劉曉麗， 夏文水

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/食品學(xué)院/江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫 214122)

近年來(lái)，許多天然多糖及其衍生物已被證明具有良好的抗氧化活性，并被開(kāi)發(fā)為新型的潛在抗氧化劑[1-3]。殼寡糖(chitooligosaccharide, COS)是由D-氨基葡萄糖(或少量N-乙酰-D-氨基葡萄糖)通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接而成的一種低聚糖，是含量?jī)H次于纖維素的第二大天然生物多糖。殼寡糖具有優(yōu)良的抗菌性、生物無(wú)毒性、可自然降解性以及良好的生物相容性等特點(diǎn)[4-6]，在食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[7-9]。但由于殼寡糖抗氧化能力較傳統(tǒng)抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(BHA)和丁基羥基甲苯(BHT)相對(duì)較低，因此限制了其在食品行業(yè)的進(jìn)一步應(yīng)用[10]。殼寡糖的分子鏈中有3個(gè)活性位點(diǎn)，分別是C2位的伯胺、C6位的伯羥基和C3位的仲羥基，這是對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的良好活性位點(diǎn)[11-12]。

近年來(lái)，已有越來(lái)越多的研究人員致力于具有良好生物相容性、安全無(wú)毒的新型殼寡糖衍生物的制備和應(yīng)用研究。Sun等[13]通過(guò)控制化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中二羥乙酸的用量，分別制備出一種具有良好的水溶性、低毒性和抗氧化性的羧甲基殼寡糖衍生物和3種不同取代度的N-羧甲基殼寡糖衍生物，結(jié)果顯示，具有較低取代度的衍生物清除自由基的能力最強(qiáng)。Liu等[6]將具有抗菌活性的曲酸基團(tuán)，通過(guò)接枝反應(yīng)與殼寡糖的活性基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，得到了一系列具有良好生物相容性和安全無(wú)毒的衍生物。在殼寡糖的活性位點(diǎn)上可以通過(guò)接枝反應(yīng)[14]、季銨鹽反應(yīng)[15]、羧甲基反應(yīng)等[16]合成出多種衍生物。然而，目前報(bào)道的一些殼寡糖烷基化反應(yīng)產(chǎn)物的生物選擇性較低，因而存在產(chǎn)物的生物相容性差、細(xì)胞毒性和溶血活性高等問(wèn)題[17-18]。曲酸(kojic acid, KA)，化學(xué)名稱(chēng)為2-羥甲基-5-羥基-1,4-吡喃酮，是由一些微生物如曲霉屬真菌(Aspergillus)、醋桿菌屬(Acetobacter)和青霉菌屬(Penicillium)等經(jīng)過(guò)好氧發(fā)酵產(chǎn)生的一種常見(jiàn)的弱酸性代謝產(chǎn)物[19-20]。由于其特有的類(lèi)似苯鄰二酚的結(jié)構(gòu)，曲酸具有抗菌、抗病毒、抗發(fā)炎、抗腫瘤、抗氧化[21]等作用，并且具有安全無(wú)毒，pH值適用范圍廣、熱穩(wěn)定性好、受熱不易分解、對(duì)人體無(wú)刺激和食用安全等優(yōu)點(diǎn)。日本早在1988年就批準(zhǔn)曲酸作為食品和醫(yī)藥添加劑使用[21]。氯代曲酸作為曲酸的衍生物之一，具有良好的抗氧化活性的同時(shí)，還是良好的親核、親電取代的配體，并已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化妝品和化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域[22-23]。

