王郅媛， 李赤霞， 張 萌， 王友升，4，*

(1.北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 北京 100048;2.北京科學(xué)儀器裝備協(xié)作服務(wù)中心， 北京 100048；3.山東凱普菲特生物科技有限公司， 山東 日照 276800；4.日照華偉大健康產(chǎn)業(yè)研究院， 山東 日照 276800)

隨著人們對健康食品的關(guān)注日益增加，篩選食品功能因子成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[1-2]?；诎悬c(diǎn)導(dǎo)向的特定生物活性篩選是高通量開發(fā)食品功能因子的較為廣泛的研究方法[3-4]。研究表明，環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)9A能催化體內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)的水解[5]，可作為篩選開發(fā)具有有效預(yù)防糖尿病[6]、心血管病[7]、貧血[8]及阿爾茨海默氏癥[9-11]等功效的功能因子的新型靶點(diǎn)[12]?；赑DE9A靶點(diǎn)導(dǎo)向的生物活性物質(zhì)高通量篩選的前提是獲得高質(zhì)量的PDE9A蛋白并對其酶學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)分析，但目前關(guān)于PDE9A體外表達(dá)及其酶學(xué)特性的報(bào)道較少。

研究將人源PDE9A(氨基酸殘基181～506)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，利用異丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)PDE9A蛋白表達(dá)，采用不同純化系統(tǒng)制備高純度PDE9A，并對純化的PDE9A蛋白進(jìn)行酶活特性分析，以期可高通量篩選具有調(diào)節(jié)血糖等功能的天然活性物質(zhì)，并為功能性食品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌體與質(zhì)粒

Escherichiacoli感受態(tài)細(xì)胞BL21，本實(shí)驗(yàn)室保存；pET15b-PDE9A(氨基酸殘基181～506)，美國北卡萊羅納大學(xué)教堂山分?？潞饷鹘淌陴佡?。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品Marker、10 x PCR buffer、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker，美國Thermo公司；乙二胺四乙酸鈉(EDTA)，北京西隴化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris-Base)、 氨芐青霉素(ampicillin，AMP)、氯霉素，美國Sigma公司；IPTG、cGMP，美國Amoresco公司；蛋白胨、酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氯化鈉，國藥集團(tuán)；瓊脂，北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.2.1實(shí)驗(yàn)儀器

French Press SL-650D型超聲破碎儀，南京順流儀器公司；層析實(shí)驗(yàn)冷柜，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JP61M/HV-85型高壓滅菌鍋，日本Hirayama公司；PHS-3D型pH計(jì)，上海儀表有限公司；Thermo Forma ClassⅡA2型凈化工作臺，美國Thermo公司；5810R型高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.2.2蛋白純化柱

30230型Ni-NTA agarose，德國Qiagen公司；17-0510-01型Q-SepharoseTMFast Flow、SephacrylTMS300，美國GE Healthcare Life公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1重組pET15b-PDE9A質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)

將pET15b-PDE9A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中37 ℃培養(yǎng)12～16 h。挑菌、接種到2xYT培養(yǎng)基中采用 IPTG低溫(15 ℃)誘導(dǎo)表達(dá)[13]。誘導(dǎo)結(jié)束后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min集菌，并分別在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)結(jié)束后測定600 nm處的吸光度，按照等菌體量取樣并進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.3.2PDE9A蛋白純化

1.3.2.1 菌體破碎

參考文獻(xiàn)[14]，表達(dá)菌體按照質(zhì)量比1∶10加入提取液懸浮液并進(jìn)行超聲破碎(工作時間5 s，間歇時間5 s，共工作30 min)3次，分別對總蛋白質(zhì)、上清液蛋白、沉淀蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測[15]。

1.3.2.2 基于重組蛋白多重性質(zhì)的分離純化

上清液蛋白利用Ni-NAT瓊脂糖樹脂親和柱純化并在280 nm處測定純化蛋白質(zhì)的吸光度，將A280等于1定義為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度1 mg/mL，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測[16]。Ni-NAT純化收集溶液中加入牛凝血酶酶切1.5 h。10 000 r/min離心20 min后，將上清液蛋白溶液加入Q-Sepharose進(jìn)行分離純化和SDS-PAGE檢測。Q-Sepharose純化后的蛋白質(zhì)經(jīng)超濾濃縮至10 mL[17]。濃縮后的蛋白質(zhì)加入Sephacryl S300中進(jìn)行純化，洗脫收集的PDE9A蛋白測定其280 nm處的吸光度并進(jìn)行SDS-PAGE和Native-PAGE檢測。將蛋白收集液超濾濃縮至10 mg/mL以上并冷凍保存[18]。

