謝逸菲，張麗，張寶喜，杜冠華，呂揚

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院&中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所1.藥物晶型研究中心、晶型藥物研究北京市重點實驗室；2.藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050)

醋酸甲羥孕酮屬于人工合成孕激素類藥物，大劑量時能夠通過抑制卵泡發(fā)育和阻止排卵方式減輕子宮內(nèi)膜異位癥所致疼痛，小劑量時能夠治療非典型子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌及腎癌等疾病[1-3]。此外，該藥能夠通過抑制體內(nèi)性激素水平和減少性腺激素釋放方式達到女性避孕目的，并可用于制作長效避孕針[4]。在醫(yī)藥領(lǐng)域，標準物質(zhì)是指用于藥物含量測定、鑒別以及進行純度試驗的具特性值的物質(zhì)，在研制過程中通常采用多種方法進行聯(lián)合定值，方法間能夠相互補充，使數(shù)據(jù)更加科學(xué)準確，并通過不間斷的溯源鏈與國際單位進行統(tǒng)一，以確保全球量值的準確和一致[5-9]。

目前，我國避孕節(jié)育類藥物化學(xué)計量標準物質(zhì)尚存在短缺現(xiàn)象，通過查詢國家標準物質(zhì)信息服務(wù)平臺數(shù)據(jù)庫，筆者未發(fā)現(xiàn)醋酸甲羥孕酮純度標準物質(zhì)的相關(guān)信息。本研究采用質(zhì)量平衡法(mass balance，MB)與差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)兩種不同原理的方法研制醋酸甲羥孕酮化學(xué)計量標準物質(zhì)，可為藥物質(zhì)控及評價提供可溯源性標準，也是將藥物推向國際市場的有力支撐，并且對于我國避孕節(jié)育類藥物及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制具有重要的科學(xué)意義[10-12]。

1 儀器與試藥

1.1儀器及條件 Mettler Toledo DSC 1型差示掃描量熱儀(Mettler Toledo公司，瑞士)，標準40 μL鋁(Al)坩堝，以0.5 ℃·min-1速度升溫，升溫區(qū)間為203～210 ℃，氮氣(N2)流速50 mL·min-1；Agilent1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，DAD檢測器，Agilent chemstation工作站，Agilent Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流速為1.0 mL·min-1，在波長254 nm條件下，流動相選擇水：甲醇=25：75，進樣量為5 μL，柱溫為30 ℃；Mettler MX5型分析用天平(瑞士Mettler Toledo公司)，感量為1 μg(0≤m≤5100 mg)；AV500-III磁共振波譜儀(Bruker公司，德國)；Mettler Toledo V20型卡爾·費休滴定儀(瑞士Mettler Toledo公司)；SX2.5-10型箱式電阻爐(上海樹立儀器儀表有限公司)。

1.2藥品與試劑 醋酸甲羥孕酮原料藥(武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司，批號： 20170129，含量：98%)；國家二級錫標準物質(zhì)：熔點(231.81±0.06) ℃[國家標準物質(zhì)研究中心，GBW(E)130183]；甲醇(Fisher Chemical公司，美國，色譜純)；實驗用水經(jīng)Millipore純水儀純化制備。

1.3純度標準物質(zhì)樣品的制備 醋酸甲羥孕酮標準物質(zhì)候選物由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制。醋酸甲羥孕酮樣品經(jīng)純化、過篩孔內(nèi)徑(150±6.6) μm(100目)篩，采用2 mL棕色安瓿瓶熔封，每瓶50 mg進行標準物質(zhì)候選物樣品分裝，共分裝樣品600 瓶。

1.4標準物質(zhì)結(jié)構(gòu)確證 采用質(zhì)譜、磁共振波譜、紅外光譜、熔點分析對樣品進行結(jié)構(gòu)確證。①質(zhì)譜結(jié)果： ESI-MS [M+Na]+m/z 409.2， [M+H]+m/z 387.2；②核磁結(jié)果：1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz) δppm：5.6(1H，s，4-H)，2.75(1H， m，6-H)，2.05(3H，s，21-COCH3)，1.95(3H，s，23-OCOCH3)，1.18(3H，s，19-CH3)， 1.01(3H，d，J=6.5Hz，24-CH3)，0.95(m，1H，9-H)，0.66(3H，s，18-CH3)；13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz) δppm：203.4(C-20)，198.10(C-3)，173.61(C-5)， 170.57(C-22)，120.41(C-4)，95.80(C-17)，52.85(C-9)，50.48(C-14)，46.25(C-13)， 39.16(C-7)，38.47(C-10)，35.26(C-1)，34.64(C-8)，33.38(C-2)，32.96(C-6)， 30.43(C-12)，29.67(C-21)，25.97(C-16)，23.31(C-15)，20.89(C-23)，20.30(C-11)， 18.12(C-24)，17.80(C-19)，13.90(C-18)；③紅外結(jié)果：IR 2947，2911，2869 cm-1處為亞甲基的碳氫伸縮振動峰，1730，1673 cm-1處為內(nèi)酰胺及酯基的羰基伸縮振動峰，1363 cm-1為甲基酮對稱伸縮振動峰；④熔點結(jié)果：DSC吸熱峰值為207.42 ℃。以上數(shù)據(jù)與《化學(xué)藥品對照品圖譜集》及《中華人民共和國藥典》2015年版(二部)中醋酸甲羥孕酮參考值基本一致[13-14]，綜合確定該化合物為醋酸甲羥孕酮，分子式為C24H34O4，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 醋酸甲羥孕酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2 方法學(xué)考察

