許志賢 何武兵 柯鐵 張永發(fā) 傅超鋒 蔡加琴 張桂楓

福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院/福建省立醫(yī)院，福建 福州 350001

各種原因如創(chuàng)傷、感染等造成的骨缺損、骨不愈合一直是骨科治療的難題之一，骨組織工程、生長因子和基因修飾是研究較多的治療手段，以提高骨密度從而促進骨的再生[1]。由于骨髓來源間充質(zhì)干細胞(bone marrow derived-mesenchymal stem cells, BM-MSCs)是一類來源于中胚層且具有強大增殖潛力和多向分化能力的一種前體干細胞，其來源不受限制，取材方便，分離后在體內(nèi)或特定的條件下，能夠向成骨細胞分化[2]，是再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究中重要的種子細胞，在骨組織工程和細胞治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，也為骨科疑難問題提供了新的解決途徑。維生素K2是一種脂溶性維生素，是參與血液凝固的關(guān)鍵因子[3]。流行病學(xué)研究[4]顯示缺乏維生素K2可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥和老年人的骨關(guān)節(jié)炎。此外，它在臨床上已被用于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，并且可能通過促進成骨細胞分化和礦化發(fā)揮其保護作用[5]。本研究旨在觀察不同濃度維生素K2對BM-MSCs成骨分化過程的影響，探討維生素K2對BM-MSCs成骨信號軸中Smad1/5/8、Runx2、成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix) 等表達的調(diào)節(jié)作用，為維生素K2作為潛在的促成骨分化因子協(xié)同MSCs應(yīng)用于骨缺損等相關(guān)骨科疾病提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM低糖培養(yǎng)基 (Gibco公司，美國)；胎牛血清 (FBS，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)；青霉素-鏈霉素混合液(Gibco公司，美國)，0.25%胰酶 (Gibco公司，美國)；CCK-8細胞計數(shù)試劑盒(碧云天公司，中國)；維生素K2 (Sigma公司,美國)；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Cyagen公司，美國)；PCR相關(guān)試劑isoPlus、PrimesScriptTMRT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ Kit(Takara，Japan)；Runx2 兔抗鼠單克隆抗體(Abcam公司，英國)；Smad1/5/8 兔抗鼠單克隆抗體(Novus公司，美國)；Osterix兔抗鼠單克隆抗體(Abcam公司，英國)；倒置相差顯微鏡(Olympus IX50，日本);熒光定量PCR儀器 (Eppendorf，德國)；Western blot成像系統(tǒng)(Bio. Rad，美國)；Western blot半干轉(zhuǎn)膜儀 (Bio. Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1BM- MSCs分離、培養(yǎng)：按前期實驗方法[6]對骨髓來源的間充質(zhì)干細胞進行分離、培養(yǎng)。 選取1月齡SD大鼠，雌雄不限 [購自福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，實驗動物許可證號: SYXK(閩)2016-0004]。無菌環(huán)境下抽取脛骨骨髓，加入肝素抗凝。混入Percoll分離液進行離心，獲取鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞。接種于培養(yǎng)瓶中，加入L-DMEM完全培養(yǎng)基，于5% CO2, 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后換液，待細胞融合80%后進行傳代。

1.2.2CCK-8 法檢測細胞增殖能力：將生長良好的BM-MSCs以10 000/cm2的密度接種于96孔板，孵育24 h后，分為加藥組(維生素K2組)和對照組，加藥組加入含維生素K2濃度(10-9～10-4mol/L)的L-DMEM，對照組加入L-DMEM，每組4個樣本，分別于24、48和72 h檢測細胞增殖能力。每孔加入10 μL CCK-8溶液，未接種細胞孔調(diào)零，37 ℃ 培養(yǎng)箱中孵育 1 h，酶標儀 450 nm 處測吸光度值。

1.2.3Real-time PCR檢測成骨相關(guān)基因BMP-2表達：將生長良好的BM-MSCs接種于六孔板，待細胞融合至70%,吸棄培養(yǎng)液。根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果，將后續(xù)實驗分為兩組：加藥組和對照組。加藥組加入含不同濃度的維生素K2 (10 nmol/L, 100 nmol/L, 1 μmol/L)的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對照組是成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于5% CO2， 37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第3天收集細胞，每孔細胞加入 1 mL的RNA裂解液，提取細胞總RNA并檢測濃度，反轉(zhuǎn)錄后實時熒光定量PCR檢測成骨相關(guān)基因BMP-2的表達。引物序列:GAPDH上游引物為 5’- TGT TCC TAC CCC CAA TGT GT-3’，下游引物 為5’-GGT CCT CAG TGT AGC CCA AG-3’，BMP-2 上游 引物為 5′-TGTGG ACTTCAG TGATGTG-3′，下游引物 為 5′-TGGAGTTCAGG TGGT CAG-3′。

