霞爾巴提·哈布烈提 王蓉蓉 馬東來 張學

1中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院麥庫西克-張孝騫協(xié)和遺傳醫(yī)學中心醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京100005；2中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科100730

Werner 綜合征（WS）為白內(nèi)障-硬皮病-早老綜合征，是由WRN 基因突變引起的常染色體隱性遺傳疾病。臨床表現(xiàn)涉及多系統(tǒng)改變，過早衰老為其特征性表現(xiàn)。WS患者臨床表現(xiàn)多樣，異質(zhì)性較強，誤診率較高。我們報道1例以雙足第1 跖趾關(guān)節(jié)疼痛伴四肢皮膚變硬為主要表現(xiàn)的WS 患者及其WRN基因突變情況。

一、病歷資料

患者男，31歲，未婚。2018年8月來北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科就診?；颊咦杂左w格瘦小，2003年起聲音音調(diào)變細而高伴嘶啞，并逐漸加重，于鄭州大學第一附屬醫(yī)院行纖維（電子）鼻咽喉鏡檢查，顯示雙側(cè)聲帶黏膜光滑、萎縮，活動可，閉合不嚴。2016年體檢時診斷為“白內(nèi)障”，并接受白內(nèi)障摘除術(shù)，否認視物模糊史。2018 年初雙足第1 跖趾關(guān)節(jié)疼痛僵硬，伴雙足活動受限，于河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院行骨密度檢查，示雙手足骨質(zhì)疏松改變，跟腱處有鈣質(zhì)沉積。心臟彩超提示二、三尖瓣及主動脈瓣少量反流，左室舒張功能降低，心律失常（室性早搏），無自覺癥狀。飲食、二便正常。否認家族中其他成員有類似疾病，否認父母為近親結(jié)婚，1 姐和1兄均健康?；颊吒改敢讶ナ?，否認生前存在與其相同的臨床表現(xiàn)。體檢：一般情況可，發(fā)育欠佳，身高163 cm，體重52.5 kg，聲音嘶啞，全身皮膚光滑、發(fā)亮。皮下脂肪萎縮，以四肢為重。面部皮下脂肪萎縮，“小鳥樣”面容不明顯，四肢皮膚變硬，雙側(cè)第1跖趾關(guān)節(jié)外翻。見圖1。擬診：硬皮??；硬皮病相關(guān)綜合征。

二、基因檢測

1.基因組DNA提?。罕狙芯拷?jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會審核批準（015?2015），所有受試者均簽署知情同意書。抽取患者及其哥哥和姐姐外周血各6 ml于乙二胺四乙酸抗凝管中。各取200 μl 外周血，采用QIAGEN 外周血DNA 提取試劑盒（德國QIAGEN公司）提取外周血基因組DNA。同時提取來自北京協(xié)和醫(yī)院體檢中心的200 例健康對照DNA。

2.外周血RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄：取新鮮血250 μl 加入750 μl Trizol試劑，-80 ℃冰箱保存。采用Trizol法提取外周血總RNA，用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司）進行逆轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后的cDNA 置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3. 基因測序：取患者外周血基因組DNA 1 μg 送明碼（上海）生物科技有限公司進行WES 檢測，采用Agilent SureSelect All Human Exome library 系統(tǒng)捕獲目的片段并擴增，通過Illumina Hiseq X測序，并進行數(shù)據(jù)分析和可疑致病位點篩選。針對WES 篩選出來的變異位點設計引物，從USCS 基因數(shù)據(jù)庫（http：//genome.ucsc.edu）獲取基因序列信息，利用Prime3 Input（version 0.4.0，http：//bioinfo.ut.ee/primer3?0.4.0/）在線設計引物，引物序列見表1（WRN?24），對患者及其家人和200例健康對照進行Sanger測序驗證。

4.實時熒光定量PCR 檢測突變外顯子拷貝數(shù)：利用實時熒光定量PCR 檢測患者及其哥哥、姐姐和2 例健康對照外周血基因組DNA中突變所在的外顯子拷貝數(shù)，并對患者姐姐、患者及健康對照外周血RNA 逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 進行定量分析，引物序列見表1。使用Rotor?Gene 6000熒光定量PCR 系統(tǒng)（德國QIAGEN 公司）進行實時熒光定量PCR，反應條件：95°預變性30 s；95° 5 s、60° 10 s、72° 20 s，40 個循環(huán)，并以2-△△Ct表示W(wǎng)RN基因mRNA的相對表達量。

三、結(jié)果

WES 及Sanger 測序顯示，該患者存在1 處純合突變，WRN 基因在第24 號外顯子2 959 位發(fā)生c.2959C>T 突變，造成所編碼的WRN 蛋白在第987 位氨基酸處提前出現(xiàn)終止密碼子?；颊叩母绺绾徒憬憔鶠榇送蛔兊碾s合攜帶者，見圖2。在人群基因組突變頻率數(shù)據(jù)庫ExAC（http：//exac.broadinstitute.org） 及 gnomAD （http：//gnomad ? old.broadinstitute.org）中該突變的發(fā)生頻率分別為0.000 024 76和0.000 025 27，且為HGMD 數(shù)據(jù)庫中收錄的導致WS 的致病突變之一。200 例健康對照未發(fā)現(xiàn)相同突變。根據(jù)ACMG 遺傳變異分類標準分析，該突變位點致病性（http：//wintervar.wglab.org），顯示該變異滿足1 個非常強（PVS1）和1個中等（PM2）、1個支持（PP3）證據(jù)，可認為該變異為致病變異。實時定量PCR 表明，患者突變所在外顯子處基因序列拷貝數(shù)與健康對照一致（圖3），排除基因組在此區(qū)域內(nèi)存在重復或缺失。

