沈 欣， 趙夢(mèng)瑤， 邱勇雋， 夏泉鳴， 趙黎明

(華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院， 上海 200237)

殼寡糖(chitooligosaccharide，COS)主要是由海洋蝦、蟹殼中提取出的天然氨基多糖(殼聚糖和幾丁質(zhì))水解制得，是由D-氨基葡萄糖(或少量N-乙酰-D-氨基葡萄糖)通過(guò)β-1，4-糖苷鍵連接而成的一種低聚糖(及其鹽)，聚合度 (degree of polymerization，DP) 一般分布在2～10。殼寡糖具有許多健康益處，例如抗菌[1-2]、改善糖尿病[3]、增強(qiáng)免疫力[4]、抗高血壓[5]和抗腫瘤[6]等等。研究還發(fā)現(xiàn)，殼寡糖及其衍生物可以顯著降低體重，調(diào)節(jié)血脂水平[7]，可作為膳食補(bǔ)充劑用于改善肥胖和血脂異常。

目前，非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)發(fā)病率較高，與多種代謝綜合征密切相關(guān)[8-9]。研究顯示，NAFLD的特征是肝內(nèi)甘油三酯含量的過(guò)度增加[10]，因此參與甘油三酯代謝的一些基因在其病理發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，其中分化簇36(CD36)是一種重要的跨膜蛋白，參與促進(jìn)極低密度脂蛋白和長(zhǎng)鏈游離脂肪酸的吸收[11-13]。早期研究表明，CD36是肝X受體α(LXRα)、孕烯醇酮 X受體(PXR)和過(guò)氧化物酶體增殖物受體γ(PPARγ)協(xié)調(diào)參與脂肪酸吸收的共同靶標(biāo)[14]。此外，二?；视王；D(zhuǎn)移酶 2(DGAT2)是通過(guò)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上將二?；视秃鸵阴］o酶A轉(zhuǎn)化為甘油三酯的關(guān)鍵限速酶[15]。缺乏DGAT2的小鼠肝臟中甘油三酯含量降低了近90%，在血漿中降低了64%[16]，表明DGAT2在甘油三酯合成途徑中具有重要的作用。

研究表明，不同分子量(1 000 Da和3 000 Da)的殼寡糖可以減少油酸誘導(dǎo)的NAFLD模型中脂質(zhì)的積累[17]；并且通過(guò)對(duì)殼寡糖混糖及單一聚合度2～6的殼寡糖進(jìn)行降脂活性篩選，發(fā)現(xiàn)低聚合度的殼寡糖降脂效果優(yōu)于殼寡糖混糖[18]，但是目前殼寡糖改善非酒精性脂肪肝病的潛在保護(hù)機(jī)制方面的研究還不夠完善。因此，本研究擬通過(guò)對(duì)脂肪酸吸收和甘油三酯合成通路的相關(guān)基因和蛋白進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)一步探究殼寡糖的體外降脂活性和潛在的作用機(jī)制，希望為將殼寡糖進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成具有降脂護(hù)肝效果的膳食補(bǔ)充劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2人肝癌細(xì)胞株，購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)；殼寡糖(COS，脫乙酰度≥95%)，由華東理工大學(xué)發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心自制；DMEM (dulbecco’s modified eagle’s medium)高糖培養(yǎng)基、PBS(phosphate buffer saline) (pH值7.4)、PS (penicillin-streptomycin solution) (雙抗)和抗熒光淬滅封片劑，生工生物工程(上海)股份有限公司；BSA(albumin bovine V)牛血清白蛋白 (不含脂肪酸) ，北京索萊寶科技有限公司；油紅O(Oil Red O)和MTT(噻唑藍(lán)) ，美國(guó)Sigma公司；甘油三酯、總膽固醇、高低密度脂蛋白膽固醇及游離脂肪酸檢測(cè)試劑盒，南京建成科技有限公司；CD36、PPARγ、PXR和LXRα抗體，美國(guó)Protein tech公司；DGAT2抗體，美國(guó)Affinity公司。引物序列由生工生物工程有限公司合成：