1.3.3PDE9A酶活力測定

PDE9A酶活測定參考Hou等[19]。反應(yīng)體系為20 μmol/L cGMP底物、3.2 μg/mL PDE9A純化蛋白和20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH值8.0)，30 ℃反應(yīng)30 min后采用HPLC測定底物的含量，根據(jù)底物峰面積的減少量計(jì)算PDE9A蛋白的水解率。1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol cGMP所需要的酶量定義為1個酶活力單位(U)，相對酶活力定義為各條件測得的蛋白水解率相對于最高水解率的百分比。每組實(shí)驗(yàn)做3次平行實(shí)驗(yàn)。

色譜檢測條件：色譜柱Intertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相A為0.02 mol/L KH2PO4，流動相B為甲醇，洗脫條件為體積分?jǐn)?shù)82%A：18%B。檢測波長252 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL[20]。

1.3.4最適反應(yīng)溫度的測定

按照1.3.3中的反應(yīng)條件，分別在4、25、30、37、45、50、60、70 ℃下反應(yīng)30 min后，測定其酶活力[21]。

1.3.5最適pH值的測定

配置不同pH值的緩沖液作為反應(yīng)緩沖液(pH值為3.0、4.0、5.0的檸檬酸鹽緩沖液，pH值為6.0、7.0的磷酸鈉鹽緩沖液、pH值為8.0、9.0的Tris-HCl緩沖液)，緩沖液的濃度均為20 mmol/L。根據(jù)1.3.3的方法，在最適溫度下反應(yīng)30 min后測定PDE9A蛋白的酶活力[22]。

1.3.6Mg2+離子和DTT對酶活力的影響

在磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH值7.0)、Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L，pH值8.0)反應(yīng)體系中分別添加10 mmol/L Mg2+和(或)1 mmol/L DTT，在最適溫度下反應(yīng)30 min后測定PDE9A的酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

SDS-PAGE電泳圖應(yīng)用Image軟件進(jìn)行分析，酶活特性測定數(shù)據(jù)采用SPSS和Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET15b- PDE9A質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)分析

對誘導(dǎo)0 h和24 h的蛋白表達(dá)菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖1。低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)可以減少包涵體的形成，促進(jìn)可溶性蛋白的表達(dá)并維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[23]。由圖1可知，IPTG低溫(15 ℃)誘導(dǎo)24 h后，出現(xiàn)一條明顯的蛋白質(zhì)條帶，蛋白質(zhì)條帶的大小與PDE9A目的蛋白(約41 kDa)相近，由此可說明該誘導(dǎo)條件可增加PDE9A蛋白表達(dá)含量且平均1 L培養(yǎng)基可得到3.125 g外源表達(dá)菌體。

M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker；1：誘導(dǎo)0 h；2：誘導(dǎo)24 h。圖1 PDE9A蛋白不同誘導(dǎo)時間的SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE results of PDE9A protein at different induction time

2.2 PDE9A蛋白的分離純化分析

外源表達(dá)菌體破碎以及Ni-NAT、Q-Sepharose和Sephacryl S300分離純化結(jié)果見圖2。 從圖2(a)可以看出，經(jīng)過超聲破碎后，上清液中的目的蛋白含量遠(yuǎn)高于沉淀中目的蛋白含量，說明此蛋白質(zhì)水溶性較強(qiáng)，但仍形成少量的包涵體。經(jīng)過Ni-NAT親和層析純化后，PDE9A蛋白純度達(dá)到80%以上，說明PDE9A蛋白與Ni-NAT有較強(qiáng)的結(jié)合能力且PDE9A蛋白能夠得到有效純化(圖2(b))。牛凝血酶可在1.5 h內(nèi)有效切除蛋白質(zhì)中的His-tag標(biāo)簽，且經(jīng)過Q-Sepharose純化目的蛋白的純度達(dá)95%(圖2(c))。濃縮蛋白加入Sephacryl S300進(jìn)行進(jìn)一步純化，此時雜合蛋白的含量小于5%，證明Sephacryl S300分子篩純化系統(tǒng)可以進(jìn)一步去除雜蛋白，提高蛋白質(zhì)的純度(圖2(d))。

PDE9A經(jīng)過Sephacryl S300純化后繼續(xù)濃縮并檢測蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。Native-PAGE結(jié)果顯示蛋白質(zhì)基本沒有凝聚現(xiàn)象，主蛋白質(zhì)條帶占80%以上，表明PDE9A蛋白在此分離純化條件不易形成多聚體且維持較好的生物學(xué)活性，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性(圖2(e))。

純化過程蛋白質(zhì)回收率結(jié)果見表1。結(jié)果表明，Q-Sepharos純化后蛋白質(zhì)的回收率為36%，而Sephacryl S300純化后蛋白質(zhì)回收率為25%，說明Q-Sepharos純化過程中損失大量蛋白質(zhì)。經(jīng)過Ni-NAT、Q-Sepharos和Sephacryl S300純化后，最終1 g表達(dá)菌體可純化獲得8.9 mg蛋白質(zhì)，證明該誘導(dǎo)條件能夠獲得大量的目的蛋白，并能經(jīng)過多重純化手段得到高純度的蛋白質(zhì)。

