徐悅 周明旭 朱純 尹文竹 馬芳 鮑熹 張金秋 盧宇

摘要：細菌脂多糖（LPS）對宿主細胞具有一定的毒性，但經(jīng)修飾后的單磷酸類脂A（MPLA）卻是一種無毒性的高效免疫佐劑。選擇天然O抗原不完全的大腸桿菌J5疫苗株為出發(fā)菌株，利用λ-Red同源重組技術導入外源弗朗西斯菌（Francisella novicida）lpxE基因，缺失大腸桿菌lpxM基因。結果顯示，J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM基因重組株的LPS鱟試劑活性較DH5α和J5原菌顯著降低;對4周齡的ICR小鼠腹腔注射LPS提取物，重組菌和PBS組的小鼠體征及肝臟切片均正常。同時，腹腔注射大腸桿菌J5和DH5α的小鼠被毛凌亂、精神抑郁、肝臟細胞腫大，發(fā)生炎性浸潤，有明顯的毒性反應。以上結果說明，J5重組菌的LPS已經(jīng)區(qū)別于原菌，是低毒性的MPLA產(chǎn)物。上述重組株的成功構建，能為生產(chǎn)廉價的獸用MPLA免疫佐劑奠定工作基礎。

關鍵詞：大腸桿菌;MPLA;Red同源重組;佐劑;疫苗;細菌脂多糖

中圖分類號：S182 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0054-05

細菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）主要由類脂A、核心多糖和O-抗原3部分組成，其中類脂A是LPS的活性中心，其保守的結構可以被宿主細胞表面的Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）識別并引起機體炎癥反應，嚴重時甚至導致機體休克或者死亡，因此LPS又被成為內(nèi)毒素[1]。單磷酸類脂A（monophosphoryl lipid A，MPLA）是類脂A在酶的催化作用下水解失去1-磷酸（或1-焦糖酸）后所形成的一種類脂A的衍生物，幾乎失去了LPS的毒性，但是仍舊能夠誘導機體產(chǎn)生各種免疫活性因子，激活吞噬細胞，MPLA具備一定的免疫佐劑和免疫調(diào)理的作用[2-3]。

大腸桿菌J5（O111：B4）菌株是美國Pfizer公司推出的用于奶牛乳房炎滅活菌苗的疫苗株[4]。它是1株O-抗原不完全的粗糙型（R）突變菌，其LPS只含有結構較為單一的Kdo2-類脂A和核心多糖結構。因J5株暴露的核心抗原具有良好的保守性和天然免疫原性，它作為抗革蘭氏陰性菌感染的疫苗株在奶牛等家畜上被廣泛應用[5-7]?？紤]到J5株的LPS天然缺失O抗原且結構簡單，30多年的疫苗使用情況顯示其安全性可靠，因此本研究選擇J5株作為出發(fā)菌。通過同源重組技術將J5株基因組乳糖操縱子lac的抑制子基因lacI置換為弗朗西斯氏菌屬（Francisella）的lpxE基因，達到常量表達的效果，該基因編碼的磷酸酶可以選擇性地降解存在于類脂A分子C1位上的磷酸基團，使其LPS成為MPLA結構[8]。與此同時，缺失J5株的lpxM基因，使細菌類脂A的分子C3′位無法正常添加十四碳羥基脂肪酸鏈，從而只存在5條?；?，進一步降低LPS對TLR4的激活效率，減少MPLA的毒性[9]。對J5株的LPS進行定向重組改造使其成為可以產(chǎn)低毒性MPLA的工程菌，應用于獸用佐劑的生產(chǎn)中。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與試驗動物

大腸桿菌J5株（O111：B4）、Red重組系統(tǒng)質(zhì)粒pKD3和pCP20由揚州大學朱國強教授惠贈;弗朗西斯菌（F.novicida）基因組DNA由中國農(nóng)業(yè)大學蘇敬良教授惠贈;（20±2） g的清潔級ICR雌鼠購自揚州大學比較醫(yī)學中心。

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

胰蛋白酶（tryptone）、酵母提取物（yeast extract），購自Oxoid公司;瓊脂（agar），購自南京翼飛雪生物科技有限公司;β-半乳糖苷酶（ONPG）、L-阿拉伯糖、氯霉素（Cm）和氨芐青霉素（Amp），均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;DL 2 000 DNA Marker、Ex Taq（10 U/L）、dNTP，均購自TaKaRa公司;DNA膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司;Trans2K plusⅡ DNA Marker、克隆載體pEASY-T1 Simple和感受態(tài)細胞，均購自北京全式金生物技術有限公司;顯色基質(zhì)鱟試劑盒，購于廈門鱟試劑廠。

