張靜 陳紅蓮 鮑俊杰 汪翔 王永杰

摘要：水產(chǎn)養(yǎng)殖密度的增加，加大了疾病暴發(fā)的風險。嗜水氣單胞菌感染的宿主多種多樣，毒力因子復(fù)雜，為疾病的治療和防控帶來困難。目前水產(chǎn)上對嗜水氣單胞菌的防控主要依賴抗生素、化學(xué)藥物等，容易導(dǎo)致環(huán)境中藥物殘留、病原菌耐藥性增加等問題。本文著重對水產(chǎn)養(yǎng)殖中嗜水氣單胞菌及其拮抗菌的體外篩選方法、拮抗作用研究方法和拮抗機制（產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、競爭性黏附、群體感應(yīng)猝滅、競爭營養(yǎng)物質(zhì)、增強機體免疫功能和抗氧化功能）進行重點歸納闡述，并對拮抗菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用和安全性方面的相關(guān)研究進行概述，旨在為嗜水氣單胞菌拮抗菌的研發(fā)以及水產(chǎn)動物的疾病防控研究提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：拮抗菌;嗜水氣單胞菌;拮抗機制;疾病防控;水產(chǎn)養(yǎng)殖

中圖分類號： S941.4 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0021-12

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）隸屬氣單胞菌科（Aermonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），該菌呈世界性分布，廣泛分布于水體環(huán)境，主要出現(xiàn)在淡水、海洋，特別是河口環(huán)境的水生環(huán)境，是引起魚類運動性氣單胞菌敗血癥（motile Aeromonas septicemia，MAS）的主要病原體，同時也是兩棲類、爬行類以及哺乳類動物的重要病原體，是我國流行最廣泛的一種典型人-畜-水生動物共患的病原菌。20世紀80年代以來，我國南方各省份淡水養(yǎng)殖魚類流行暴發(fā)性傳染病，很多報道系為嗜水氣單胞菌所致敗血癥[1-4]。2009年MAS的暴發(fā)也發(fā)生在美國東南部，造成斑點叉尾的全行業(yè)虧損[5-6]。MSA已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的一個日益突出的問題。

水產(chǎn)養(yǎng)殖密度的增加加大了疾病暴發(fā)的風險，使之成為水產(chǎn)品生產(chǎn)和貿(mào)易的重大制約性因素，不僅因為疾病暴發(fā)加大了水產(chǎn)養(yǎng)殖的風險，同時養(yǎng)殖商品藥物殘留問題還制約著對內(nèi)對外貿(mào)易，嚴重影響國家水產(chǎn)行業(yè)經(jīng)濟發(fā)展。與藥物控制相比，益生菌憑借其無毒高效的優(yōu)點，正受到國內(nèi)外學(xué)者越來越多的關(guān)注[4]。世界糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）將益生菌定義為“當以足夠量施用時可以賦予宿主健康益處的活性微生物”。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中施用益生菌的好處包括增強魚類生長、控制疾病、改善免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)水環(huán)境[7-12]。拮抗作用是細菌或其他微生物相互作用的方式之一，是指一種微生物在生長過程中通過某種代謝產(chǎn)物或改變生活環(huán)境來抑制其他微生物的生長發(fā)育，甚至殺死它們的現(xiàn)象。利用拮抗性能強的菌株抑制病原菌的生長、繁殖或致病性是生物防治的手段之一[13]。疾病的重點管理應(yīng)該是預(yù)防，拮抗菌更重要的功能作為抑制病原菌的生物控制劑，會減少對化學(xué)品（抗生素、消毒劑等）的使用和依賴，很可能比治療更具經(jīng)濟效益[14]。本研究著重通過對水產(chǎn)養(yǎng)殖中嗜水氣單胞菌及其拮抗菌的體外篩選方法、拮抗作用研究方法和拮抗機制進行重點歸納闡述，并對拮抗菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用和安全性方面相關(guān)研究及其發(fā)展趨勢進行了概述，旨在為嗜水氣單胞菌拮抗菌的研發(fā)以及水產(chǎn)動物的疾病防控研究提供參考依據(jù)。

1 介紹

1.1 嗜水氣單胞菌流行情況

嗜水氣單胞菌感染淡水魚類引起暴發(fā)性出血病，死亡率極高，主要癥狀表現(xiàn)為頭部、鰭條、腹部等部位充血，嚴重的眼球突出，在水面上漫游，無食欲，不久即死亡。嗜水氣單胞菌的分離鑒定試驗也證實在患病魚體內(nèi)鰓、肝、腎、腸等部位及養(yǎng)殖水環(huán)境均能檢測到該菌，因此引起了國內(nèi)外學(xué)者對該菌的高度關(guān)注[1，3]。

有研究者對我國華東、豫北、南方等地區(qū)嗜水氣單胞菌進行了流行病學(xué)調(diào)查。2016—2017年，金承玲等在江蘇省主要養(yǎng)殖品種草魚、鯽魚、鰱魚、甲魚、斑點叉尾品種中均有檢出嗜水氣單胞菌，發(fā)現(xiàn)25 ℃以上由其引起的細菌性疾病的發(fā)病率為73%，發(fā)病后病死率為5%～60%，平均病死率為20%～30%[15]。2011年，王春瑞等對華東地區(qū)的嗜水氣單胞菌流行情況進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)浙江省、安徽省、江蘇省均有嗜水氣單胞菌分布，危害魚類包括鯉科魚類的常見品種如團頭魴、鯽魚、鰱魚等，相關(guān)疾病于6月份開始出現(xiàn)且隨水溫的升高有逐漸加重的趨勢，7—9月為發(fā)病高峰期，對鯉科魚類中團頭魴的危害最為嚴重，其次是鯽魚、鰱鳙魚、草魚，而相鄰池塘或同池塘的非鯉科魚類則基本不發(fā)病[16]。2009—2010年，賀文旭等對豫北地區(qū)嗜水氣單胞菌引起的細菌性敗血病進行流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖場感染的魚類主要為鰱魚、鯽魚、草魚、麥穗魚和鯉魚等，致病性嗜水氣單胞菌在這些魚中的分離率分別為43.8%、28.1%、12.5%、12.5%和3.1%[17]。張德鋒等調(diào)查了南方地區(qū)魚源氣單胞菌不同種類的流行特征，發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌也是我國南方地區(qū)魚類氣單胞菌敗血癥的主要流行菌株之一，可以和維氏氣單胞菌混合感染，雖然其遺傳多樣性不如維氏氣單胞菌，但在常見水生動物中嗜水氣單胞菌的致病性比維氏氣單胞菌強，其毒力基因也比維氏氣單胞菌多，常見感染宿主為鯽魚、鳙魚、鳊魚和鰱魚等鯉科魚類，仍然是疾病防控的重點對象[18]。2009年美國阿拉巴馬州西部鯰魚養(yǎng)殖區(qū)暴發(fā)了由致病性嗜水氣單胞菌引起的MAS[6]，之后疫情蔓延到相鄰的密西西比州和阿肯色州。MAS暴發(fā)導(dǎo)致美國東南部超過1 000萬磅的鯰魚死亡，產(chǎn)業(yè)損失超過約1 200萬美元[5-6]。Hossain等比較了中國患病草魚和美國鲇魚分離出的嗜水氣單胞菌株，發(fā)現(xiàn)它們具有高度相似的基因組，且嗜水氣單胞菌美國鲇魚分離株對斑點叉尾和草魚的毒力顯著高于中國草魚分離株[6]。