基于本課題組前期的研究，并受殼寡糖和曲酸的結(jié)構(gòu)及其功能特性的啟發(fā)，本研究設(shè)計(jì)了一種制備殼寡糖-O-曲酸聚合物(COS-O-KA)的方法[7]，擬對(duì)其反應(yīng)條件、產(chǎn)率、取代度、分子量、多分散性指數(shù)、水溶性、酸穩(wěn)定性、體外細(xì)胞毒性、zeta電位、抗氧化活性和動(dòng)物毒性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。希望為合理利用殼寡糖這種可再生資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曲酸，分析純，武漢偉盛生物有限公司；殼寡糖，脫乙酰度90%，相對(duì)分子質(zhì)量8.828 kDa，浙江金殼藥業(yè)有限公司；殼寡糖-O-曲酸聚合物，自制。3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，購(gòu)自美國(guó)霍尼韋爾國(guó)際有限公司。硝基藍(lán)四唑(NBT)和2,2-二苯-1-苦基肼(DPPH)購(gòu)自德國(guó)Sigma-Aldrich公司。人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC CC-2571)，購(gòu)自賽奇生物工程有限公司。核黃素、蛋氨酸、Tris-HCl緩沖溶液、N-甲基哌嗪、苯甲醛、吡啶、鐵氰化鉀、乙二胺四乙酸(EDTA)、二甲亞砜(DMSO)、亞硫酰氯(SOCl2)、磷酸鹽等化學(xué)試劑，購(gòu)于國(guó)藥有限公司。健康的昆明系雌性小鼠[6～8周，(20.0±2.0) g，40只]，購(gòu)于斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8AXX型水浴鍋，上海一恒科技有限公司；SPX型智能生化培養(yǎng)箱，南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；D8Advance型X-射線結(jié)晶衍射儀，德國(guó)布魯克AXS有限公司；UV-1000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；F-7000型熒光光譜儀，日本日立公司；Nexu S470型傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet Instrument Thermo公司；TGA/SDTA851e型熱分析系統(tǒng)，梅特勒-托利多儀器有限公司；AV400型核磁共振波譜儀，德國(guó)Brucker公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1COS-O-KA的制備

參照Liu等[24]的方法制備出氯代曲酸；將一定量的殼寡糖溶解于70 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液中，再加入120 mL的甲醇，攪拌均勻，在60 ℃下緩慢加入苯甲醛和甲醇的混合液，調(diào)節(jié) pH值為7.0，抽濾，收集沉淀，用無(wú)水乙醇索氏提取12 h，真空干燥，研磨后得粉末，即得到殼寡糖希夫堿；將一定量的氯代曲酸和殼寡糖希夫堿分別溶解于50 mL的二甲基甲酰胺中后，加入一定量的吡啶，攪拌反應(yīng)一段時(shí)間，再將過(guò)量的丙酮加入混合物中終止反應(yīng)，索氏提取以除去二甲基甲酰胺后，真空干燥得到殼寡糖席夫堿-O-曲酸衍生物；向制得的一定量的上述衍生物中添加0.25 mol/L的鹽酸與乙醇[V(鹽酸)/V(乙醇)= 1∶4]混合液，室溫?cái)嚢?2 h后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Na2CO3調(diào)節(jié)pH值至中性，用丙酮反復(fù)洗滌多次，抽濾、真空干燥；將干燥好的產(chǎn)品裝在透析袋中透析12 h，待濃縮到一定體積時(shí)，加入足量的丙酮沉淀，抽濾、真空干燥，最終得到經(jīng)純化的褐色的殼寡糖-O-曲酸聚合物(COS-O-KA)，具體制備路線、反應(yīng)條件、得率、取代度、分子質(zhì)量和多分散性指數(shù)如圖1和表1。

圖1 COS-O-KA的制備路線Fig.1 Reaction scheme for preparation of COS-O-KA

表1 COS-O-KA1-3的反應(yīng)條件、得率、取代度、分子質(zhì)量和多分散性指數(shù)

1.3.2合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

將原料殼寡糖和COS-O-KA樣品溶解在D2O中，以TMS為內(nèi)標(biāo)，用核磁共振波譜儀對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行1H核磁和13C核磁圖譜檢測(cè)。