1.3 低毒性LPS重組株的構建

1.3.1 引物設計 根據(jù)GenBank上發(fā)布的大腸桿菌（Escherichia coli） lacI基因和F.novicida lpxE基因序列，設計3對引物，P1、P2位于E.coli J5株中的lacI基因ORF的上下游外翼，用于擴增檢測lacI基因及其缺失突變株。其后在P1、P2內(nèi)側設計1對同源重組引物P3、P6，其5′端序列與lacI兩翼序列同源，P2的3′端序列與lpxE基因序列同源，P6的3′端序列與cat基因序列同源。依照重疊延伸PCR（SOE-PCR）要求設計P4、P5，其中P4的5′端序列與cat基因序列同源，3′端序列與lpxE基因序列同源。再根據(jù)GenBank上發(fā)布的E.coli lpxM基因序列，設計2對引物，P7、P8位于E.coli J5株中的lpxM基因ORF的上下游外翼，用于擴增檢測lpxM基因及其缺失突變株。另外，在P7、P8內(nèi)側設計1對同源重組引物P9、P10，其5′端序列與lpxM兩翼序列同源，3′端序列與cat基因序列同源。引物由北京擎科生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

1.3.2 Red重組構建J5ΔlacI：：lpxE 為將lpxE基因插入細菌基因組并常量表達，試驗選擇lac操縱子中抑制子lacI基因作為插入位點，利用Red重組技術用lpxE基因置換lacI基因。

PCR反應1以F.novicida基因組為模板，P3、P4為引物，擴增lpxE基因;反應2以質(zhì)粒pKD3為模板，P5、P6為引物，擴增cat基因。反應1和反應2按照常規(guī)PCR的方法進行操作，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后通過DNA膠回收并送北京擎科生物技術有限公司進行測序鑒定。SOE-PCR以反應1和反應2的產(chǎn)物為模板，P3和P6為引物，按照文獻[10]方法，分2輪PCR擴增lpxE-cat重組片段。最后產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收后-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

按照文獻[11]中的方法向已經(jīng)導入pKD46的J5株感受態(tài)細胞中電轉(zhuǎn)lpxE-cat重組片段，通過氯霉素抗性平板篩選1次同源重組菌J5ΔlacI：：lpxE-cat，并進行PCR鑒定。然后向陽性菌種導入編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，通過對Flp位點的識別消除抗性基因，獲得二次重組菌J5ΔlacI：：lpxE，利用P1、P2引物擴增目的片段，送北京擎科生物技術有限公司進行測序鑒定。

1.3.3 Red重組構建J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM 以構建的J5ΔlacI：：lpxE重組株為出發(fā)菌株，繼續(xù)構建lpxM缺失株。以pKD3為模板，P9、P10為引物，按照文獻[11]方法擴增cat基因，DNA膠回收后-20 ℃凍存?zhèn)溆?。重組的具體方法同“1.3.2”節(jié)，分別通過一次重組和二次重組構建J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM重組株，利用P7、P8引物擴增目的片段，送北京擎科生物技術有限公司進行測序鑒定。

1.4 β-半乳糖苷酶試驗檢測lac操縱子的表達

β-半乳糖苷酶試驗參照文獻[12]進行。將J5株和J5△lacI：：lpxE重組株分別接種4 mL于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管，放置在搖床中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)細菌8 h。收集菌液，10 000 r/min離心10 min，取培養(yǎng)上清備用。按照文獻[13]方法，配制0.02 mol/L ONPG底物溶液，過濾除菌，分裝成1 mL/管。分別在每管中加入100 μL的培養(yǎng)上清，另設置1管加入PBS作為空白對照，放置在37 ℃水浴鍋中共孵育6 h，觀察底物溶液顏色變化。