上述調(diào)查研究顯示，我國嗜水氣單胞菌的常見感染宿主為鯉科魚類，美國主要養(yǎng)殖品種斑點叉尾也是致病性嗜水氣單胞菌感染的主要對象。鯉科魚類是我國淡水養(yǎng)殖的主要品種，2017年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒顯示，我國主要鯉科魚類養(yǎng)殖總產(chǎn)量超過2 000萬t，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)規(guī)模巨大。由于嗜水氣單胞菌感染宿主多樣，毒力因子復(fù)雜，血清型眾多，達96個[16]，為嗜水氣單胞菌引起疾病的治療和防控帶來困難。目前水產(chǎn)上對嗜水氣單胞菌的防控主要依賴抗生素、化學(xué)藥物等，雖然在短期內(nèi)能起到一定的效果，但容易導(dǎo)致環(huán)境中藥物殘留、病原菌耐藥性增加等問題[19-20]，給人們帶來長期的困擾。有針對性地篩選開發(fā)不同的嗜水氣單胞菌拮抗菌是一種安全、環(huán)保、可靠的途徑。

1.2 拮抗菌種類和篩選來源

益生菌對病原菌的抑制作用最早出現(xiàn)在人類和農(nóng)業(yè)的應(yīng)用中，熒光假單胞菌對植物根部病原菌的抑制作用已得到詳細驗證。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，早在1980年益生菌就被發(fā)現(xiàn)既可用作食物，也可作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚類疾病的生物防治劑和營養(yǎng)物質(zhì)再生的激活劑[21]。拮抗菌由于具有拮抗病原菌、調(diào)節(jié)機體正常生理功能、改善養(yǎng)殖環(huán)境、無抗藥性等優(yōu)點，是進一步研究水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病控制的主要領(lǐng)域，將有助于減少水產(chǎn)養(yǎng)殖中的化學(xué)和藥物使用，使水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品更容易被消費者所接受[22-23]。應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的具有病原拮抗作用的有益微生物，包括一些革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌以及部分非細菌類微生物。近年來水產(chǎn)界也加強了對拮抗菌的研究力度，針對各種水產(chǎn)動物病原菌都相繼篩選出具有拮抗作用的微生物。已發(fā)現(xiàn)包括細菌、真菌、放線菌、微藻在內(nèi)的多種微生物，研究較多的為芽孢桿菌、乳桿菌、酵母菌等。芽孢桿菌種類繁多，迄今為止在芽孢桿菌中僅枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等一些菌種被證實具有拮抗病原菌的活性，與抗菌活性物質(zhì)合成有關(guān)的基因至少達到55種，能夠分泌多種低分子量的抗菌肽和細菌素類等抗菌活性物質(zhì)，并具有刺激宿主免疫應(yīng)答功能，同時具有耐熱、耐極端環(huán)境、易保存等特性，因此芽孢桿菌是作為水產(chǎn)飼料添加劑的首選拮抗菌[24]。放線菌中的鏈霉菌也被發(fā)現(xiàn)對病原菌有抑制效果，李夢茜等分離的鏈霉菌LFJK-11發(fā)酵液對引起羅非魚敗血癥的嗜水氣單胞菌HCLF-2有較強的抑制作用[25]。真菌通常通過發(fā)酵產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物達到抑菌目的，包括萜類化合物、酚類和氮化物等。Zhao等利用南極真菌B-7發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物可以直接抑制細菌[26]。郭雷等從近岸海域沉積物中分離出能夠分泌抗菌活性代謝產(chǎn)物的黃柄曲霉（Aspergillus flavipes HN4-13），其發(fā)酵液抑菌活性在9 d時達到最大，對鰻弧菌和嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑分別為15.65、12.75 mm[27]。酵母菌是目前用于抑制這些水生病原菌的主要真菌，其提取物如釀酒酵母中的β-葡聚糖具有協(xié)同抑制和免疫作用[28]，如來自印度Himedia公司的酵母提取物用于Labeo rohita可提高宿主免疫力和對嗜水氣單胞菌的抵抗力[29]。

拮抗菌主要獲得途徑為魚類腸道、周邊水環(huán)境、海洋微生物和極端環(huán)境微生物等。它的來源在拮抗菌的篩選和應(yīng)用上是一個非常重要的環(huán)節(jié)，直接影響到拮抗菌的實際應(yīng)用效果。拮抗菌能夠在宿主腸道中定植，這是其發(fā)揮拮抗作用的前提。所以來源于宿主本身的拮抗菌不論在安全性還是在作用效果上都遠遠優(yōu)于從異種和其他環(huán)境中篩選得到的拮抗菌，而且有些不合適的拮抗菌進入宿主腸道中可能會對宿主腸道造成意想不到的傷害。海洋微生物因其數(shù)量龐大和其特殊的生活環(huán)境、生態(tài)系統(tǒng)使其代謝產(chǎn)物具有很多意想不到的生物活性，也是目前熱門的篩選來源。