針對患者WRN基因mRNA的實時定量PCR顯示，患者的WRN 基因表達量明顯降低，以健康對照基因表達量1.00±0.07 為參照，患者的WRN 基因相對表達量為0.27±0.04；患者姐姐為WRN c.2959C>T（p.R987*）突變雜合攜帶者，WRN 基因相對表達量為0.62±0.03，表明此突變將導致WRN基因mRNA部分降解。

四、討論

本文患者以雙足第1跖趾關(guān)節(jié)疼痛伴四肢皮膚變硬為主訴，逐漸出現(xiàn)身體多系統(tǒng)病變。根據(jù)WS國際注冊網(wǎng)站提供的診斷標準［1］，本例患者臨床表現(xiàn)上包括前3 項主征（白內(nèi)障、典型皮膚病變及身材矮?。饧庸琴|(zhì)疏松和聲音改變2項次征，滿足臨床擬診WS要求，為了明確患者診斷，采用WES測序法對患者基因組DNA進行突變篩查，并鑒定出患者在WRN基因上存在一處純合無義突變，且為文獻報道的導致WS 的致病突變之一［2］。結(jié)合本例臨床與基因檢測結(jié)果，確診為WS。

WRN 基因是WS 唯一已知致病基因，僅以常染色體隱性遺傳方式遺傳［3］。WRN基因編碼的WRN蛋白屬于RecQ型解旋酶家族，包含5個功能結(jié)構(gòu)域［4?9］。曾報道的WRN基因突變類型主要有移碼突變、剪接位點突變、錯義突變以及提前終止密碼突變（premature termination codon，PTC），PTC突變占WRN 所有突變的10%以上［9］，可導致蛋白質(zhì)翻譯終止甚至降解，使其不能在細胞核中發(fā)揮功能［10］。

引物名稱WRN?24 WRN?q?24 WRN?q正向引物（5′→3′）GAAGCAGTTGGCACATTTGA CGCCTAAGATGTCCACAGCAG ATGGCCAAAATGAGACCAACT反向引物（5′→3′）TGAGCTGCAGAGCTGAACAT GCCTTTGCTAAGCTTTCTTCA GCTACCAGACTCGTCTTCTGT退火溫度（℃）59.9 61.0 60.0產(chǎn)物長度（bp）493 140 185

本文WRN c.2959C>T（p.R987*）突變?yōu)楹币娮儺?，是已報道的WRN 基因致病突變之一［2］，也屬于PTC 突變，位于WRN基因第24號外顯子?；颊叻裾J其父母近親婚配，且均已去世，其姐姐與哥哥均為此突變的雜合攜帶者，該突變位點所在區(qū)域的基因組DNA 定量分析結(jié)果排除了患者在此處存在外顯子雜合性缺失的可能，根據(jù)ACMG 遺傳變異分類聯(lián)合標準規(guī)則，該變異為“致病”突變。該PTC 突變造成WRN 蛋白C端NLS區(qū)域缺失，而迄今鑒定出的大部分突變都是因為形成缺乏NLS 區(qū)域的截短蛋白而致病，且通常在WS 患者來源的細胞系中檢測不到這些截短的WRN 蛋白，這也表明截短的蛋白質(zhì)在細胞質(zhì)中不穩(wěn)定并快速降解［11］。而針對WRN 基因mRNA 進行的實時熒光定量PCR 顯示患者WRN基因表達水平較健康對照明顯降低，表明此突變通過無義介導的mRNA 部分降解（nonsense mediated mRNA decay）而致病。由于無法獲得患者父母外周血樣本，我們只能根據(jù)實驗結(jié)果做出以下3 種推測：①患者父母均為此突變的攜帶者，雖3代以內(nèi)非近親，但有可能為同一祖先來源；②父母僅一方為此突變的攜帶者，患者屬于單親源二體（uniparental diosmy），兩條8號染色體在突變所在的部分區(qū)域都來自攜帶者一方；③父母僅一方為此突變攜帶者，而患者在遺傳了帶有突變的一條等位基因的基礎上，在另一條等位基因同一處自發(fā)產(chǎn)生了相同的突變，這種情況極為罕見。

綜上，我們通過WES 檢測到本文患者WRN 基因存在c.2959C>T（p.R987*）突變，實現(xiàn)了疾病的精準診斷。確診后應建議患者定期檢查，防治可能發(fā)生的并發(fā)癥，如糖尿病、早發(fā)動脈硬化以及惡性腫瘤等。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突