CD36:Forward：5′-GAGAACTGTTATGGGGCTAT-3′; Reverse:5′-TTCAACTGGAGAGGCAAAGG-3′

DGAT2:Forward：5′-CGAAAGCCACTTCTCATACA-3′; Reverse:5′-TGCCTACTACTGCCCTCAC -3′

PPARγ:Forward：5′-TTGCAGTGGGGATGTCTCAT-3′; Reverse:5′-TTTCCTGTCAAGATCGCCCT -3′

LXRα:Forward：5′-GATCGAGGTGATGCTTCTGGAG-3′;Reverse:5′-CCCTGCTTTGGCAAAGTCTTC-3′

PXR:Forward：5′-GGCCACTGGCTATCACTTCAA-3′;Reverse:5′-TTCATGGCCCTCCTGAAAA-3′

18S RNA:Forward：5′-CGGCTACCACATCCAAGGAAG-3′;Reverse:5′-AGCTGGAATTACCGCGGCT-3′

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy HT型酶標(biāo)檢測(cè)儀，美國(guó)BioTeK公司；5427 R型高速低溫離心機(jī)，Eppendorf中國(guó)有限公司；Ti-U型倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；CFX96型qPCR儀、170-4481型電泳儀、Tanon4200型成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；1379型生物安全柜，美國(guó)Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)和處理

HepG2細(xì)胞選用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的高糖培養(yǎng)基(DMEM)，在37 ℃和體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

將油酸鈉溶于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的BSA牛血清白蛋白的高糖培養(yǎng)基中，配制成終濃度為含0.2 mmol/L油酸鈉培養(yǎng)基。將細(xì)胞鋪板在96孔/24孔/6孔板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行分組處理：將含1% BSA牛血清白蛋白的高糖培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組；將含有0.2 mmol/L的油酸鈉-BSA的高糖培養(yǎng)基作為模型組；將不同劑量殼寡糖與油酸鈉-BSA的高糖培養(yǎng)基同時(shí)處理作為共同處理組。

1.3.2細(xì)胞存活率測(cè)定

通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。將HepG2細(xì)胞與10 μL 5 mg/mL的MTT在37 ℃孵育4 h，除去溶液后，每孔加入150 μL的二甲基亞砜，使用酶標(biāo)儀在490 nm下測(cè)量吸光度。細(xì)胞存活率計(jì)算方法見(jiàn)式(1)。

細(xì)胞存活率=
(OD樣品-OD調(diào)零)/(OD空白-OD調(diào)零)×100%。

(1)

式(1)中，OD樣品表示樣品組吸光度；OD調(diào)零表示調(diào)零組吸光度；OD空白表示空白組吸光度。

1.3.3油紅O染色

將HepG2細(xì)胞以105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在24孔板中培養(yǎng)24 h后，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，并在室溫下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定30 min。除去多聚甲醛后，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，然后每孔加0.5 mL油紅O溶液染色，20 min后用PBS洗滌兩次，并在熒光顯微鏡下觀察拍照。每孔加200 μL異丙醇萃取油紅O染料10 min，并通過(guò)酶標(biāo)儀在510 nm下測(cè)量吸光度。

1.3.4細(xì)胞脂質(zhì)水平的測(cè)定

將HepG2細(xì)胞按1.3.1中條件處理24 h后，收集細(xì)胞并用預(yù)冷的PBS洗滌兩次。添加200 μL 2%Triton X-100到每個(gè)孔中，并通過(guò)超聲破碎細(xì)胞。通過(guò)BCA(bicinchonininc acid)法蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，使用甘油三酯、總膽固醇、高低密度脂肪酸膽固醇和游離脂肪酸試劑盒分別測(cè)定相應(yīng)濃度。

1.3.5mRNA定量

各組細(xì)胞經(jīng)1.3.1中條件處理24 h后，收集細(xì)胞提取總RNA，檢驗(yàn)合格后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA，使用AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)mRNA進(jìn)行定量。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算mRNA的相對(duì)量，計(jì)算公式見(jiàn)式(2)。

ΔCT=ΔCT(試驗(yàn)樣品)-ΔCT(基準(zhǔn)樣品)；
ΔCT(試驗(yàn)樣品)=CT(試驗(yàn)樣品、目的基因)-
CT(試驗(yàn)樣品、內(nèi)參基因)；
ΔCT(基準(zhǔn)樣品)=CT(基準(zhǔn)樣品、目的基因)-
CT(基準(zhǔn)樣品、內(nèi)參基因)。

(2)

式(2)中，CT值是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.3.6蛋白質(zhì)含量測(cè)定