2 拮抗菌體外篩選方法

細菌拮抗是自然界的常見現(xiàn)象，篩選候選拮抗菌的常用方法是進行體外拮抗試驗，將體外拮抗試驗作為篩選的第一步有其重要意義。體外抑菌試驗主要采用的傳統(tǒng)方法有固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法，紙片擴散法和菌落重疊法為固體平板篩選方法，在初步批量篩選有抑制性微生物上使用最為廣泛，而上清液提取培養(yǎng)法和菌株共培養(yǎng)液體培養(yǎng)方法適用于進一步篩選驗證。固體平板篩選法可以初步確定拮抗菌對病原菌的抑制效果，其中使用最為廣泛的為紙片擴散法。Olsson等比較了上述2種固體平板篩選方法，發(fā)現(xiàn)紙片擴散法數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性一般較低，而使用菌落重疊法在3次抑菌重復(fù)試驗中沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異[30]。通過拮抗菌和病原菌、拮抗菌發(fā)酵液與病原菌液體共培養(yǎng)試驗也可以推斷菌株拮抗的作用方式。例如，F(xiàn)uente等研究發(fā)現(xiàn)，在菌株共培養(yǎng)測定中，拮抗菌的抑菌活性比其無細胞上清液共培養(yǎng)時的抑菌活性更高，經(jīng)試驗推斷是因為可產(chǎn)鐵載體有抑菌活性的菌株由于鐵載體附著在細胞膜上而不會脫落到上清液中[31]。Ren等將枯草芽孢桿菌CH9與嗜水氣單胞菌SC2005共培養(yǎng)6 h后，SC2005的種群密度顯著降低，并且在8～12 h 內(nèi)保持穩(wěn)定在低水平，通過RT-qPCR檢測共培養(yǎng)時某些毒力基因和luxS基因的表達均顯著下調(diào)，而與群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)相關(guān)的luxS基因的表達下調(diào)可能意味著嗜水氣單胞菌SC2005的毒力表達與其群體感應(yīng)有關(guān)[32]。對于是否由抑菌物質(zhì)如細菌素產(chǎn)生抑制效果，在培養(yǎng)過程中還需排除由H2O2含量、pH值等變化產(chǎn)生的抑制。Meidong等用菌落重疊法初步篩選可抑制嗜水氣單胞菌FW52和無乳鏈球菌F3s的菌株，將發(fā)酵濾液中和至pH值為7.0并進行過氧化氫酶處理，然后通過瓊脂孔擴散試驗對指示性魚病原菌進行抗菌評價[33]。

張皎皎等初篩采用點噴法，復(fù)篩采用牛津杯法從草魚養(yǎng)殖池塘的水樣及底泥樣品篩選得到1株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，以1億CFU/mL嗜水氣單胞菌為指示菌，其抑菌圈直徑可達21.8 mm[34]。蔣啟歡等從銀鯽腸道篩選出1株芽孢桿菌屬菌株YJ-9，其對嗜水氣單胞菌的抑菌圈可達15 mm[35]。劉亞楠等從團頭魴腸道中分離得到1株解淀粉芽孢桿菌，對病原性嗜水氣單胞菌43的抑菌圈直徑為 13 mm[36]。Zhou等從江蘇南黃海沿岸沉積物中篩選出1株對嗜水氣單胞菌YJ-1有抗性的芽孢桿菌屬菌株YB 1701，在指示菌終濃度為10萬CFU/mL時，抑菌圈達到12.0 mm，該菌不僅能抑制嗜水氣單胞菌，同時對副溶血性弧菌DX-1表現(xiàn)出強耐酸和高濃度膽汁[12]。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，南極真菌B-7對3種病原菌（嗜水氣單胞菌ATCC7966、無乳鏈球菌、副溶血弧菌）均有抑制作用，其對嗜水氣單胞菌抑菌圈達19 mm[26]。張德鋒等篩選出的貝萊斯芽孢桿菌能有效抑制包括嗜水氣單胞菌在內(nèi)的多種病原菌的生長[37]。以上報道中對嗜水氣單胞菌的抑菌圈最大能達到21.8 mm，最小不低于11 mm。早期微生物拮抗菌的篩選中通常只針對一種病原菌篩選單抗微生物抑制劑，近期研究中越來越多的拮抗菌篩選目標將針對多種水產(chǎn)病原微生物都有抑菌活性，一般還包括無乳鏈球菌、副溶血弧菌、愛德華氏菌、點狀氣單胞菌等，這就需要在篩選中權(quán)衡找出滿足試驗需要的菌株。通過比較體外拮抗試驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，篩選的試驗條件并不一致，所用指示菌菌株、指示菌的濃度、所選培養(yǎng)基不盡相同，所以無法直接根據(jù)抑菌圈大小比較不同研究中的拮抗菌的抑菌能力，只能以此方法作為篩選的初步試驗。

3 拮抗機制研究

病原菌的數(shù)量、毒力（致病力）和侵入門徑是決定侵染宿主結(jié)果的主要因素[38]，其作用方式有很多，主要作用機制包括產(chǎn)生消化酶、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、產(chǎn)生免疫刺激、競爭黏附位點[7]、群體感應(yīng)的干擾[39]等。目前對病原微生物產(chǎn)生拮抗作用的拮抗菌大都具有以下特征：（1）在體外試驗中能產(chǎn)生抑制或殺滅病原菌的成分，如廣譜性的抑菌物質(zhì)細菌素、有機酸、過氧化氫等;（2）和病原菌產(chǎn)生生態(tài)位競爭或營養(yǎng)競爭，如腸道黏附位點競爭、鐵離子競爭等;（3）分泌群體猝滅酶干擾病原菌群體感應(yīng)，如對宿主的侵染和定植、毒力因子的表達、逃避宿主防御系統(tǒng)等;（4）刺激宿主的免疫功能和抗氧化功能抵抗病原菌，主要檢測手段包括宿主各項免疫指標和抗氧化指標的測定，包括血清總蛋白、白蛋白和球蛋白水平，替代補體通路活性，細胞因子表達，以及吞噬活性、溶菌酶活性、抗氧化酶活性、丙二醛含量等。

3.1 產(chǎn)生抑菌物質(zhì)

微生物可以直接產(chǎn)生具有抑制周圍細菌生長能力的代謝物質(zhì)，這種抑制可以是特異性的，也可以是非特異性的。特異性抑制代謝物是由細菌產(chǎn)生的目標特異性的抗菌肽，根據(jù)合成途徑可分為核糖體[細菌素（bacteriocins）]和非核糖體[非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPS）]，殺死細菌的能力取決于它們與細菌膜和細胞壁的相互作用，部分取決于膜或細胞壁的組成，從而誘導(dǎo)細胞的凋亡。非特異性抑制物如過氧化氫具有對細菌細胞及其分子結(jié)構(gòu)的氧化作用介導(dǎo)的抗菌特性，乳酸和其他有機酸的作用是以未離解的形式穿過脂質(zhì)膜并隨后在pH值為中性時解離，從而產(chǎn)生導(dǎo)致細胞應(yīng)激的離子[40]。乳酸是由乳酸菌的碳水化合物代謝產(chǎn)生，而另一些短鏈脂肪酸如甲酸、乙酸、丙酸和丁酸，是由細菌發(fā)酵淀粉、膳食纖維、糖、蛋白質(zhì)和氨基酸產(chǎn)生的，其抗菌活性是由環(huán)境的酸化導(dǎo)致[41-42]。