1.3.3合成產(chǎn)物的水溶性測(cè)定

將5 g樣品，即原料殼寡糖、不同取代度的殼寡糖-O-曲酸聚合物(COS-O-KA1、COS-O-KA2和COS-O-KA3)分別溶解于100 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸中。在溶液中逐漸加入1 mol/L NaOH溶液。采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定溶液在600 nm處的透射率[25]。

1.3.4合成產(chǎn)物的體外溶血活性測(cè)定

以健康的昆明系雌性小鼠血液為作用對(duì)象，每管2 mL，輕輕搖晃采血管以防止血液凝結(jié)，在3 000 r/min下離心5 min，得到下層的血紅細(xì)胞和上層的血漿。配制一系列濃度梯度含有待測(cè)樣品的PBS溶液。用HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)溶液稀釋一定量的血紅細(xì)胞，離心5 min，移除上清液，重復(fù)洗滌兩次，補(bǔ)加一定量的HEPES溶液，使血紅細(xì)胞的最終體積分?jǐn)?shù)為3.3%。取90 μL配制好的血紅細(xì)胞溶液于無(wú)菌96孔板中，再在每孔中加入10 μL系列濃度梯度的待測(cè)樣品的PBS溶液，陰性對(duì)照組為HEPES溶液，陽(yáng)性對(duì)照組為體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100溶液，37 ℃ 100 r/min下孵育1 h、離心，采用酶標(biāo)儀在405 nm處檢測(cè)。利用式(1)計(jì)算溶血率。

H=[(A-A0)/(A100-A0)]×100%。

(1)

式(1)中：A為實(shí)驗(yàn)組吸光度值，A0為陰性對(duì)照組吸光度值，A100為陽(yáng)性對(duì)照組吸光度值。

1.3.5合成產(chǎn)物的體外生物相容性測(cè)定

采用MTT(噻唑藍(lán))法檢測(cè)經(jīng)樣品作用后人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率。將人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC CC-2571)加入96孔板中，加入不同濃度的待測(cè)樣品培養(yǎng)液，置于37 ℃的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁；棄去原培養(yǎng)基，加入不同濃度的待測(cè)樣品培養(yǎng)液，置于37 ℃的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h后，再加入一定量的 MTT 溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；去除培養(yǎng)液，加入一定量的DMSO，100 r/min振蕩5 min后用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)量吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率[26]。

1.3.6合成產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力測(cè)定

將待測(cè)樣品稀釋至不同濃度，分別取樣0.3 mL于試管中，再分別加入2.7 mL的DPPH甲醇溶液(60 μmol/L)，在室溫下避光反應(yīng)30 min，于518 nm 處測(cè)定溶液的吸光值[27]。維生素C(VC)溶液作為其抗氧化性的陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。DPPH自由基清除率計(jì)算方法見(jiàn)式(2)。

I=(A0-As)/A0×100%。

(2)

式(2)中：I為待測(cè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除率，%；A0為DPPH溶液加去離子水作為空白對(duì)照的吸光度值；As為樣品溶液與DPPH溶液進(jìn)行反應(yīng)后的吸光度值，并計(jì)算IC50值，IC50值越小，表示清除能力越強(qiáng)。

1.3.7合成產(chǎn)物的ABTS+自由基清除能力測(cè)定

圖2 COS和COS-O-KA的1H核磁圖譜Fig.2 1H NMR spectra of COS and COS-O-KA

分別配制濃度為7 mmol/L的ABTS溶液和濃度為2.5 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液，將二者等體積混合，在室溫下避光反應(yīng)16 h。取不同濃度梯度的待測(cè)樣品0.3 mL，加入試管中，分別再加入2.7 mL ABTS工作液輕輕振蕩，使其混合均勻，室溫避光反應(yīng)30 min，于735 nm處測(cè)定溶液的吸光度值。VC溶液作為其抗氧化性的陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。計(jì)算IC50值，IC50值越小，表示清除能力越強(qiáng)[28]，計(jì)算方法見(jiàn)式(3)。