各組細(xì)胞經(jīng)1.3.1中條件處理24 h后，收集細(xì)胞提取總蛋白，使用BCA法蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。制備好的蛋白樣品經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)膜，在室溫下，將膜放在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶的TBST(tris buffered saline Tween)溶液中封閉1 h，然后置于一抗(CD36、DGAT2、LXRα、PXR、PPARγ)中孵育過(guò)夜(4 ℃)。用TBST洗膜3次，將膜放入二抗中，在室溫下孵育1 h。通過(guò)化學(xué)發(fā)光ECL(enhanced chemiluminescence)方法分析并用Tanon 4200成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。采用SPSS軟件通過(guò)單因素方差分析和Duncan多重比較分析實(shí)驗(yàn)組之間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并用不同的字母表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性分析

通過(guò)MTT法測(cè)定了不同質(zhì)量濃度殼寡糖(0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，與對(duì)照組相比，較高質(zhì)量濃度(>4.0 mg/mL)殼寡糖處理組中HepG2細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。因此，本研究選擇質(zhì)量濃度小于等于4.0 mg/mL的殼寡糖用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 殼寡糖與油酸鈉共處理對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of co-incubation of COS and sodium oleate on cytotoxicity in HepG2 cells

2.2 殼寡糖對(duì)HepG2細(xì)胞模型脂質(zhì)積累的影響

選用不同質(zhì)量濃度(0.1、0.5、1.0、4.0 mg/mL)殼寡糖與油酸鈉共同處理HepG2細(xì)胞24 h，通過(guò)油紅O染色測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)總脂質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，與模型組相比，不同質(zhì)量濃度的殼寡糖顯著降低了胞內(nèi)總脂質(zhì)積累量，并在一定質(zhì)量濃度范圍呈現(xiàn)劑量依賴。因?yàn)?.1 mg/mL與0.5 mg/mL 殼寡糖處理組之間脂積累量未出現(xiàn)顯著性差異，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用0.5、1.0、4.0 mg/mL三個(gè)作用效果較優(yōu)的質(zhì)量濃度。

A:空白組；B:油酸鈉組；C:油酸鈉與0.1 mg/mL殼寡糖組；D:油酸鈉與0.5 mg/mL殼寡糖組；E:油酸鈉與1.0 mg/mL殼寡糖組；F:油酸鈉與4.0 mg/mL殼寡糖組。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2 不同劑量殼寡糖對(duì)NAFLD細(xì)胞模型內(nèi)總脂質(zhì)積累的影響Fig.2 Effects of COS on cellular lipid accumulation in NAFLD cell model

對(duì)各組細(xì)胞胞內(nèi)脂質(zhì)生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以發(fā)現(xiàn)，油酸鈉組細(xì)胞胞內(nèi)甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和游離脂肪酸的含量與空白對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)，證明NAFLD細(xì)胞模型構(gòu)建成功。不同質(zhì)量濃度殼寡糖處理組細(xì)胞胞內(nèi)甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和游離脂肪酸的含量顯著下降，呈現(xiàn)劑量依賴；其中4.0 mg/mL的殼寡糖處理組甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和游離脂肪酸的含量分別下降了22%、41%和76%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同質(zhì)量濃度殼寡糖的處理對(duì)胞內(nèi)總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇的水平無(wú)顯著性影響，推測(cè)殼寡糖可能介導(dǎo)了甘油三酯合成及脂肪酸吸收通路相關(guān)基因的表達(dá)，從而達(dá)到降脂效果。

A:空白組；B:油酸鈉組；C:油酸鈉與0.1 mg/mL殼寡糖組；D:油酸鈉與1.0 mg/mL殼寡糖組；E:油酸鈉與4.0 mg/mL殼寡糖組。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 不同劑量殼寡糖對(duì)NAFLD細(xì)胞模型內(nèi)各脂質(zhì)生化指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of COS on biochemistry level of lipid profiles in NAFLD cell model

2.3 殼寡糖對(duì)脂肪酸吸收和甘油三酯合成途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響

進(jìn)一步探究殼寡糖對(duì)改善脂肪變性和脂質(zhì)積累的可能性機(jī)制，通過(guò)qPCR法測(cè)定了甘油三酯合成和脂肪酸吸收通路的相關(guān)基因表達(dá)量，選用1.0、4.0 mg/mL的殼寡糖處理NAFLD細(xì)胞模型，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，殼寡糖處理可以顯著抑制油酸鈉誘導(dǎo)的DGAT2、LXRα、PPARγ、CD36和PXR的mRNA表達(dá)水平上升，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些結(jié)果表明，殼寡糖可以通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)甘油三酯合成和脂肪酸吸收通路從而起到改善油酸鈉誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂變性。