M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker；1：超聲破碎總蛋白；2：離心上清液蛋白；3：離心沉沉淀蛋白；N：Ni-NAT純化；E：酶切1.5 h；Q：Q-Sephacrose純化的蛋白質(zhì)；S：Sephacryl S300純化的蛋白質(zhì)；N1：取樣3 μL；N2：取樣10 μL。圖2 PDE9A蛋白的分離純化凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of PDE9A protein after different purification

2.3 PDE9A蛋白酶活性分析

利用HPLC檢測體系測定不同質(zhì)量濃度PDE9A蛋白對cGMP的水解情況，見表2。由表2可知，3.6 μg/mL PDE9A蛋白的水解率達(dá)77.27%，且酶活力達(dá)到7.76 U，說明低質(zhì)量濃度PDE9A蛋白可以水解cGMP，具有較高生物活性。Rui等[24]純化的PDE9A蛋白的EC50值為0.083 47 mg/mL，相比較而言，本實(shí)驗(yàn)表達(dá)以及純化的蛋白酶活性更強(qiáng)。3.2 μg/mL的PDE9A蛋白可水解65%底物，因此該質(zhì)量濃度可用于篩選具有PDE9A蛋白抑制作用的天然活性物質(zhì)。

表1 PDE9A蛋白質(zhì)純化回收率

表2 不同含量PDE9A對cGMP水解情況

2.4 PDE9A蛋白最適反應(yīng)溫度分析

PDE9A蛋白的最適反應(yīng)溫度測定結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，該酶的最適反應(yīng)溫度為37 ℃。30 ℃的相對酶活力為60%，45 ℃的相對酶活力為40%；而在低溫4 ℃、高溫50 ℃及以上相對酶活力降至20%以下。由此可以看出，PDE9A蛋白最適反應(yīng)溫度與人體正常溫度相同，且其在25～45 ℃有較為廣泛的作用溫度范圍，說明獲得的PDE9A蛋白能夠適應(yīng)較為寬泛的反應(yīng)溫度。

圖3 PDE9A最適反應(yīng)溫度的測定Fig.3 Detection of optimum reaction temperature for PDE9A

2.5 PDE9A蛋白最適反應(yīng)pH值分析

PDE9A蛋白在不同pH值反應(yīng)緩沖液中的相對酶活力結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，該酶的最適反應(yīng)緩沖體系的pH值為7.0，在pH值6.0～9.0，相對酶活力均能達(dá)到50%以上。由此可知，獲得的PDE9A蛋白更適合在堿性緩沖體系中發(fā)揮作用，這可能與人體的堿性環(huán)境有關(guān)，也證明該酶能夠在較寬泛的pH值范圍內(nèi)發(fā)揮作用。

圖4 PDE9A最適反應(yīng)pH值的測定Fig.4 Detection of optimum reaction pH value for PDE9A

圖5 Mg2+與DTT對PDE9A酶活力的影響Fig.5 Effects of magnesium ion and DTT on PDE9A enzyme activity

2.6 Mg2+和DTT對酶活力的影響分析

磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH值7.0)和Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L，pH值8.0)反應(yīng)體系中Mg2+和DTT對PDE9A蛋白活性的影響見圖5。DTT具有較強(qiáng)的還原能力和巰基激活能力，在Tris-HCl緩沖液反應(yīng)體系中可將PDE9A蛋白相對酶活性提高16.8%，說明PDE9A蛋白中含有較多的半胱氨酸。金屬離子是影響酶活性的重要因素之一，F(xiàn)isher等[25]證明Mg2+、Mn2+和Ca2+均可提高PDE9A蛋白的酶活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Mg2+在Tris-HCl緩沖液中可將相對酶活力提高34.6%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，但在磷酸鹽緩沖液中無作用。在Tris-HCl緩沖液體系中，Mg2+和DTT共同作用可將相對酶活力提高71.8%，說明PDE9A具有一定的金屬離子依賴性且活性中心可能有半胱氨酸，另外反應(yīng)體系的緩沖液會影響Mg2+和DTT對蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)。

3 結(jié) 論

本研究通過IPTG誘導(dǎo)，使PDE9A蛋白在大腸桿菌中大量異源表達(dá)，1 L培養(yǎng)基可獲得3.125 g蛋白表達(dá)菌體。采用多種純化手段對目的蛋白進(jìn)行純化，1 g表達(dá)菌體可純化得到8.9 mg高純度蛋白質(zhì)。通過高效液相色譜技術(shù)檢測，制備的PDE9A具有較高的催化活性。此外，Mg2+和DTT能夠顯著提高PDE9A活性，但反應(yīng)體系的緩沖液會影響Mg2+和DTT對蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)作用。本研究最終制備得到高純度、高催化活性的PDE9A蛋白，可作為篩選具有調(diào)節(jié)血糖等功效的天然活性物質(zhì)的靶點(diǎn)。