I=(A0-As)/A0×100%，

(3)

式(3)中：I為待測(cè)樣品對(duì)ABTS+自由基的清除率，%；A0為ABTS溶液加去離子水作為空白對(duì)照的吸光度值；As為樣品溶液與ABTS溶液進(jìn)行反應(yīng)后的吸光度值。

1.3.8合成產(chǎn)物的動(dòng)物毒理性實(shí)驗(yàn)

參照Li等[29]的方法，通過(guò)小鼠尾靜脈注射制得的樣品溶液，以判斷抗氧化劑的急性毒性作用。以健康的昆明系雌性小鼠為作用對(duì)象，將小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)材料組和對(duì)照兩組，10只為一組。將抗氧化溶液按照不同的劑量組通過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，生理鹽水作為陰性對(duì)照, 控制兩組小鼠除對(duì)照條件以外，其余飼養(yǎng)條件均相同。觀察小鼠生物學(xué)反應(yīng)，注射后每2 d稱(chēng)量小鼠體重變化，并觀察一般狀態(tài)、 毒性表現(xiàn)及死亡情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較、顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果

殼寡糖和COS-O-KA的1H核磁圖譜見(jiàn)圖2。由圖2可知，殼寡糖的各個(gè)吸收峰的化學(xué)位移和歸屬如下：δ為1.98可歸屬為殼寡糖中未脫盡的乙?；系摹狢H3的化學(xué)位移，表明殼寡糖分子中還有少量未脫盡的乙?；?；δ為2.98可歸屬為氨基葡萄糖殘基上H2的化學(xué)位移；在δ為3.24～3.94處的多個(gè)重疊的化學(xué)位移可歸屬為氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖殘基和H3～H6的多個(gè)化學(xué)位移的重疊。δ為3.52可歸屬為乙酰氨基葡萄糖殘基上的H2的化學(xué)位移；δ為4.5和δ為4.92可歸屬為氨基葡萄糖殘基和乙酰氨基葡萄糖殘基上H1的化學(xué)位移；δ為4.7為溶劑峰。COS-O-KA的1H核磁圖譜與殼寡糖的相比，在δ為4.19、6.59、8.07處出現(xiàn)了3個(gè)新的化學(xué)位移，可分別歸屬為曲酸5-羥基吡喃酮基骨架上—CH2(H-7′)、H-3′和H-6′各質(zhì)子的化學(xué)位移，而δ為2.98處的氨基葡萄糖殘基上H2的化學(xué)位移仍然存在，此結(jié)果與紅外光譜的結(jié)果一致，這些新的化學(xué)位移證明曲酸中5-羥基吡喃酮與殼寡糖的羥基發(fā)生了氧烷基化。通過(guò)化學(xué)位移的歸屬，可以證明，氯代曲酸與殼寡糖希夫堿發(fā)生了氧烷基化反應(yīng)，COS-O-KA制備成功。

圖3 COS和COS-O-KA的13C核磁圖譜Fig.3 13C NMR spectra of COS and COS-O-KA

2.2 合成產(chǎn)物的溶解性及生物活性分析

2.2.1pH值對(duì)合成產(chǎn)物溶解性的影響

不同pH值對(duì)各個(gè)樣品溶解性的影響如圖4。由圖4可知，各個(gè)待測(cè)樣品在酸性條件下透光率基本接近，這說(shuō)明在酸性條件下各個(gè)樣品均具有良好的溶解性。隨著pH值不斷提高，在pH值為7以上時(shí)，待測(cè)樣品溶液的透光度逐漸減小，當(dāng)pH值超過(guò)7后，溶液開(kāi)始變得渾濁，這說(shuō)明樣品在堿性環(huán)境中的溶解性下降。與原料殼寡糖相比，當(dāng)pH值大于7時(shí)，COS-O-KA1-3樣品溶液的透光率下降緩慢，這說(shuō)明合成產(chǎn)物較原料殼寡糖有更好的水溶性，這可能是因?yàn)榻?jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾后，殼寡糖分子鏈的聚集態(tài)發(fā)生了改變，分子鏈之間的纏結(jié)程度與結(jié)晶度降低，從而削弱了分子鏈之間的相互作用，進(jìn)而提高了合成產(chǎn)物的水溶性。