本研究聯(lián)合DSC法與MB法兩種不同原理的方法研制醋酸甲羥孕酮標準物質(zhì)，并進行定值研究。首先通過方法學(xué)考察，尋找最優(yōu)定值條件，通過準確度評估，以減少定值過程中不同方法引入的不確定度。

2.1DSC法 依據(jù)范霍夫方程(Van’t Hoff Equation)進行DSC法純度測定，通過熱焓與溫度變化過程中的焓變，建立數(shù)學(xué)模型，計算雜質(zhì)含量并獲得樣品純度。

式中：x為純物質(zhì)的摩爾百分比，T0為純物質(zhì)熔點值，Tm為物質(zhì)真實熔點值，R表示氣體常數(shù)。在恒定的升溫速率下，通過測定物質(zhì)的熔融DSC曲線，獲得物質(zhì)的摩爾熔融焓變，通過擬合計算，最終可以獲得被測物的純度值。

2.1.1升溫速率考察 考慮到DSC分析過程中升溫速率對化學(xué)純度測定結(jié)果準確性的影響，考察升溫速率為0.3，0.5，0.7 ℃·min-1時的3種不同升溫速率對化學(xué)純度分析結(jié)果的影響，經(jīng)分析，純度結(jié)果分別為：99.51%，99.50%，99.51%，分析結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性。故選用0.5 ℃·min-1作為DSC定值分析的升溫速率。

2.1.2稱樣量考察 精密稱取7份質(zhì)量為1.25，1.65，2.14，2.54，2.88，3.36，3.98 mg的純度標準物質(zhì)候選物樣品，吸熱峰面積結(jié)果依次為108.24，139.57，182.43，218.96，249.85，292.64，353.58 mJ。獲得線性回歸方程：Y=89.970 5X-8.029 2(X為純度標準物質(zhì)樣品質(zhì)量，Y為吸熱峰面積)，相關(guān)系數(shù)R2為0.9991(n=7)，線性關(guān)系良好，符合純度定值方法的要求。

2.1.3精密度考察 精密稱取標準物質(zhì)候選物樣品約3 mg，共計6份，獲得吸熱峰面積值，經(jīng)結(jié)果分析，RSD值為1.65%，小于2.0%，符合方法精密度要求。

2.2MB法 MB法是建立在高效液相色譜面積歸一化法的基礎(chǔ)上，通過扣除標準物質(zhì)候選物樣品中的雜質(zhì)含量(包括：水分I水分、熾灼殘渣I熾灼殘渣、溶劑殘留I溶劑殘留和有機雜質(zhì)I有機雜質(zhì))獲得的物質(zhì)純度值，因此標準物質(zhì)候選物純度P物質(zhì)純度的計算公式為：P物質(zhì)純度=(100%-I有機雜質(zhì))×(100%-I水分-I熾灼殘渣-I溶劑殘留)×100%，這種方法能夠避免在高效液相色譜中無法檢出的水分、無機物、溶劑殘留等雜質(zhì)對純度的影響。

2.2.1供試品溶液配制 精密稱取醋酸甲羥孕酮純度標準物質(zhì)候選物樣品5 mg，選擇甲醇作為溶劑，在50 mL量瓶定容，得到供試品溶液，濃度為100 μg·mL-1。

2.2.2高效液相色譜條件優(yōu)化 通過對不同型號色譜柱、流動相種類、流動相比例以及檢測波長等因素進行考察。最終選用Agilent Eclipse XDB C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色譜柱，在波長254 nm條件下，流動相選擇水：甲醇=25：75進行純度測定。