上文介紹了關(guān)于有拮抗性能拮抗菌的傳統(tǒng)篩選方法，這些方法應(yīng)用較為廣泛，其缺點在于操作繁瑣、工作量大，體外培養(yǎng)條件的局限性會影響抗菌素的生物合成。利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)手段可以從細菌基因組中鑒定出新的細菌素、聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）和NRPS基因簇[43]，而新近開發(fā)的微生物質(zhì)譜分子網(wǎng)絡(luò)將肽基因組信息與其表型信息結(jié)合起來方便了抗菌素的篩選鑒定（例如Pub-Chem和AntiMarin）[44-45]。有研究顯示，革蘭氏陽性細菌枯草芽孢桿菌模式株有4%～5%的基因簇用于抗菌素的生產(chǎn)[46]。Walsh等對人類微生物基因組數(shù)據(jù)庫進行了分析，在不同的系統(tǒng)中鑒定了74個細菌素編碼基因簇[47]。

針對魚類嗜水氣單胞菌拮抗菌的研究較為廣泛，但大多停留于初步篩選有抑制活性的菌株，以及拮抗菌是否產(chǎn)生抑制活性物質(zhì)的分析，少部分從拮抗菌中分離純化出抗菌活性物質(zhì)。Chen等研究了從羅非魚養(yǎng)殖池中分離出的Paenibacillus ehimensis NPUST1菌株，該菌具有針對嗜水氣單胞菌的細菌素樣活性針對抗菌活性物質(zhì)peocin，粗提取物的理化性質(zhì)顯示出低pH值和高耐熱性[48]，之后用純化的peocin處理經(jīng)嗜水氣單胞菌感染的斑馬魚，能顯著提高其存活率[49]。楊麗莉等的試驗表明，枯草芽孢桿菌fmbJ抗菌脂肽對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度為20 μg/mL，最小殺菌濃度為 32 μg/mL，還發(fā)現(xiàn)該抗菌脂肽能夠?qū)е率人畾鈫伟毎谌笔?、鞭毛散失、細胞膜通透性增加，使細胞?nèi)一些離子和大分子蛋白質(zhì)、核酸泄露到胞外[50]。曹海鵬對抗嗜水氣單胞菌的解淀粉芽孢桿菌G1的抗菌素相關(guān)基因進行研究，發(fā)現(xiàn)僅含有伊枯草菌素合成必需基因，其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與GenBank中芽孢桿菌屬其他細菌的伊枯草菌素、伊枯草菌素A、脂肽類化合物（bacillorin）等抗菌物質(zhì)的氨基酸序列有高度同源性[24]。Yi等發(fā)現(xiàn)的拮抗菌Bacillus velezensis JW含有大量參與抗微生物合成的基因簇，包括4種細菌素、3種PKS和5種NRPS基因簇[51]。合成抗菌活性物質(zhì)的相關(guān)基因的研究對深入探索其生物合成機制具有重要的意義。

一些細菌素為廣譜抗菌活性而另一些則顯示窄譜抗菌活性，前者有可能被用作傳統(tǒng)的治療類抗菌素，而窄譜抗菌素更適合在不改變自然種群的情況下針對特定的有害微生物[52]，有助于維持微生物種群的平衡。相對于傳統(tǒng)的抗生素，細菌素由于它的低毒性、不易產(chǎn)生耐藥性[40]更易為人們所接受，但也不能忽略了病原菌可能會對其產(chǎn)生獲得性耐受性，在應(yīng)用過程中應(yīng)合理、有效地使用[53]。一般說來，革蘭氏陽性菌產(chǎn)生的細菌素對革蘭氏陽性病原體有較好的活性，革蘭氏陰性菌素對革蘭氏陰性病原體的作用效果更好，有的活性可以通過其他物質(zhì)（如乳酸）增強細胞膜滲透性來增強。但用純化的細菌素和生物工程制品可以跨越這一障礙，還可提高其比活性、穩(wěn)定性和宿主范圍等特性。因此可產(chǎn)生抗菌素的拮抗菌不管是直接應(yīng)用還是利用抗菌素的純化或生物工程制品，在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防控中都具有良好的應(yīng)用前景。

3.2 競爭性黏附

黏附是病原體引起腸道感染所必需的，在致病性感染的初始階段拮抗菌的第一效應(yīng)可能是與病原體競爭組織表面的的黏附受體[54]。這種宿主-微生物相互作用可被拮抗菌有效抑制[55]。選擇潛在的拮抗菌菌株的另一個重要標準是與腸道或其他組織表面的黏附能力，該研究假設(shè)一般從微生物在黏液或者組織表面的定植和生長速度來判斷[20，30，56]。黏附可以是非特異性的，也可以是特異性的，包括黏附細菌表面的黏附分子和上皮細胞上的受體分子[57]。通常認為在健康的魚類中，消化道內(nèi)病原體的生長可能會受到土著微生物群落的抑制，與病原體和皮膚黏液分離株相比，從腸道分離出的菌株在魚腸黏附和生長能力更大[30]。因此可首先考慮從魚類腸道篩選可靠的拮抗菌。

通常通過體外檢測拮抗菌和病原菌對腸上皮細胞和黏液的競爭黏附能力選擇和評估拮抗菌。就腸黏液層的黏附性而言，細菌自聚集力、凝聚能力和表面疏水性是評價黏附能力的重要表型特征，可作為選擇潛在拮抗菌的初步標準[58]，同時體外試驗中與黏蛋白的結(jié)合能力也被認為是一個切實可行的篩選方法。Dhanani等利用Caco-2細胞和腸黏液模型和對黏蛋白的黏附能力2種不同方法比較菌株Lactococcus rhamnosus GG和Lactococcus delbrueckii M的體外黏附試驗發(fā)現(xiàn)，這2種菌對黏附腸上皮細胞和黏液的黏附能力試驗不同，在腸上皮細胞黏附試驗中Lact. delbrueckii M比Lact. rhamnosus GG的黏附能力弱，在和黏蛋白黏附試驗中這2種菌的黏附能力卻相似[59-60]，而這與Guo等利用同樣方法獲得的試驗結(jié)論相同。Guo等利用Caco-2細胞（人克隆結(jié)腸腺癌細胞）和草魚腸黏液構(gòu)建體外模型和黏蛋白黏附試驗相比較，發(fā)現(xiàn)4種枯草芽孢桿菌對腸上皮細胞的黏附能力和對黏蛋白的黏附能力不同[61]。因此需要研究的是細菌對不同體外模型的黏附效果，以獲得菌株對腸黏膜層的不同組分和上皮細胞上潛在受體的總體黏附能力的數(shù)據(jù)。檢測菌株的聚集性和疏水性也是體外測定拮抗菌對腸黏膜黏附能力的間接方法[62]。細菌共聚集在宿主腸道中具有相當大的意義，拮抗菌的共聚能力可能干擾病原菌感染宿主的能力并且可以防止病原體的定植[55]。Meidong等通過對Bacillus aerius B81e菌株檢測發(fā)現(xiàn)，其具有較高的自聚集性和疏水性，對嗜水氣單胞菌FW52的有效共聚集為70.5%，同時對黏蛋白結(jié)合率也較高（92.5%），進一步證實了這一點[33]。Caruffo等還利用熒光酵母探索酵母在斑馬魚幼魚中的定植情況，喂食5 d后可在胃腸道發(fā)現(xiàn)熒光酵母[63]。Feng等從鯉魚腸道中分離出的18種乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）菌株中有9種有較高體外免疫調(diào)節(jié)性能，并抑制4種病原菌的生長，其中Q-9和Z-2顯示出最強的黏附能力和抑制病原體與黏蛋白的黏附[64]，說明不同菌株對病原體的黏附抑制能力和拮抗作用方式是不同的。

