龔慶 宋秋瑩 邱莉晶 黃曉巍* 趙文海*

1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，吉林 長春 130021 2.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117

骨質(zhì)疏松癥是一種臨床常見老年性疾病，絕經(jīng)后女性也是易患人群。中醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為，骨質(zhì)疏松屬于“骨痹、骨痿”等病的范疇，其病變在骨，本在腎[1]。人體骨骼的生長、發(fā)育或退化與腎之精氣密不可分，腎虛是骨質(zhì)疏松癥的一個重要誘因，即中醫(yī)“腎主骨生髓”理論，腎能生髓，髓能充骨，腎氣旺則骨骼韌[2-3]。鹿茸具有補腎壯陽、強筋健骨的功效，是中醫(yī)臨床骨病治療的核心藥材[4]。鹿茸多肽(velvet antler polypeptides, VAP)是鹿茸的主要藥效物質(zhì)，通過傳統(tǒng)的復(fù)合乳液溶劑蒸發(fā)法制備載藥PLGA微球可有效提高其生物利用度。本文采用卵巢切除術(shù)復(fù)制大鼠骨質(zhì)疏松模型，探討PLGA微球搭載VAP對骨質(zhì)疏松的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：健康Wistar大鼠48只，3月齡，雌性，SPF級，體質(zhì)量(180±10)g，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，動物許可證號碼：SCXK(吉)-2016-0003。實驗動物標(biāo)準(zhǔn)條件下自由飲水和攝食。

1.1.2實驗試劑：搭載VAP的PLGA微球(長春中醫(yī)藥大學(xué)制備)；阿侖膦酸鈉片，規(guī)格：6片/盒、10 mg/粒，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字H20061303)；鈣(Ca2+)測試盒、堿性磷酸酶(ALP)測試盒、酸性磷酸酶(ACP)測試盒、骨鈣素(OC)放射免疫分析藥盒，碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：20181130、20182662、20181589、20183389)；Runx2(runt-related transcription factor 2)和骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)一抗、二抗、ECL化學(xué)發(fā)光顯色劑，武漢三鷹生物科技有限公司(貨號：Ag28113、18933-1-AP、SA00001-2、B500024)。

1.1.3實驗設(shè)備：PUS-2018G半自動生化分析儀(普朗醫(yī)療科技公司)；BI-2000圖象分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；骨密度測定儀(美國 HOLOGIC discovery WA)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；CKX41型光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；TB-718D型生物組織自動包埋機(jī)、TS-12U生物組織自動脫水機(jī)、TK212型自動恒溫漂片儀、TK213型自動恒溫烘片儀(湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；OmegaLum C型凝膠成像儀(美國Aplegen公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1模型制備：48只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SHG)、模型對照組(MCG)、阿侖膦酸鈉組(ALG)、PLGA包載VAP的低、中、高劑量組(VLG、VMG、VHG)，每組8只。2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，除SHG組外，其他各組均摘除雙側(cè)卵巢，術(shù)后腹腔注射青霉素鈉10萬單位/只，連續(xù)3 d。SHG組在相同位置做切口而不摘除卵巢，切除卵巢附近等量的脂肪組織。

1.2.2藥物干預(yù)：各組大鼠均采用灌胃給藥的方式，給藥劑量如下：ALG組給予阿侖膦酸鈉24 mg/kg，VLG、VMG、VHG分別給予PLGA包載的VAP 22.5 mg/kg、45 mg/kg、90 mg/kg，SHG組、MCG組給予等容量的蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥3個月。末次給藥后24 h，2%戊巴比妥鈉麻醉后腹主動脈取血，3 500 r/min離心10 min,取血清，超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。行動物脫頸椎處死后，分別取其左、右兩側(cè)股骨。

1.2.3血清生化指標(biāo)檢測：按試劑盒說明書上的方法分別檢測各組大鼠血清中Ca2+、ACP、ALP和OC的含量。

1.2.4股骨骨密度測定：取各組大鼠左側(cè)股骨，按照骨密度測定儀說明書上的操作步驟進(jìn)行檢測。

1.2.5骨結(jié)構(gòu)光鏡觀察：取右側(cè)股骨粗隆部位用10%甲醛固定，制作常規(guī)石蠟切片，HE染色，BI-2000圖象分析系統(tǒng)測量骨皮質(zhì)平均厚度(bone cortical thickness, BCT)和骨小梁面積(trabecular bone area, FTA)。

1.2.6Western blot檢測股骨Runx2和BMP-2蛋白表達(dá)水平：將收集的股骨經(jīng)PBS清洗后，提取總蛋白。通過BCA蛋白定量試劑盒對樣品進(jìn)行蛋白定量，調(diào)節(jié)蛋白濃度為2 g/L；將蛋白樣品與等體積2×樣品緩沖液混合后，100 ℃水浴5 min后即刻放入冰浴中冷卻；將樣品加到SDS-PAGE膠的加樣孔內(nèi)，每孔加樣20 μL，280 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜60 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，TBST洗3次，每次5 min，之后將膜放入5%的脫脂奶粉中，水平搖床，室溫下封閉2 h。封閉結(jié)束后，將膜取出，TBST浸洗3次，每次5 min，加入相應(yīng)的一抗(1∶1 000)稀釋液，4 ℃儲存，過夜。加HRP標(biāo)記二抗(1∶2 000)，水平搖床，室溫封閉2 h。加ECL發(fā)光液，室溫孵育1 min。將膜正面朝上放到凝膠成像儀內(nèi)，拍照、記錄結(jié)果。以目的條帶與內(nèi)參照的吸光度(A)比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清生化指標(biāo)結(jié)果