1.2.4茜素紅染色：將生長良好的BM-MSCs接種于六孔板，待細胞融合至70%,吸棄培養(yǎng)液。實驗分為兩組：加藥組和對照組，加藥組加入含不同濃度的維生素K2 (10 nmol/L, 100 nmol/L, 1 μmol/L)的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為對照組，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于成骨誘導(dǎo)的第7天、14天和21天，行茜素紅染色。方法如下：PBS清洗細胞2遍后，每孔加4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗2次后，加入1.5 mL茜素紅染液，30 min后PBS清洗2遍，放入倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5Western blot檢測Smad1/5/8, Runx2及Osterix蛋白表達水平：將生長良好的BM-MSCs接種于六孔板，待細胞融合至70%,吸棄培養(yǎng)液。實驗分為兩組：加藥組和對照組，加藥組加入終濃度為1 μmol/L維生素K2的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為對照組，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后收集細胞，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取20 μg 蛋白樣品，經(jīng)8% SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上后，封閉2 h，加入一抗(兔抗Smad1/5/8，Runx2, Osterix抗體或兔抗-β-actin 抗體) 4 ℃過夜，1 × TBST溶液洗滌5次，每次5 min，加二抗(HRP標記的羊抗兔 IgG 抗體)，室溫孵育2 h，ECL顯色，放入Bio-Rad成像儀中，打開軟件進行掃描與分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BM-MSCs的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

原代培養(yǎng)BM-MSCs 48 h時，細胞形態(tài)多呈短梭形和多角形，隨著培養(yǎng)時間延長，細胞呈三角形、多角形和梭形；一周左右可見細胞趨于融合。第3代細胞形態(tài)基本趨于梭形(圖1)。后續(xù)實驗所用的細胞是第三代。

圖1 BM-MSC形態(tài)學(xué)觀察(×200)Fig.1 Aspect of BM-MSCs at confluence(×200)

2.2 不同濃度維生素K2對BM-MSCs細胞活性的影響

使用CCK法分析不同濃度的維生素K2處理BM-MSCs細胞不同時間后對細胞生長的影響。與對照組比較，隨著處理時間的延長，維生素K2在濃度小于1 nmol/L時不影響B(tài)M-MSCs的生長活性，維生素K2在濃度為10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L時明顯促進BM-MSCs的生長(P<0.05)，當(dāng)濃度高于1 μmol/L時對BM-MSCs的活力呈抑制趨勢，10 μmol/L時則明確抑制細胞的生長(P<0.05)，見圖2?？梢姴煌瑵舛鹊木S生素K2對BM-MSCs生長影響作用不同，中濃度(10 nmol/L, 100 nmol/L, 1 μmol/L)維生素K2對BM-MSCs生長呈促進作用。

圖2 維生素K2對BM-MSC生長的影響注：與對照組比較，*P<0.05, #P<0.01。Fig.2 Effects of Vitamin K2 on the growth of

2.3 不同濃度維生素K2對BM-MSCs成骨過程中BMP-2mRNA的影響

不同濃度維生素K2干預(yù)72 h后，Q-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，不同濃度(10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L)的維生素K2對BM-MSCs成骨過程中BMP-2 mRNA表達具有明顯促進作用，在劑量范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，BMP-2 mRNA表達升高越明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且1 μmol/L維生素K2對BMP-2 mRNA表達的促進作用比10 nmol/L和100 nmol/L更明顯(P<0.05)，見圖3。

圖3 維生素K2對BM-MSCs成骨過程中BMP-2 mRNA的影響注：與對照組比較，*P<0.01；與10 nmol/L和100 nmol/L組比較，&P<0.05。Fig.3 Effects of Vitamin K2 on the expression of BMP-2 mRNA in BM-MSCs

2.4 維生素K2對BM-MSCs成骨過程中鈣結(jié)節(jié)形成的影響

鈣結(jié)節(jié)是BM-MSCs向成骨細胞分化的重要標志之一。與對照組比較，不同濃度(10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L)的維生素K2在BM-MSCs成骨分化的第7、14、21天均具有促進鈣結(jié)節(jié)形成的作用，并且該作用呈濃度依賴性(圖4)，表明維生素K2在BM-MSCs在成骨分化整個過程均發(fā)揮促進作用。

