中P-SLN釋藥前期，表面的藥物擴(kuò)散與P-solution的釋放趨勢(shì)相似。隨著時(shí)間的推移，脂質(zhì)納米粒逐漸溶解，包封于納米粒核心中藥物被緩慢的釋放，在24 h內(nèi)累計(jì)釋藥70%[25-26]。同時(shí)，超過(guò)90%的主要從P-solution在僅12 h內(nèi)釋放出來(lái)，表明P-SLN除初期有較輕的突釋效果外，體外緩釋效果明顯。

冷凍干燥可以用于提高SLN的穩(wěn)定性，將液體SLN混懸液固化，可以降低納米粒出現(xiàn)奧斯特瓦爾德熟化和水解反應(yīng)，避免納米粒在儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生粒子凝結(jié)和聚結(jié)，從而提高SLN穩(wěn)定性。同時(shí)，將SLN轉(zhuǎn)化成固體形式，可以將其作為藥物中間體，進(jìn)一步制備成片劑、丸劑或直接填充制備成為膠囊。此外，固化后，不需要特殊的儲(chǔ)存條件和運(yùn)輸設(shè)備，極大地方便了藥物的存儲(chǔ)和運(yùn)輸。筆者使用5%甘露醇作為冷凍保護(hù)劑，制備的P-SLN凍干粉平均粒徑前后變化最小，溶解時(shí)間最短，復(fù)溶后溶液更穩(wěn)定。

表9 P-SLN凍干粉制備處方及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A.單硬脂酸甘油酯；B.卵磷脂；C.泊洛沙姆188；D.泊那替尼；E.P-SLN輔料物理混合物；F.P-SLN。

Fig.6DSCscanningimage

P-SLN的DSC物相分析結(jié)果顯示，泊那替尼原料藥在114.217 ℃有一個(gè)吸收峰，在136.808和141.155 ℃處有兩個(gè)放熱峰。輔料的DSC圖譜顯示，泊洛沙姆188唯一吸收峰在于57.936 ℃，單硬脂酸甘油酯的僅有吸收峰在62.986 ℃處，蛋黃卵磷脂未出現(xiàn)明顯的吸收峰，可能與其為多種組分構(gòu)成的混合物有關(guān)。P-SLN和P-SLN物理混合物的吸收峰位移，根據(jù)Gibbs-Thompson效應(yīng)分析[27]，兩者的物相發(fā)生了轉(zhuǎn)變，P-SLN不為輔料的物理混合物，而是一種全新的新物相，證明泊那替尼已經(jīng)被成功包封于P-SLN的脂質(zhì)核中，形成了新的物相組成形式[28]。

筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用高速均質(zhì)優(yōu)化的高溫乳化-低溫固化法制備P-SLN新型制劑，方法簡(jiǎn)單可靠，質(zhì)量可控，重復(fù)性好。同時(shí)，在與原料藥的體外釋藥實(shí)驗(yàn)中，所制備P-SLN緩釋效果顯著，可以明顯延長(zhǎng)藥物的釋藥時(shí)間，增加藥物的生物利用度，為P-SLN的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。