給藥3個月后，與SHG組比較，MCG組、ALG組、VLG組、VMG組和VHG組大鼠血清中ACP、ALP和OC水平明顯升高，Ca2+水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與MCG組相比，ALG組、VLG組、VMG組和VHG組大鼠血清中ACP、ALP、和OC水平明顯降低，Ca2+水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，見圖1。生化分析儀檢測結(jié)果表明，PLGA搭載的VAP對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清生化指標(biāo)有明顯的調(diào)節(jié)作用，并呈一定的劑量依賴性。

圖1 各組大鼠血清ACP、ALP、OC和Ca2+的含量注：與SHG組相比，##P<0.01；與MCG組相比，*P<0.05，**P<0.01。Fig.1 Concentration of serum ACP, ALP, OC and Ca2+ of rats in each

2.2 股骨BMD測量結(jié)果

骨密度儀檢測結(jié)果表明，與SHG比較，MCG和VLG組大鼠股骨BMD明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與MCG組比較，ALG、VMG和VHG組大鼠股骨BMD明顯升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠骨密度檢測結(jié)果注：與SHG組相比，#P<0.05，##P<0.01；與MCG組相比，*P<0.05。Fig.2 Restults on BMD of rats in each

2.3 股骨HE染色結(jié)果

通過對股骨粗隆部位HE染色觀察結(jié)果表明，鹿茸多肽和阿侖膦酸鈉對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠BCT和FTA有明顯的改善作用。具體情況如下：與SHG組比較，MCG組大鼠BCT明顯降低，MCG組、ALG組、VLG組、VMG組和VHG組大鼠FTA明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與MCG組比較，ALG組、VLG組、VMG組和VHG組大鼠BCT和FTA明顯升高(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組大鼠HE染色結(jié)果注：與SHG組相比，##P<0.01；與MCG組相比，*P<0.05，**P<0.01。Fig.3 Restults on HE staining of rats in each

2.4 股骨Runx2和BMP-2蛋白表達(dá)水平

Western blot結(jié)果表明，與SHG組比較，MCG組、ALG組、VLG組和VMG組大鼠股骨Runx2蛋白表達(dá)水平明顯降低，MCG組、VLG組、VMG組和VHG組大鼠股骨BMP-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與MCG組比較，ALG組、VLG組、VMG組和VHG組大鼠股骨Runx2和BMP-2蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見圖4，表1。

圖4 各組大鼠股骨Runx2和BMP-2蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4 Runx2 and BMP-2 protein expression electrophoresis diagram of rat femurs in each group

表1 各組大鼠股骨Runx2和BMP-2蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一類代謝障礙性骨病，常見于老年人及絕經(jīng)期婦女，臨床常見的病理特征包括骨皮質(zhì)厚度降低、骨小梁面積減少、Ca2+流失等等，同時伴隨著骨密度降低進(jìn)而誘發(fā)骨折的發(fā)生，危及患者的生活質(zhì)量[5]。

鹿茸在中醫(yī)骨病的治療方面歷史悠久，具有補腎壯陽、生精益血、補髓健骨等諸多功效[6-8]。VAP為鹿茸的主要藥效物質(zhì)，現(xiàn)代研究[9-11]表明，其能促進(jìn)組織愈合并對多種細(xì)胞的增殖、分化有較好的促進(jìn)作用，同時可提高機(jī)體自身免疫力，加速損傷部位的修復(fù)。Yang CH等[12]在體外實驗中驗證了VAP可以通過激活EGF/EGFR信號通路保護(hù)成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)免受炎癥和氧化損傷的影響；李文超等[13]通過原帶培養(yǎng)SD大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞驗證了一定濃度的VAP可以改善基質(zhì)代謝，延緩椎間盤軟骨終板的退變。但鹿茸多肽在應(yīng)用時不得不面對半衰期短、受體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境影響易被蛋白酶降解等諸多因素影響的問題，通過改良藥物劑型，提高藥物生物利用度是切實可行的辦法。本研究以PLGA為載體搭載VAP達(dá)到藥物緩釋靶向的目的，有效解決了上述問題且安全無毒副作用[14-15]。本研究在此基礎(chǔ)上構(gòu)建去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型，以ALG為陽性對照，評價PLGA微球搭載VAP對于骨質(zhì)疏松癥的治療作用，并探討可能的作用機(jī)制。

骨密度是評價骨質(zhì)疏松損傷程度的最直觀指標(biāo)，血清生化指標(biāo)Ca2+、ALP、ACP和OC可有效反映機(jī)體的骨代謝水平，BMD降低、血清生化指標(biāo)紊亂將極大增加患者骨折的危險[16]。本實驗研究結(jié)果表明，PLGA微球搭載VAP可改善機(jī)體鈣離子吸收的環(huán)境，提高去卵巢大鼠骨密度，并通過降低血清中堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和骨鈣素的含量，抑制破骨細(xì)胞活性從而有效延緩骨質(zhì)疏松的發(fā)生。此外，通過HE染色觀察股骨微觀形態(tài)學(xué)，檢測結(jié)果表明PLGA微球搭載VAP可以顯著增加BCT和FTA進(jìn)而改善模型大鼠的骨質(zhì)。

Runx2和BMP-2在骨發(fā)育的不同階段扮演重要角色，可調(diào)控成骨細(xì)胞的分化、軟骨細(xì)胞成熟、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞的增殖分化等諸多過程，是骨形成、骨代謝過程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[17-18]。Western blot研究結(jié)果表明，PLGA微球搭載VAP可顯著提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨Runx2和BMP-2蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，PLGA微球搭載VAP對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與提高股骨Runx2和BMP-2蛋白表達(dá)水平有關(guān)。