圖4 不同濃度維生素K2對BM-MSCs成骨分化過程中鈣結(jié)節(jié)的影響Fig.4 Effects of Vitamin K2 with Different Concentrations on the Calcium Nodules during Osteogenic Differentiation of BM-MSCs

2.5 維生素K2對BM-MSCs成骨過程中Smad1/5/8、Runx2 及 Osterix 蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，1 μmol/L的維生素K2處理BM-MSCs 3 d后，可明顯增強成骨信號軸Smad1/5/8、Runx2和Osterix蛋白表達水平 (圖5)。

圖5 維生素K2對BM-MSCs中Smad1/5/8、Runx2 和Osterix表達的影響Fig.5 Effect of vitamin K2 on expression of Smad1/5/8, Runx2 and Osterix in BM-MSCs

3 討論

維生素K2是維生素K家族中唯一具有生物活性的脂溶性維生素, 是人體骨和鈣代謝的必需物質(zhì)，在骨和鈣代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵及決定性的作用[7]。近年的研究[8]已經(jīng)證實維生素K2對成骨細胞具有保護作用，維生素K2可促進成骨細胞增殖和體外成骨細胞-骨細胞轉(zhuǎn)變，包括細胞外基質(zhì)中的OCN積累、Runx2和堿性磷酸酶(ALP)的上調(diào)以及成骨基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進成骨細胞的分化和礦化，因此在骨質(zhì)疏松的治療中可能發(fā)揮重要作用。BM-MSCs因具備強大的增殖能力及分化能力已經(jīng)成為骨組織工程重要的種子細胞，在骨折愈合及骨質(zhì)疏松等骨科疾病的治療都具有重要價值。如何使BM-MSCs定向成骨分化及探索內(nèi)在機制將成為研究的焦點。維生素K2對BM-MSCs生化和成骨分化作用卻未見報道，此次研究結(jié)果顯示BM-MSCs的生長受維生素K2的濃度變化影響較大，低濃度(小于1 nmol/L)不影響B(tài)M-MSCs的生長，中濃度維生素K2(10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L)明顯促進BM-MSCs的生長，而高濃度維生素K2(高于1 μmol/L) 呈明顯地抑制作用。中濃度維生素K2在BM-MSCs成骨分化的第7、14、21天均具有明顯促進礦化的作用。

目前已知多種信號通路如Wnt/β-catenin、MAPK、成纖維細胞生長因子(FGFs)及ERK等參與BM-MSCs的成骨分化過程[9-12]。這些信號相互聯(lián)系相互影響，組成復(fù)雜而精細的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)BM-MSCs的成骨分化。研究[13-14]表明BMP信號通路在骨組織形成、間充質(zhì)干細胞成骨分化及骨再生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有報道[15]顯示維生素K2通過誘導(dǎo)自噬而促進成骨細胞MC3T3-E1的成骨分化。本研究中維生素K2在中濃度范圍內(nèi)(10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L)可顯著促進骨髓來源BM-MSCs的成骨分化，促進成骨相關(guān)因子BMP-2mRNA的表達，且與在該濃度范圍內(nèi)呈藥物劑量相關(guān)性。后續(xù)研究采用不影響B(tài)M-MSCs生長且保持促進成骨作用的藥物濃度(1 μmol/L)。Smad信號通路是調(diào)控BMP發(fā)揮成骨作用的主要通路，Runx2和Osterix 都是BMP/Smad通路重要的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子[16-17]。Runx2是參與成骨細胞分化與骨形成的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，該基因發(fā)生突變后將會導(dǎo)致顱骨銷骨發(fā)育不全綜合征[18]。Osterix在成骨細胞分化中發(fā)揮重要調(diào)控作用，研究[19]發(fā)現(xiàn)Osterix在小鼠胚胎發(fā)育期的骨形成細胞中高表達，敲除后小鼠的骨組織發(fā)生發(fā)生嚴重障礙。本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)維生素K2處理3天后，BM-MSCs的Smad1/5/8、Runx2以及Osterix蛋白水平均較對照組有顯著升高，表明維生素K2對BM-MSCs成骨分化早期的促進作用可能是通過這一信號通路實現(xiàn)。

綜上所述， 本次研究初步證實了維生素K2具有定向促進BM-MSCs成骨分化的作用，并且成骨信號軸BMP-2/Smads/Runx2/Osterix與維生素K2的促成骨分化作用密切相關(guān)，是維生素K2促進成骨分化的分子機制之一，為維生素K2作為潛在的促成骨分化因子協(xié)同MSCs用于骨缺損等相關(guān)骨科疾病提供實驗基礎(chǔ)。