3.3 群體感應(yīng)淬滅

群體感應(yīng)（QS）是一種微生物之間的交流機制，通過產(chǎn)生、釋放和識別被稱為自誘導(dǎo)物的信號分子來調(diào)控基因的表達和協(xié)調(diào)微生物的群體性行為[65-66]。QS被證明可調(diào)節(jié)促使病原菌發(fā)病的多種表型，如生物膜形成[67-70]、生物發(fā)光[71-74]、毒力因子[69-70，75-76]和集群效應(yīng)[77-78]。密度感應(yīng)淬滅（quorum-quenching，QQ）是通過干擾信號分子的產(chǎn)生、釋放、積累或應(yīng)答從而達到阻抑密度感應(yīng)通路的作用，能夠在不殺死細菌的情況下特異性阻斷致病菌毒力基因的表達，從而有效控制病原菌的致病性。該技術(shù)可降低環(huán)境中的選擇壓力和出現(xiàn)細菌抗藥性的概率，因此密度感應(yīng)淬滅技術(shù)是一種極具開發(fā)前景的細菌性病害的控制手段[79-80]。相關(guān)研究表明，海洋中蘊含著豐富的QQ酶資源，而目前發(fā)現(xiàn)的QQ活性物質(zhì)特別是QQ酶主要來源于陸地微生物。2006年，首次報道了AhyI/AhyR群體感應(yīng)系統(tǒng)與嗜水氣單胞菌毒力因子相關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)（TTSS）和Ⅱ型分泌系統(tǒng)（Act）的關(guān)系[81]。之后有研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌產(chǎn)生AHL類信號分子，通過AhyI/R系統(tǒng)調(diào)控胞外蛋白酶、溶血素等毒力因子的分泌[82]。據(jù)報道嗜水氣單胞菌有3套獨立的QS調(diào)控通路，第1套信號系統(tǒng)受?；呓z氨酸環(huán)內(nèi)酯類化合物（acyl homoserine lactone，AHL）調(diào)控，屬自體誘導(dǎo)物1，即AI-1型;第2套信號系統(tǒng)受呋喃酰硼酸二酯（AI-2）調(diào)控;第3套信號系統(tǒng)是QseB/QseC雙組分調(diào)控系統(tǒng)，受類腎上腺素信號分子（AI-3）調(diào)控[83]。目前根據(jù)碳鏈長度和C3位的取代基不同可將AHL信號分子分為40多種[84]，但這些信號分子都具有相同的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和相似的調(diào)控機制，其中信號分子達到特定的濃度是引發(fā)病原菌表達致病因子的關(guān)鍵[76]，因此降解信號分子、抑制信號分子的積累是阻斷細菌密度感應(yīng)的另一種直接而有效的方式。目前研究主要發(fā)現(xiàn)了3種AHL降解酶：AHL內(nèi)酯酶、AHL?；D(zhuǎn)移酶和AHL氧化還原酶[85]。

QQ菌株的篩選方法有很多種，根據(jù)其不同的篩選原理基本上分為3類：基本培養(yǎng)基唯一碳源篩選法、平板抑制法和檢測反應(yīng)剩余的AHL量[80]。傳統(tǒng)的篩選方法多以平板抑制法為主。湯開浩建立了QQ菌株高通量篩選方法，利用對AHL分子具有高靈敏度的報告菌根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）建立的工程菌株快速鑒定了具強QQ活性的3株菌株，能夠提高斑馬魚抗嗜水氣單胞菌侵染的能力，利用膠內(nèi)QQ活性檢測、蛋白質(zhì)譜檢測以及全基因組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，菌株Muricauda olearia Th120的5個蛋白具AHL降解活性，QQ酶MomL代表一類新型海洋AHL內(nèi)酯酶，其同源蛋白可能普遍存在于海洋黃桿菌科細菌中[80]。何夙旭等采用HPLC-MS/MS技術(shù)，在質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式下，可在μg級別濃度范圍快速、定性和定量分析嗜水氣單胞菌產(chǎn)生的信號分子，將嗜水氣單胞菌NJ-1與芽孢桿菌R1共培養(yǎng)時，NJ-1的生長并未受到R1的抑制，絲氨酸蛋白酶ser、腸毒素act、溶血素hem、氣溶素aer等毒力基因的表達水平均顯著下降[83]。Chu等研究了產(chǎn)QQ酶拮抗菌對魚體內(nèi)微生物群落的影響及其和潛在病原菌嗜水氣單胞菌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)從健康鯽魚的腸道中分離出來芽孢桿菌QSI-1可抑制嗜水氣單胞菌YJ-1中的AHL，從而抑制AHL誘導(dǎo)紫色色桿菌Chromobacterium violaceum產(chǎn)紫色素，通過抑制毒力因子如胞外蛋白酶、溶血素產(chǎn)生以及生物膜的形成降低嗜水氣單胞菌YJ-1的毒性。通過口服給予群體淬滅拮抗菌QSI-1能夠改變腸道微生物群結(jié)構(gòu)，并可降解AHL降低嗜水氣單胞菌水平，對調(diào)節(jié)腸道微生物群結(jié)構(gòu)有積極作用[75，86]。張美超等通過克隆Ochrobactrum sp.M231來源N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯酶基因aiiO-AIO6并對其進行原核表達，發(fā)現(xiàn)該酶對嗜水氣單胞菌致病基因具有一定的下調(diào)作用，可以降低其致病性毒力因子的表達量[76]。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌來源的N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯酶AiiA-B546可延緩嗜水氣單胞菌ATCC 7966對錦鯉的侵染[87]。林洋等利用傳統(tǒng)方法分離得到了可抑制嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)的乳酸菌菌株SCT-2，掃描電鏡結(jié)果顯示，其代謝粗提物不僅降低了嗜水氣單胞菌生物膜的生成量，而且使其生物膜斷裂[88]。Li等從池塘沉積物中分離出7株可降解AHL菌株，其中2株腸桿菌（Enterobacter sp. f003）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus sp. sw120）含AHL內(nèi)酯酶基因aiiA，并且不產(chǎn)生溶血反應(yīng)[89]。彭孟凡等從淡水環(huán)境中分離出的地衣芽孢桿菌菌株T-1具有群體猝滅功能，含有可編碼AHL內(nèi)酯酶的群體猝滅基因ytnP，通過構(gòu)建重組質(zhì)粒 pEASY-Blunt E1-ytnP表達純化得到的YtnP蛋白可抑制嗜水氣單胞菌生物膜形成，并可顯著下調(diào)細胞腸毒素基因ast、溶血素基因hem、腸毒素基因aerA、彈性蛋白酶基因ahyB等毒力基因的表達，且添加YtnP蛋白后嗜水氣單胞菌對異育銀鯽攻毒試驗顯示，在96 h內(nèi)其累計死亡率由78%降低至27%[90-91]。