2.2.3雜質(zhì)含量的測定 對MB法中無法直接通過高效液相色譜法獲得的雜質(zhì)含量進行考察。①水分雜質(zhì)含量：采用卡爾·費休滴定儀測定，樣品中水分含量平均值為(0.266 4±0.004 50)%(n=10)；②熾灼殘渣含量：測定樣品中熾灼殘渣含量平均值為(0.031 1±0.017 7)%(n=10)；③溶劑殘留含量：采用氣相色譜法對制備過程中常用的甲醇、乙醇、丙酮、乙腈和乙酸乙酯5種溶劑進行檢測，經(jīng)線性回歸方程計算溶劑殘留總含量為(0.028 0±0.021 0)%(n=10)。

3 均勻性與穩(wěn)定性考察

根據(jù)JJG1006-1994《一級標準物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》與JJF1343-2012《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》中的技術(shù)要求，分別對標準物質(zhì)候選物樣品的均勻性與短期、長期穩(wěn)定性進行考察，獲得的均勻性結(jié)果通過單因素方差分析，穩(wěn)定性經(jīng)t檢驗，最終確定該物質(zhì)是否符合標準物質(zhì)的相關(guān)要求。

3.1均勻性考察 隨機抽取25瓶已封裝樣品，每瓶取樣3份，采用MB法進行均勻性考察。檢查結(jié)果經(jīng)單因素方差分析：組間平均方差為9.72×10-9，組內(nèi)平均方差為7.07×10-9，F(xiàn)=1.38，小于臨界值F0.05(24，50)=2.04。結(jié)果說明醋酸甲羥孕酮純度標準物質(zhì)候選物樣品符合樣品均勻性要求。

3.2穩(wěn)定性考察 將封裝后的標準物質(zhì)候選物置于高溫(60 ℃)、光照[強度(4500±500) lx]條件下，于0，5，10，15，20 d取樣，采用MB法進行穩(wěn)定性考察。檢測結(jié)果經(jīng)t檢驗，表明標準物質(zhì)候選物能夠滿足短期運輸?shù)姆€(wěn)定性要求。將標準物質(zhì)候選物樣品置于常溫(20 ℃)條件下，于0，1，2，4，6，12個月取樣，進行長期穩(wěn)定性考察。通過線性擬合分析，直線斜率不顯著，表明醋酸甲羥孕酮標準物質(zhì)候選物符合有效期內(nèi)儲存的穩(wěn)定性要求。

4 DSC法與MB法聯(lián)合定值及不確定度評定

本研究選取DSC法與MB法聯(lián)合進行醋酸甲羥孕酮標準物質(zhì)候選物特性值定值分析，能夠避免單一方法的局限性，使候選物樣品定值結(jié)果的準確性得到提高，兩種方法在定值過程中存在多種因素引入的不確定度。

4.1DSC法定值及不確定度影響因素 精密稱取10份樣品，采用DSC法測定其純度值(表1)，通過Grubbs檢驗剔除可疑值，獲得DSC法定值結(jié)果。

表1 DSC法定值結(jié)果

4.2MB法定值及不確定度影響因素分析 精密稱取10份醋酸甲羥孕酮純度標準物質(zhì)候選物樣品，經(jīng)MB法測定純度標準值P(MB)，檢測結(jié)果見表2。

表2 MB法定值結(jié)果

DSC法與MB法不確定度影響因素與結(jié)果見表3。

4.3MB法與DSC法聯(lián)合定值 采用MB法與DSC法對醋酸甲羥孕酮純度標準物質(zhì)進行聯(lián)合定值，通過t檢驗方法對兩種不同原理定值的結(jié)果進行比較，并對結(jié)果的一致性進行考察。經(jīng)t檢驗，兩種方法獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果符合一致性要求。因此，醋酸甲羥孕酮純度標準物質(zhì)候選物樣品的純度值為兩種方法的算術(shù)平均值，即99.54%。

表3 DSC法與MB法不確定度影響因素與結(jié)果

5 討論

采用MB法與DSC法2種不同原理的方法對醋酸甲羥孕酮標準物質(zhì)候選物進行純度特性值和不確定度值標定。在特性值測定過程中綜合考慮對醋酸甲羥孕酮純度準確性及不確定度產(chǎn)生影響的多種因素，最終醋酸甲羥孕酮標準物質(zhì)的定值結(jié)果為(99.5±0.5)%(k=2，P=0.95)，滿足國家一級標準物質(zhì)要求的均勻性、穩(wěn)定性、量值溯源性及量值傳遞性的要求，并已取得國家市場監(jiān)督管理總局資格認證，國家一級標準物質(zhì)證書編號為GBW 09592。醋酸甲羥孕酮標準物質(zhì)的研制填補了我國在避孕節(jié)育類藥物化學(xué)計量標準物質(zhì)方面的短缺，為該藥物的科學(xué)儲存、運輸、質(zhì)量控制以及計量監(jiān)控等提供了更有效的物質(zhì)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。