1.5 細菌LPS的提取和純化

細菌LPS的提取和純化按照文獻[14]進行。挑取J5株及重組株至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)過夜，并轉(zhuǎn)接至500 mL細菌培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)8 h。收菌時檢測菌液的吸光度D600 nm。菌液6 000 r/min離心20 min，并以1 ∶ 10比例濃縮。濃縮菌液在-20 ℃下反復凍融3 次;加入溶菌酶（含50 μg/mL），37 ℃水浴60 min。低溫條件下超聲破碎菌體，之后將菌液移至200 mL玻璃瓶中，在68～70 ℃下預加熱，加入新配制的等體積90%苯酚（體積分數(shù)），68～70 ℃下反應30 min，期間每 5 min 搖晃振蕩樣品，使反應充分進行。結束后將混合液轉(zhuǎn)移至離心杯中，并保存于 4 ℃ 過夜。次日 3 000 r/min 離心樣品30 min后取上清，在剩余酚相中加入等體積的ddH2O，重復提取1次，合并2次水相，并移至透析袋中。充分透析去除苯酚后，使用聚乙二醇（PEG 8000）濃縮，使體積至原液的1/5～1/6。將透析袋內(nèi)濃縮液吸出，離心（4 ℃，3 000 r/min，30 min）取上清，即為LPS粗制品。

在LPS粗制品中加入DNase I和Rnase A，37 ℃水浴60 min，然后置于65 ℃下10 min滅活酶。之后5 000 r/min離心10 min，去除沉淀，將上清凍干處理，得到LPS凍干粉。凍干粉稱質(zhì)量，計算得率，并加入滅菌ddH2O復溶，配制成1 mg/mL的LPS純品。

1.6 鱟試劑檢測LPS活性

按照鱟試劑盒說明書的方法配制內(nèi)毒素標準溶液，按比例稀釋1.5倍，獲得LPS待測樣品，根據(jù)說明試驗步驟進行顯色，使用全波長酶標儀測定545 nm波長處的吸光度，根據(jù)讀值結果建立內(nèi)毒素濃度標準曲線，并計算LPS樣品的活性。

1.7 動物試驗檢測LPS毒性

選取20 g ICR雌鼠40只，10只/組進行分組，設置3個試驗組和1個對照組。稀釋1.5倍，獲得J5、J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM和DH5α的LPS提取物至500 μg/mL，試驗組分別腹腔注射不同LPS提取物（劑量5 mg/kg），注射量為200 μL/只，空白對照組注射200 μL PBS。觀測攻毒后小鼠的生理精神狀態(tài)（食欲、飲欲及活動狀況等）和病癥，并在攻毒2 d后剖殺小鼠，取肝臟制作石蠟切片，觀察其組織病理變化從而判定不同LPS提取物的毒性強弱。

2 結果與分析

2.1 J5Δlac I：：lpxEΔlpxM重組株的鑒定

將二次重組菌制備基因組模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增鑒定，對照野生型擴增片段為 1 200 bp，重組菌擴增片段為888 bp（圖1），PCR產(chǎn)物測序結果正確。以P7和P8為引物進行PCR擴增lpxM基因鑒定，對照野生型擴增片段為 1 066 bp，重組菌擴增片段為179 bp（圖2），PCR產(chǎn)物測序結果正確，命名重組菌為J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM。

2.2 β-半乳糖苷酶試驗檢測lac操縱子的表達

由圖3可知，J5野生菌和J5ΔlacI：：lpxE培養(yǎng)上清分別加入底物ONPG孵育后，J5野生菌培養(yǎng)液不變色;J5ΔlacI：：lpxE培養(yǎng)液顯黃色，說明重組株lac操縱子可正常轉(zhuǎn)錄表達，lpxE基因置換lacI成功。

2.3 脂多糖產(chǎn)量比較

J5株及重組株的LPS水溶物均為無色透明液，凍干后為白色粉末狀。根據(jù)LPS凍干產(chǎn)物稱質(zhì)量的結果，計算出得率，見表1。

2.4 內(nèi)毒素活性檢測

鱟試劑中含有能被微量細菌內(nèi)毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，是一種凝固蛋白原，能準確、快速地定性或定量檢測樣品中是否含有細菌內(nèi)毒素[8-9]。根據(jù)定量試劑盒標準品形成的標準曲線的計算公式為Y=0.819 0X+0.305 2，r2=0.990 2。推算測得DH5α的LPS活性為2.3×105 EU/mg，J5原菌的LPS活性為1.7×105 EU/mg，改造菌株J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM的LPS活性為4.3×103 EU/mg。改造菌株J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM的LPS活性較DH5α和J5原菌顯著降低，說明重組菌株改造成功。