從上述該研究可知，目前從各種環(huán)境中已分離出針對嗜水氣單胞菌有AHL降解活性的拮抗菌并獲得相關(guān)酶的基因，通過克隆分析其相應(yīng)的AHL降解酶主要為AHL內(nèi)酯酶。QS的抗細菌病害策略作為一種新型細菌性病害的防治手段，已受到大家越來越多的關(guān)注。通過淬滅密度感應(yīng)以阻斷微生物的群體性行為，此過程不會影響細菌的生存，又可調(diào)控毒力因子的表達。因此密度感應(yīng)淬滅技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)細菌病害防治中的潛力巨大，具有非常開闊的開發(fā)應(yīng)用前景。該些研究為找出可控制嗜水氣單胞菌AHL降解的密度感應(yīng)淬滅拮抗菌、QQ酶和水產(chǎn)養(yǎng)殖中嗜水氣單胞菌病害防控以及拮抗菌的篩選提供了新思路和解決辦法。

3.4 競爭營養(yǎng)物質(zhì)

精養(yǎng)池塘大量的營養(yǎng)輸入勢必改變系統(tǒng)中已有的群落結(jié)構(gòu)，除了功能性環(huán)境微生物群落以外，一些致病菌（特別是條件致病菌）種群規(guī)模有可能快速變大，與養(yǎng)殖生物接觸后，造成細菌性疾病的發(fā)生[92]。拮抗菌產(chǎn)生不同的拮抗策略從而獲得比腸道中其他細菌更多的生態(tài)優(yōu)勢，其中一些是直接競爭，如競爭營養(yǎng)物質(zhì)、積累D-氨基酸、降低氧化還原潛力等[40]。營養(yǎng)物質(zhì)的競爭已被認為是拮抗菌抑制病原菌的機制[11]，但相關(guān)研究顯示的是添加營養(yǎng)物質(zhì)可導(dǎo)致益生菌的促生作用和病原菌的抑制生長作用，并沒有直接證據(jù)證明是由于競爭獲得營養(yǎng)物質(zhì)抑制病原菌還是因益生菌本身發(fā)揮的抑制作用。例如，Yang等研究了日糧中添加維生素C對Cyprinus carpio的影響，發(fā)現(xiàn)腸道中的乳酸桿菌和芽孢桿菌屬水平隨飲食中維生素C的增加而增加，而嗜水氣單胞菌和大腸桿菌的水平隨之降低[93]。Jiang等評估了肌醇對Jian carp腸道菌群的影響，隨著膳食肌醇補充量的增加，腸道乳酸桿菌的種群增加而嗜水氣單胞菌和大腸桿菌下降[94]。

幾乎所有的微生物都需要鐵，鐵載體是一種低分子量且結(jié)構(gòu)多樣的鐵螯合劑，由細菌進化出能從環(huán)境和宿主體內(nèi)攝取鐵的多種復(fù)雜的機制，其生態(tài)學(xué)意義在于它們從環(huán)境中清除必需營養(yǎng)物質(zhì)剝奪競爭者的生存能力[95]。病原菌能夠在宿主組織和體液的高鐵環(huán)境中成功競爭鐵[96]，而可產(chǎn)生鐵載體的無害細菌可用作拮抗菌，與可產(chǎn)生鐵載體的致病性病原菌競爭鐵。鐵載體被認為是嗜水氣單胞菌的毒力因子之一[97]，因此拮抗菌與嗜水氣單胞菌競爭鐵也是拮抗作用的一種機制。可產(chǎn)生鐵載體是假單胞菌屬菌株表現(xiàn)出的最常見的拮抗機制。有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)假單胞菌屬拮抗菌株可產(chǎn)生鐵載體，F(xiàn)uente等的研究結(jié)果[31，98-99]一致，他們發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生鐵載體的假單胞菌菌株有抑制Flavobacterium psychrophilum和Aeromonas hydrophila生長的能力，這表明鐵競爭至少是拮抗菌拮抗作用的一個方面。林洋等的研究表明，8 mg/mL的乳酸菌菌株SCT-2的粗提物可使嗜水氣單胞菌蛋白酶和鐵載體的分泌量分別減少27.18%和22.11%[88]。

3.5 增強機體免疫功能和抗氧化功能

除了對病原菌產(chǎn)生拮抗作用外，拮抗菌對機體細胞免疫的調(diào)節(jié)功能也是評價拮抗菌功能的主要指標，主要考察宿主的非特異性免疫，對魚類檢測指標主要包括呼吸爆發(fā)活性，吞噬活性，血清總蛋白、白蛋白和球蛋白水平，補體C3，血清溶菌酶，白細胞介素（IL）、腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素等細胞因子的[33，51，61，100-101]mRNA表達等。吞噬細胞產(chǎn)生的呼吸爆發(fā)在吞噬作用過程中可以攻擊入侵的病原體，作為魚類細胞免疫機制的重要指標;吞噬活性受吞噬細胞控制，是先天免疫和細胞一線防御的關(guān)鍵部分，在抗體產(chǎn)生之前，炎癥反應(yīng)的早期激活依賴于它;補體是先天免疫反應(yīng)的主要體液成分，在使宿主免疫系統(tǒng)升溫至潛在病原體的入侵及其清除方面發(fā)揮著不可或缺的作用;血清蛋白、白蛋白和球蛋白水平的增加被認為與魚類中較強的先天免疫反應(yīng)有關(guān);溶菌酶是另一種重要的抗菌效應(yīng)機制，通過水解細菌細胞壁導(dǎo)致細胞裂解，也被視為可激活吞噬細胞和補體系統(tǒng)的調(diào)理素[51，101]。魚類細胞因子在發(fā)育和造血過程中起著重要作用，它們將白細胞吸引到感染部位，并激活其抗菌機制以殺死任何入侵者[102]。