A:空白組；B:油酸鈉組；C:油酸鈉與1.0 mg/mL殼寡糖組；D:油酸鈉與4.0 mg/mL殼寡糖組。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4 殼寡糖對(duì)NAFLD細(xì)胞模型內(nèi)質(zhì)脂代謝相關(guān)基因的影響Fig.4 Effects of COS on lipid metabolism-related genes in NAFLD cell model

2.4 殼寡糖對(duì)脂肪酸吸收和甘油三酯合成途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步證實(shí)殼寡糖對(duì)甘油三酯合成和脂肪酸吸收途徑的抑制作用，通過(guò)Western blot 檢測(cè)了不同處理組中DGAT2、LXRα、PPARγ、CD36和PXR的蛋白相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，油酸鈉組中CD36、DGAT2、LXRα、PXR和PPARγ的蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，分別達(dá)到了對(duì)照組的1.5、4.3、2.4、5.6、1.3倍，而殼寡糖處理則顯著抑制了其蛋白相對(duì)表達(dá)量的增長(zhǎng)趨勢(shì)。該結(jié)果與其mRNA表達(dá)趨勢(shì)相似，表明殼寡糖可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平上調(diào)節(jié)甘油三酯合成和脂肪酸吸收通路。

A:空白組；B:油酸鈉組；C:油酸鈉與1.0 mg/mL殼寡糖組；D:油酸鈉與4.0 mg/mL殼寡糖組。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5 殼寡糖對(duì)NAFLD細(xì)胞模型內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的影響Fig.5 Effects of COS on proteins expression related to lipid metabolism in NAFLD cell model

3 結(jié) 論

殼寡糖因具有多種生物活性而被廣泛研究，而非酒精性脂肪肝病目前作為全球常見(jiàn)的慢性疾病[19]并無(wú)相關(guān)的臨床特效藥物。利用殼寡糖的降脂活性，將其開(kāi)發(fā)成為具有改善非酒精性脂肪肝病的膳食補(bǔ)充劑具有重要的意義。CD36作為長(zhǎng)鏈脂肪酸的膜受體，參與脂質(zhì)代謝的多個(gè)過(guò)程，包括脂質(zhì)攝入，脂蛋白的產(chǎn)生和運(yùn)輸、儲(chǔ)存和分解[20]。早期研究表明，高脂飲食會(huì)顯著提高肝臟中CD36的蛋白表達(dá)水平，并顯著增加肝臟中甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的含量[21-22]。在本研究中，殼寡糖處理可以顯著降低胞內(nèi)游離脂肪酸、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的含量，在一定處理質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴，該過(guò)程伴隨著CD36基因和蛋白表達(dá)的顯著降低。這與早期研究報(bào)道小鼠脂肪變性的改善伴隨著肝CD36表達(dá)的下調(diào)[23-24]結(jié)果相一致。同時(shí)，殼寡糖處理可顯著降低LXRα、PXR和PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)水平，由此推測(cè)殼寡糖可以通過(guò)調(diào)節(jié)CD36介導(dǎo)的脂肪酸吸收通路來(lái)逆轉(zhuǎn)肝脂肪變性。另有研究顯示，DGAT2表達(dá)量的輕微增加可能會(huì)顯著增加肝臟中甘油三酯的含量[25]，而DGAT2抑制劑可以抑制肝臟中DGAT2的表達(dá)從而抑制肝臟脂肪變性[26]。在本研究中，殼寡糖處理顯著下調(diào)DGAT2的基因和蛋白表達(dá)，這有助于抑制肝臟中甘油三酯的合成從而改善脂質(zhì)積累。

研究了殼寡糖對(duì)油酸鈉誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)積累的影響，殼寡糖表現(xiàn)出有效的降肝脂作用，通過(guò)抑制DGAT2、LXRα、PPARγ、CD36和PXR的表達(dá)來(lái)抑制脂肪酸的吸收和甘油三酯的合成，從而改善肝脂肪變性。希望本研究結(jié)果可為將殼寡糖作為降脂護(hù)肝功能的膳食補(bǔ)充劑原料提供理論參考。