圖4 殼寡糖和COS-O-KA的溶解性分析結(jié)果Fig.4 Solubility of COS and COS-O-KA

2.2.2體外溶血活性分析

圖5為原料殼寡糖、曲酸及合成產(chǎn)物COS-O-KA1-3的體外溶血活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖5可以看出，各個(gè)組隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，其溶血率均逐漸上升。但整體而言，相同濃度下，合成產(chǎn)物COS-O-KA1-3的溶血率均低于殼寡糖和曲酸。例如，在質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)，COS-O-KA1-3的溶血率小于20%，而相同質(zhì)量濃度的殼寡糖和曲酸的溶血活性則大于30%；在質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)，COS-O-KA1-3的溶血率小于35%，相同質(zhì)量濃度的殼寡糖和曲酸的溶血率則大于50%。同時(shí)，隨著取代度的增加，合成產(chǎn)物的溶血率也逐漸增加。因此，與殼寡糖相比，在其分子鏈中引入曲酸后，獲得的合成產(chǎn)物表現(xiàn)出較好的非溶血活性，該結(jié)果表明，COS-O-KA對(duì)人紅細(xì)胞具有較高的選擇性[30]。

圖5 不同質(zhì)量濃度的殼寡糖、曲酸和COS-O-KA的體外溶血活性分析結(jié)果Fig.5 Results of hemolytic activity analysis in vitro of COS, KA, and COS-O-KA at different concentrations

2.2.3體外生物相容性分析

圖6為殼寡糖、曲酸和COS-O-KA的體外生物相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從圖6(a)、圖6(b)可以看出，HASMC細(xì)胞經(jīng)不同濃度梯度的殼寡糖、曲酸和COS-O-KA1-3作用之后，其細(xì)胞存活率基本沒(méi)有下降；而對(duì)于經(jīng)一定質(zhì)量濃度的殼寡糖、曲酸和COS-O-KA1-3分別作用1、2、4、6 d后，MTT的吸光度隨時(shí)間增加，這說(shuō)明在15 mg/mL質(zhì)量濃度的合成產(chǎn)物作用下，細(xì)胞仍可繼續(xù)增殖，COS-O-KA1-3具有良好的體外生物相容性。

*表示差異顯著(P<0.05)。圖6 殼寡糖、曲酸和COS-O-KA的體外生物相容性分析結(jié)果Fig.6 Results of biocompatibility analysis in vitro of COS, KA, and COS-O-KA

2.3 合成產(chǎn)物的抗氧化活性分析

2.3.1DPPH自由基清除能力分析

圖7 殼寡糖、曲酸和COS-O-KA的DPPH自由基清除能力分析結(jié)果Fig.7 Results of DPPH free radical scavenging ability analy-sis of COS, KA, and COS-O-KA

所有檢測(cè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力分析結(jié)果如圖7。由圖7可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，所有樣品對(duì)DPPH自由基均具有清除能力。當(dāng)樣品的質(zhì)量濃度低于2.5 mg/mL時(shí)，其清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增大而增大；在樣品質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，殼寡糖、曲酸、COS-O-KA1、COS-O-KA2和COS-O-KA3對(duì)DPPH自由基的清除率分別為52.28%、59.33%、85.21%、87.35%和82.83%，經(jīng)計(jì)算，其所對(duì)應(yīng)的IC50值分別為2.17、1.42、0.52、0.33、0.71 mg/mL，其中Vc的IC50值為0.47 mg/mL。根據(jù)IC50值可知，COS-O-KA2具有強(qiáng)于VC的DPPH自由基清除能力，其他兩種衍生物的清除能力和Vc的接近。COS-O-KA1-3較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力可能與其結(jié)構(gòu)中存在活性胺和5-羥基吡喃酮基團(tuán)有關(guān)，其中聚合物COS-O-KA2具有最強(qiáng)的清除能力。COS-O-KA因含酚羥基、活性羥基和活性氨基，所以其體現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力[31]。