大量研究表明，在給魚喂食添加益生菌的飼料后能不同程度地提高機體的免疫能力和對病原菌的抗病力。Meidong等在飼料中添加10萬CFU/g的B. aerius B81e，顯著增加了Pangasius bocourti的生長性能、免疫應(yīng)答和對嗜水氣單胞菌的抗病性[33]。Chi等分離的腸道內(nèi)生菌Aeromonas veronii BA-1和F. sasangense BA-3混入飼料中喂食鯉魚，發(fā)現(xiàn)宿主的多項先天免疫指標數(shù)值顯著增加，血液中3種免疫相關(guān)基因的表達上調(diào)，并可顯著增強嗜水氣單胞菌感染后的抗病力，其細胞外產(chǎn)物也可刺激免疫系統(tǒng)，但使用效果不如有活性的菌類制劑。在其研究中還發(fā)現(xiàn)，益生菌對機體的血清蛋白、白蛋白和球蛋白水平的刺激是短期現(xiàn)象，在投喂7、14 d時，其數(shù)值顯著增加，而喂食后21、28 d時未發(fā)現(xiàn)明顯增加[101]。通過給虹鱒魚口服益生菌發(fā)現(xiàn)，益生菌可刺激細胞例如單核細胞比例的增加，增強吞噬活性[103]。Kumar等的試驗結(jié)果顯示，投喂含有枯草芽孢桿菌的飼料，魚類的粒細胞和單核細胞增加了褶皺，呼吸爆發(fā)活性顯著增加[104]，這證明了用含枯草芽孢桿菌的飼料喂養(yǎng)魚類，會使魚類自身的非特異性免疫增強。Zhang等研究了Lactobacillus delbrueckii對黃河鯉嗜水氣單胞菌的抗病性，發(fā)現(xiàn)鯉魚腸道中的免疫參數(shù)均得到提高，TNF-α、IL-8、IL-1β和NF-κB p65的mRNA水平下調(diào)，IL-10和TGF-β的mRNA水平上調(diào)[105]。這與Devi等喂食Labeo rohita后檢測的免疫指標結(jié)果相似，在經(jīng)人工嗜水氣單胞菌感染后，死亡率僅為10%[106]。Guo等在飼料中添加枯草芽孢桿菌GC-21和GC-22喂食草魚，IL-1β的表達下調(diào)，但 IL-10和TGF-β的表達上調(diào)[61]。該研究與Zhang等的研究結(jié)果[105]類似。Yi等通過喂食添加B. velezensis JW的飼料調(diào)節(jié)宿主的免疫功能，發(fā)現(xiàn) IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10細胞因子的mRNA表達上調(diào)，而IL-12的mRNA表達水平下調(diào)[51]。Feng等研究發(fā)現(xiàn)，在感染嗜水氣單胞菌前，補充乳酸乳球菌組的促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12）表達上調(diào)，而感染后這些細胞因子的陰性組顯著低于陽性組，無論是否感染，Q-8、Q-9和Z-2處理組的抗炎細胞因子（IL-10、TGF-β）的表達均顯著增加[64]。以上研究結(jié)果顯示，喂食添加益生菌的飼料可以顯著提高宿主的非特異性免疫相關(guān)指標，以及對嗜水氣單胞菌的抗病力，有所不同的是，添加不同益生菌可影響不同細胞因子在宿主體內(nèi)的表達水平。不同細胞因子對魚類免疫反應(yīng)作用不同，有研究顯示，促炎細胞因子（如TNF-α和IL-1β）在感染后可介導(dǎo)魚類的炎癥反應(yīng)[107]，而抗炎細胞因子如TGF-β和IL-10則發(fā)揮有效的免疫抑制作用[61]。

同時拮抗菌也可刺激魚的抗氧化防御系統(tǒng)起到協(xié)同抑制的作用。機體受到外源異物刺激后，其血細胞會產(chǎn)生典型的呼吸爆發(fā)現(xiàn)象，同時產(chǎn)生具有殺菌作用的活性氧（ROS）[108]。呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的ROS可以對細菌等外來異物進行殺滅，在抗菌、抗病過程中起著關(guān)鍵作用[109]。因此，產(chǎn)生的大量ROS會引起機體內(nèi)各種抗氧化酶活力的變化，平衡體內(nèi)自由基。其主要檢測指標包括谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、髓過氧化物酶（MPO）、過氧化氫酶（CAT）等。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，用含有 100萬CFU/g Lactobacillus delbrueckii飼料喂養(yǎng)黃河鯉顯示出更高的SOD、CAT、GPX和T-AOC活性，同時丙二醛（MDA）濃度較低[105]。Reyes-Becerril等通過喂食Mycteroperca rosacea幼魚含酵母菌BBS 8339的飼料，發(fā)現(xiàn)其SOD和CAT活性顯著升高[110]。

4 拮抗菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究

4.1 拮抗菌的施用效果評價

目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖中拮抗菌可以通過4種方式添加到宿主或其周圍環(huán)境中：添加至人工飼料中、添加至養(yǎng)殖水體中、浸泡、添加至生物活餌料中。

水體中水產(chǎn)養(yǎng)殖活動對于自然環(huán)境有顯著影響，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，人們對養(yǎng)殖環(huán)境中的細菌組成有更進一步的了解。鄭俠飛通過比對不同研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的養(yǎng)殖環(huán)境中細菌的優(yōu)勢種群在門水平上基本相似，氮、磷的積累以及季節(jié)變化引起的溫度差異是影響水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中細菌群落的重要影響因子，而疾病暴發(fā)也和環(huán)境因子有密切關(guān)系[111]。由于拮抗菌制劑是活菌制品，不同的環(huán)境條件下微生物的生長狀態(tài)和生理活動相差較大，這將直接決定其生產(chǎn)應(yīng)用過程中的作用效果，如芽孢桿菌制劑在pH值和亞硝酸鹽濃度較高的環(huán)境下效果不好。因此在施用過程中對施用環(huán)境須有正確的評估。使用拮抗菌制劑時，菌的活力和數(shù)量會直接影響其效果，施用之前對其活力和數(shù)量的檢測也是必要的。