2.5 LPS毒性試驗結果

2.5.1 臨床癥狀 通過對小鼠分別依次腹腔注射野生株J5，突變株J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM以及DH5α的LPS，結果發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌J5和DH5α的LPS提取物攻毒組，小鼠被毛凌亂、精神抑郁、有明顯毒性反應;而PBS組和J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM的LPS提取物組的小鼠正常，無任何臨床癥狀。說明經(jīng)改造的突變株J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM的LPS毒性明顯降低。

2.5.2 組織病理變化 對攻毒小鼠的肝臟組織進行病理切片，由圖4可知，DH5α組和J5組的肝臟細胞腫脹，細胞間隙增大，同時出現(xiàn)不同程度的炎性細胞浸潤。相對于DH5α組和J5組，J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM組肝臟細胞與PBS組的肝臟細胞形態(tài)一致，沒有明顯的病理變化，僅發(fā)生局部炎性細胞浸潤。說明改造后的J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM突變株的毒性減弱。

3 結論與討論

細菌LPS會最大程度地激活機體TLR4、Notch[15]通路， 引起細胞毒性反應。已有研究表明，

改變脂肪酸鏈的數(shù)量、長度以及磷酸基團個數(shù)均可降低LPS的毒性，使其發(fā)揮佐劑作用[16]，其中，MPLA作為類脂A的結構變體，是一種免疫效力顯著的佐劑物質(zhì)。其傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法是收獲R型沙門菌突變株R595的LPS，并對其LPS采用酸解、堿解等一系列繁瑣的化學手段脫去磷酸基團及?；湯@得。但該類產(chǎn)物的產(chǎn)率較低，MPLA純度無法保障，存在多種不同的陽離子使其溶解度降低，可能發(fā)生沙門菌污染，生產(chǎn)成本極高。

本研究選用O抗原不完全的大腸桿菌J5疫苗株作為出發(fā)菌，利用λ-Red同源重組技術，從生物合成學的角度對細菌完成基因改造，使細菌直接合成MPLA。其中非常重要的改造位點是導入可以去除磷酸基團的弗朗西斯菌的lpxE基因并保證常量表達，因此筆者所在課題組選擇lac操縱子中常量表達的lacI基因作為重組位點。lacI具備獨立的啟動子，可在非乳糖培養(yǎng)環(huán)境下常量表達，J5野生菌中β-半乳糖苷酶LacZ在抑制子LacI的作用下轉(zhuǎn)錄被阻遏;當lacI基因的ORF被完成置換為lpxE的ORF后，細菌常量表達LpxE而非LacI，原阻遏效應結束，LacZ則開始轉(zhuǎn)錄表達并催化底物ONPG，顯示黃色;同時，常量表達的LpxE也保證了細菌LPS可以被催化轉(zhuǎn)變?yōu)镸PLA結構。

導致腹瀉的野生豬源大腸桿菌LPS的活性可以達到1.21×107 EU/mg，Sigma公司市售的LPS活性約為1×105 EU/mg[17]。而本研究中使用的大腸桿菌J5株由于其自身作為疫苗株的安全性優(yōu)勢，經(jīng)筆者所在課題組測定LPS活性僅1.7×105 EU/mg，顯著低于豬源野生大腸桿菌。但從小鼠的毒性試驗結果可以發(fā)現(xiàn)，J5株的LPS仍然可以引起小鼠包括被毛凌亂、精神抑郁等臨床反應，肝臟組織也存在明顯的病變。相對于J5野生株以及DH5α，經(jīng)改造J5菌株的LPS提取物對小鼠沒有造成明顯的臨床癥狀，且肝臟組織切片也確定沒有明顯病變，說明該改造菌株的MPLA毒性顯著低于原野生株，該改造菌株更安全。

盡管本研究已經(jīng)成功構建了J5ΔlacI：：lpxEΔlpxM重組菌，但是其產(chǎn)生的MPLA的佐劑效力仍有待進一步通過動物免疫試驗驗證和評估。而利用基因重組改造菌株生產(chǎn)并提取MPLA的技術思路，可以直接減少原生產(chǎn)的化學工藝流程中酸解和堿解的步驟，提高產(chǎn)品純度和產(chǎn)率，顯著降低生產(chǎn)成本，從而將廉價、高效的MPLA佐劑應用于獸用疫苗。

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