2.3.2ABTS+自由基清除能力分析

殼寡糖、曲酸和COS-O-KA1-3對(duì)ABTS+自由基的清除能力分析結(jié)果如圖8。由圖8可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各個(gè)樣品對(duì)ABTS+自由基都具有一定的清除能力，且其清除率與樣品的濃度之間存在量效關(guān)系。各樣品對(duì)ABTS+自由基清除能力具有相似的趨勢(shì)，即隨著濃度的增加而緩慢增加。值得注意的是，合成產(chǎn)物COS-O-KA1-3對(duì)ABTS+自由基的清除率緩慢升高，在2.0 mg/mL時(shí)達(dá)到穩(wěn)定水平(83.87%、85.76%、82.33%)，遠(yuǎn)高于殼寡糖(39.65%)和曲酸(46.54%)。經(jīng)計(jì)算，IC50值按照殼寡糖、曲酸、COS-O-KA1、COS-O-KA2、COS-O-KA3和Vc所對(duì)應(yīng)的順序，分別為2.47、1.37、0.51、0.45、0.66、0.47 mg/mL，因此，根據(jù) IC50值可知，與DDPH自由基清除能力相比，同樣COS-O-KA2具最低的IC50值，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力。這可能與COS-O-KA聚合物中的酚羥基、活性羥基和活性氨基的作用有關(guān)。

圖8 殼寡糖、曲酸和COS-O-KA的ABTS+自由基清除能力分析結(jié)果Fig.8 Results of ABTS+ free radical scavenging ability analysis of COS, KA, and COS-O-KA

2.4 動(dòng)物毒理性分析

對(duì)小鼠尾靜脈注射COS-O-KA1-3進(jìn)行動(dòng)物研究，其中一組為對(duì)照組，三組為給藥組(COS-O-KA1-3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6、18、25 mg/kg)。每組小鼠體重變化情況見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，給藥7 d后，即使是注射最高劑量25 mg/kg的合成產(chǎn)物，小鼠也沒(méi)有出現(xiàn)任何臨床癥狀。與對(duì)照組一樣，每組小鼠的體重都是逐漸增加的，肉眼觀察沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何疾病和死亡情況。因此，動(dòng)物毒理性實(shí)驗(yàn)可以初步證明COS-O-KA1-3的安全性。

表2 每組小鼠體重變化

3 結(jié) 論

以具有良好生物活性的殼寡糖和曲酸為合成起始物，將曲酸基團(tuán)引入到殼寡糖的分子鏈中，通過(guò)接枝反應(yīng)，制備獲得一種新的殼寡糖-O-曲酸聚合物(COS-O-KA)。在對(duì)COS-O-KA結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征的基礎(chǔ)上，對(duì)其分子質(zhì)量、多分散性指數(shù)、水溶性、體外溶血活性、體外生物相容性、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和動(dòng)物毒理性等方面進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，將曲酸基團(tuán)引入到殼寡糖分子鏈中后，制備得到了殼寡糖-O-曲酸聚合物。1H核磁和13C核磁圖譜檢測(cè)結(jié)果表明，成功合成出了3個(gè)不同取代度的殼寡糖接枝曲酸聚合物(COS-O-KA1、COS-O-KA2、COS-O-KA3)。COS-O-KA表現(xiàn)出比原料殼寡糖和曲酸更好的水溶性、體外溶血活性、體外生物相容性、DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力，同時(shí)動(dòng)物毒理性也初步表明其安全無(wú)毒。COS-O-KA有望被作為一種有前途的抗氧化材料。