由于包括溫度、pH值、水活度和氣體組成波動在內(nèi)的各種參數(shù)的變化，腸道微生物群的組成在整個消化道內(nèi)是不均勻的。攝取的菌株需要在胃酸和小腸中存活，對酸性、膽汁、腸液、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K等的耐受性檢測也是篩選拮抗菌的主要標準。在養(yǎng)殖動物腸道、養(yǎng)殖水體中的定植和增殖能力是拮抗菌是否能發(fā)揮效用的另一重要評判標準，拮抗菌進入宿主腸道后數(shù)量會先遞增達到高峰然后遞減，因此拮抗菌制劑須要定期投喂維持其在宿主腸道中形成優(yōu)勢菌群狀態(tài)。拮抗菌在腸道內(nèi)的檢測，目前主要有體外平板培養(yǎng)法、實時熒光定量PCR法、體外構(gòu)建模型法、熒光標記法、無菌動物法等[112]。也有研究表明，拮抗菌生物膜的形成將有益于其在腸道內(nèi)的定植[61]。

魚苗、蝦的免疫系統(tǒng)不如成魚發(fā)達，主要依靠非特異性免疫反應(yīng)來抵抗感染。水產(chǎn)動物在幼體期時其腸道內(nèi)的菌群未完全建立，對疾病的抵抗力也較弱，所以幼體期時使用拮抗菌能使拮抗菌快速形成優(yōu)勢菌群，達到最好的抗病效果[113]。Ring等的研究表明，體外試驗的陽性和陰性都不能預(yù)測體內(nèi)的實際效果[113]，拮抗菌的實際作用需要通過投喂試驗進一步驗證其在體保護率、對腸道菌群的影響、對宿主免疫功能的影響、對宿主生長性能的影響等。在投喂試驗中還要比較拮抗菌在飼料中的添加量保證最優(yōu)的作用效果。Yu等在飼料中添加100～1 000 mg/kg凝結(jié)芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)500 mg/kg添加量能顯著降低異育銀鯽幼魚的進食速率、飼料轉(zhuǎn)化率和血漿丙二醛含量，并能顯著增加體質(zhì)量增加率、蛋白質(zhì)效率比、免疫指標參數(shù)和對嗜水氣單胞菌感染的抵抗力[100]。Mohapatra等比較了多種益生菌復(fù)合投喂方式，發(fā)現(xiàn)投喂枯草芽孢桿菌、乳酸乳球菌、釀酒酵母3種有活性益生菌能顯著提高Labeo rohita魚種的免疫力和嗜水氣單胞菌感染后的存活率[114]。因此，拮抗菌的添加數(shù)量和活性、配伍方式皆對宿主的抗病能力有影響，同時使拮抗菌對機體免疫刺激達到穩(wěn)定水平的時間也有所不同。Chi等研究發(fā)現(xiàn)，在喂食2種腸道原生細菌Aeromonas veronii BA-1和F. sasangense BA-3達7～28 d時，魚的各種免疫指標均有不同程度的增加，血液中3種免疫相關(guān)基因的表達顯著上調(diào)[101]。這些參數(shù)指標的檢測對拮抗菌在漁業(yè)生產(chǎn)中的實際應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

4.2 拮抗菌的安全性評價

在拮抗菌的應(yīng)用中，不僅要考慮拮抗菌對相關(guān)病原菌的拮抗效果，還需要考慮拮抗菌對養(yǎng)殖生物的安全性。因此在將培養(yǎng)物用作拮抗菌之前，必須確認宿主中不存在致病作用。在正?；蛎{迫條件下，應(yīng)用候選拮抗菌進行急性和慢性攻毒試驗，其添加方式可以通過注射、懸液培養(yǎng)、添加在飼料中[21]以檢測對宿主的致病性。體內(nèi)攻毒試驗應(yīng)同時研究其長期影響，以確定拮抗菌對病原菌是如何作用的以及病原菌在體內(nèi)的變化過程。拮抗菌在使用上不僅對魚類是安全的，而且應(yīng)不具備可獲得或可轉(zhuǎn)移抗生素抗性的特性[115]，可依據(jù)美國NCCLS頒布的藥敏試驗要求和標準檢測拮抗菌株對抗菌藥物的敏感特性，排除其攜帶相關(guān)耐藥基因的可能性，確保在應(yīng)用過程中不會傳播耐藥因子。由于水產(chǎn)動物生存在水體中，拮抗菌在使用過程中會首先進入水體，所以拮抗菌對水環(huán)境的安全性也需要充分考慮，需要驗證其對水體中其他生物如藻類的生長是否有影響[116]。而且有的拮抗菌進入宿主腸道中可能會改變宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)，帶來其他安全風險，因此在使用過程中要長期觀察其對宿主體內(nèi)微生物多樣性的影響。

5 結(jié)束語

對以上文獻的回顧表明，拮抗菌在魚類抗嗜水氣單胞菌感染中有顯著效果。對其深入研究還將促進拮抗菌效應(yīng)物的發(fā)現(xiàn)，諸如代謝產(chǎn)物、酶、功能蛋白等，同時拮抗菌拮抗機制的研究也有助于揭示嗜水氣單胞菌對宿主的致病機制。目前拮抗菌與病原菌之間相互作用的分子機制、拮抗菌與宿主之間相互作用的分子機制以及拮抗菌對免疫系統(tǒng)影響的作用方式的研究還非常有限。借助分子生物學(xué)技術(shù)諸如分子克隆、熒光標記、蛋白表達等將大大加快拮抗菌的篩選和相關(guān)功能基因（如細菌素、群體猝滅酶等）的應(yīng)用，以及對拮抗菌在水產(chǎn)動物體內(nèi)的位置及數(shù)量進行實時監(jiān)測及分析。

然而，由于拮抗菌制劑是活菌制品，不同的環(huán)境條件下微生物的生長狀態(tài)和生理活動相差較大，存在易受外界環(huán)境影響、對突發(fā)流行病防治效果不明顯等問題。針對特異性病原菌侵染時拮抗菌應(yīng)用的研究，還需明確拮抗菌針對不同水產(chǎn)動物以及同一水產(chǎn)動物不同生長階段的專用微生物制劑，進一步加強具有更廣譜抑制作用和不同來源的拮抗菌的分離，不斷豐富水生動物拮抗菌資源;應(yīng)同時加強生產(chǎn)和應(yīng)用方面的研究，改善發(fā)酵工藝，保證菌種活性，改進菌種的使用條件，確定拮抗菌在腸道內(nèi)發(fā)揮作用的有效劑量和施用時間、有效的安全性評價體系和方法。

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